卵清白蛋白特异性T细胞克隆的建立及T细胞受体使用情况分析

目的体外建立可长期培养的抗原特异性T细胞系及克隆,并分析其T细胞受体的使用情况.方法用卵清白蛋白(OVA)免疫BALB/c小鼠,取淋巴结细胞在体外用抗原反复刺激建立抗原特异性T细胞系,通过有限稀释法进行克隆,应用锚定PCR方法分析其特异的T细胞受体的应用. 结果建立了H-2d限制的OVA特异性T细胞系,获得了3株特异性较高的T细胞克隆,T细胞系中TCR AV11S4和BV4S1应用频率高,3株T细胞克隆的TCR均为AV5S2和BV2S1,这些T细胞所使用的TCR α链和β链在CDR3区有明显的共性.结论获得了卵清白蛋白特异的T细胞系和克隆,且其T细胞受体的应用有一定的限制性.

白细胞介素-5增强嗜酸性粒细胞呈递抗原的能力

我们以前曾证实嗜酸性粒细胞(EOS)经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激后可以表达Ⅱ类主要组织相容性复合体基因所编码的蛋白分子(如人EOS的HLA-DR)[1]以及协同刺激分子如B7-1 (CE90)和B7-2 (CD86)等[2],并因此成为抗原呈递细胞,能够将抗原呈递给T细胞从而促使后者进行增殖.本研究的目的是探讨TH2淋巴细胞产生的白细胞介素-5(IL-5)能否增强EOS将抗原呈递给自体T淋巴细胞的能力.

白细胞介素-18对支气管哮喘小鼠气道炎症和核转录因子κB的作用

目的探讨白细胞介素-18(IL-18)对支气管哮喘(哮喘)小鼠气道炎症及核转录因子κB(NF-κB)的影响.1、22d腹腔注射生理盐水(0.1ml)和IL-18 法 BALB/c小鼠随机分为正常对照组(A组,10只)、哮喘模型组(B组,10只)、IL-18注射组(C组,10只).B组和C组用经紫外线灭活的呼吸道合胞病毒(RSV)激发法建立小鼠哮喘模型,分别于1、2、7、8、9、2 (1μg).第23天用HE染色切片观察动物气道炎症细胞的改变,用免疫组化和蛋白质定量分析法(Western blot)测定肺组织中NF-κB的活性. 结果 B组小鼠哮喘发作症状明显,C组小鼠仅表现为轻度哮喘发作症状,A组小鼠无症状.A组支气管粘膜下未见嗜酸性粒细胞(EOS)和浆细胞,B组支气管粘膜下可见EOS[15±3(平均每视野计数,下同)]和浆细胞(10±2),C组支气管粘膜下EOS(6±2)和浆细胞(2±1)较B组减少(P＜0.05).肺组织冰冻切片免疫组化染色发现:B组NF-κB核表达强,C组表达较弱,A组无表达.NF-κB 的抑制蛋白(IκB)的Western blot定量分析发现:A组、C组的IκB含量分别是B组的3.5和2.5倍,即说明B组NF-κB的含量明显高于其他两组.结论 IL-18对支气管哮喘气道炎症有抑制作用,其机制之一可能与IL-18抑制了支气管哮喘小鼠肺组织中NF-κB的活性有关.

人B7-2(CD86) IgV+C段高效原核表达及活性测定

目的克隆、表达B7-2(IgV+C)并进行体外功能测定.方法用聚合酶链反应(PCR)技术从B7-2 cDNA中克隆B7-2(IgV+C),在此基础上构建表达B7-2(IgV+C)的原核表达载体pGEX-4T-3/hB7-2(IgV+C);SDS-PAGE检测蛋白表达,蛋白经变性、复性后在体外协同抗CD3单抗刺激人T细胞,3H-TdR掺入法检测T细胞的活化程度.结果在原核表达载体中成功地克隆了B7-2(IgV+C),SDS-PAGE表明在相对分子质量(Mr)55×103处有hB7-2(IgV+C)/GST融合蛋白的高效表达,其表达量占菌体总蛋白的33%.体外实验证明,此融合蛋白可协同抗CD3单抗刺激人T细胞活化.结论重组蛋白B7-2(IgV+C)在第一信号存在下可活化T细胞,即具有共刺激活性.

抗CD4人-鼠嵌合抗体的表达和抗增殖效应

目的制备抗CD4人-鼠嵌合抗体.方法从分泌抗CD4单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出VH和VL的DNA片段,对VH和VL进行DNA序列测定和分析,证实VH和VL具有小鼠Ig可变区完整的结构功能后,将VH亚克隆至重链表达载体pγ1-Expr,VL亚克隆至轻链表达载体pκ-Expr,转化XL2-Blue细菌,通过菌落或质粒PCR筛选阳性克隆.通过电转染将VH-pγ1、VL-pκ共转染至小鼠骨髓瘤细胞X63Ag8.653,通过G418筛选、ELISA和免疫荧光鉴定.结果得到分泌抗CD4人-鼠嵌合抗体的阳性转染瘤细胞克隆.所得到的嵌合抗体在体外对PHA和IL-2诱导的PBMC增殖具有抑制作用.结论人-鼠嵌合抗体得到成功表达,并有可能作为免疫抑制剂应用于抗移植排斥和自身免疫疾病的治疗.

狼疮样小鼠IL-6、IL-10水平和抗DNA抗体动态变化

系统性红斑狼疮(SLE)是典型的自身免疫复合性疾病,我们以SLE模型之一的慢性移植物抗宿主病(cGVHD)小鼠为对象,以探讨TH2细胞因子动态变化与肾脏病变之间的关系.

野菊花等中草药对71株解脲脲原体体外抑菌研究

解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,Uu)不仅引起男女泌尿生殖道感染,也是男性不育及不良妊娠重要原因.由于Uu没有细胞壁结构,不被青霉素类药物所抑制.本文采用琼脂稀释法测定野菊花、白花蛇舌草、复方金钱草等中草药对71株Uu抑菌作用,为中草药应用Uu临床治疗提供实验依据.

幽门螺杆菌全长cagA基因和霍乱毒素B亚单位基因的克隆与表达

目的构建表达幽门螺杆菌(Hp)细胞毒素相关蛋白(CagA)及粘膜免疫佐剂霍乱毒素B亚单位(CTB)的重组质粒,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白.方法用PCR方法从幽门螺杆菌扩增CagA基因片段,从霍乱弧菌扩增CTB基因片段,将它们转入原核载体质粒pGEMEX-1,在大肠杆菌DH5α中克隆,并在JM109DE3中表达.结果重组质粒pGEMEX-CTB的全长序列经分析与GenBank公布的序列相符;各表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符;重组蛋白经Western blot检测有较强的抗原性.结论基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于幽门螺杆菌疫苗的研制及检测试剂盒的制备.

西藏地区鼠疫菌生物学特性的分析

目的通过对西藏地区29个县(市),不同宿主分离的116株鼠疫菌生化、毒力、毒力因子、质粒及外膜蛋白的分析,了解该疫源地内鼠疫病原体间的群落关系及遗传变异的规律性. 方法各项检查均按常规方法进行.结果目前该地区仅有岗底斯山型和青藏高原型两种生态型菌株,二者分别占据一定的地理区域,以念青唐古拉山脉为天然屏障,从藏北地区分离的菌株为青藏高原型;藏南地区及其西南部所分离的菌株均为岗底斯山型.结论西藏地区是以喜玛拉雅旱獭为主要宿主的鼠疫自然疫源地,就其鼠疫菌生物学特性分析表明,藏北高原疫源地可能是青藏高原喜玛拉雅旱獭疫源地的延伸;而藏南谷地可能是由于有天然屏障的存在,形成了自己特定的地理环境,从而表现为相对独立的一块鼠疫自然疫源地.

cag致病岛缺失的中国幽门螺杆菌突变菌株的构建及鉴定

目的构建cag致病岛缺失的中国幽门螺杆菌(H.pylori)突变株.为cag致病岛功能及H.pylori感染致病多样性机制的研究奠定基础.方法运用基因重组方法将氯霉素抗性基因(CmR)连接到PCR扩增cag致病岛两端区域产生的2个目的基因片段之间,并共同插入到pBluescript SK(-)载体的多克隆位点中,构建出带氯霉素抗性标志的缺失突变载体pBS-cag-mutant,将突变载体转化到含完整cag致病岛基因的突变受体H.pylori菌株中,根据同源重组原理,筛选出cag致病岛缺失的中国H.pylori突变株,并经PCR方法鉴定.结果构建的突变载体经内切酶酶切分析显示:产生的条带与设计结果完全一致.PCR方法扩增cagA、cagⅠ、cagⅡ、尿素酶等基因的结果显示:筛选出的细菌为缺失cag致病岛基因的H.pylori菌株.结论我们成功地构建出1株中国人来源的、cag致病岛缺失的H.pylori突变株,对于阐明cag致病岛功能及其在H.pylori致病中的地位及作用研究具有重要的价值及意义.

生物膜铜绿假单胞菌对小白鼠的致病作用

目前生物膜菌感染的治疗是临床亟待解决的课题,因此对生物膜菌的致病机理需要深入的研究,才能有效的治疗生物膜菌引起的感染.

黄连素和6种抗生素对大肠杆菌O157∶H7中国分离株产生志贺毒素的影响

目的研究黄连素和6种常用抗生素对大肠杆菌O157∶H7中国分离株产生志贺样毒素的影响.方法利用志贺毒素对Vero细胞具有细胞毒性,并可使其释放乳酸脱氢酶(LDH)的原理,使用Vero细胞的细胞毒性检测试剂盒,检测培养基中的LDH的含量.结果将大肠杆菌O157∶H7在环丙沙星、氨苄西林、庆大霉素、链霉素、青霉素、红霉素的亚抑制浓度中培养后,可增加大肠杆菌O157∶H7对Vero细胞的毒性,但不同菌株有差异.环丙沙星对大肠杆菌O157∶H7的小抑制浓度很低,但其对Vero细胞毒性作用,随着药浓度的降低而增高.黄连素在试管内对大肠杆菌O157∶H7没有抑制作用.和抗生素相比,黄连素对大肠杆菌O157∶H7产生和释放志贺毒素比较小.结论黄连素在试管内对大肠杆菌O157∶H7的生长抑制作用不明显,其刺激大肠杆菌O157∶H7产生和释放志贺毒素的作用较抗生素小.

原癌基因c-fos在幽门螺杆菌感染蒙古沙土鼠致胃癌前病变中的表达

从细胞动力学角度探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染与胃癌发生的关系已成为近年的研究热点.我们采用蒙古沙土鼠制备Hp长期感染动物模型,观察与细胞增殖凋亡密切相关的原癌基因c-fos在Hp长期感染动物模型的变化规律,探讨Hp可能的致癌机制.

抗DEN-2基因核酶的克隆及其体外切割活性的研究

目的探索核酶抗登革病毒活性.方法根据DEN-2基因结构的特点,按照锤头状核酶的结构模型和作用模式,设计、合成针对172～174 GUC位点的核酶基因;定向插入质粒pGEM-3Zf(+)的SacⅠ和SalⅠ位点之间;核酶基因克隆和DEN-2靶基因克隆分别进行体外转录,生成核酶和靶RNA,体外进行切割反应.结果核酶与登革病毒靶序列体外产物电泳见预期切割条带.结论该核酶具有切割相应靶RNA的活性,可进一步用于细胞内核酶抗登革病毒的研究.

器官移植术后人类巨细胞病毒感染的诊断

外周血白细胞(WBC)中人类巨细胞病毒(HCMV)抗原的出现称之为抗原血症,我们采用EnvisionTM免疫组化法检测外周血白细胞中HCMV抗原从而诊断HCMV感染,达到了早期、快速的目的,并指导临床合理治疗.研究对象为广州地区122例器官移植术后受者,其中肾移植86例,骨髓移植20例,肝移植12例,脐血造血干细胞移植4例.移植术后2周起,每周采血1次,2ml/次.共采集抗凝外周全血328份.

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过NF-κB、AP-1促进IL-8分泌

目的探讨EB病毒LMP1分子致瘤机制,在已证实鼻咽癌细胞系中LMP1有效激活NF-κB或AP-1的基础上,对LMP1是否通过NF-κB或AP-1促进IL-8分泌进行探讨.方法以稳定表达LMP1及其3种突变体、空白载体的鼻咽癌细胞系[HNE2-LMP1、HNE2-LMP1(1-185)、HNE2-LMP1(1-231)、HNE2-LMP1△187-351和HNE2-pSG5]及antisense-LMP1处理的HNE2-LMP1鼻咽癌细胞系为材料,将IL-8报道质粒瞬时导入这些细胞系中,通过测定luciferase值以反映LMP1是否促进IL-8转录;将mut AP-1/IL-8-luc或IκBα(S32A/S36A)表达质粒导入HNE2-LMP1细胞系中,比较其IL-8报道活性,以确定LMP1是否通过AP-1或NF-κB诱导IL-8转录;利用ELISA方法测定HNE2-LMP1、HNE2-pSG5、antisense-LMP1处理的HNE2-LMP1鼻咽癌细胞系中的IL-8浓度,进一步从蛋白水平上确定LMP1是否促进IL-8分泌.结果与HNE2-pSG5相比,在HNE2-LMP1、HNE2-LMP1△187-351和 HNE2-LMP1(1-231)细胞系中IL-8报道活性分别升高了原来水平的11.5、8.6和3.4倍,而HNE2-LMP1(1-185) 对IL-8报道活性不影响.在HNE2-LMP1细胞系中IL-8蛋白水平提高了17.4倍,而antisense-LMP1则使HNE2-LMP1细胞的IL-8报道活性及蛋白水平分别下降到原来水平的18.3%和9.2%;导入mutAP-1/IL-8-luc或IκBα(S32A/S36A)的HNE2-LMP1细胞中IL-8报道活性分别下降到原有水平39%和26%.结论鼻咽癌细胞系中LMP1可能通过NF-κB,AP-1促进IL-8表达.

四环素基因表达调控系统介导的HBV X基因体外表达细胞株的建立

目的建立稳定、高效的HBxAg体外表达细胞株,以便进一步研究HBV X基因和HBxAg的致癌作用及机理.方法构建带有完整四环素基因关闭(Tet-off)系统的HBV X基因重组表达质粒pBPSTR1-FlagX,用该重组质粒转染NIH 3T3细胞,筛选嘌呤霉素抗性细胞克隆,用抗-FlagM2单抗和兔抗-HBx作蛋白质免疫印迹分析,检测细胞内Flag-HBxAg表达和四环素调控其表达的情况.结果重组质粒pBPSTR1-FlagX转染NIH 3T3细胞后获得30个生长良好的嘌呤霉素抗性细胞克隆.其中12个细胞克隆有Flag-HBxAg的稳定表达,且有5个克隆的Flag-HBxAg表达受四环素调控.当四环素浓度逐渐增高时,细胞内Flag-HBxAg的表达逐渐减弱.四环素浓度达1μg/ml时,Flag-HBxAg表达被完全抑制.结论本研究成功构建了四环素调控系统介导的HBV X基因体外表达细胞株,该细胞株不仅能稳定高水平地表达HBxAg,而且具有定时"开""关"和定量调节HBxAg表达水平的特性,是HBV X基因功能研究的一个有用工具.

HCV高变区合成多肽的抗原性研究

目的通过计算机同源模建,寻找丙型肝炎病毒高变区(HCV HVR1)中保护性多肽抗原表位.方法计算机同源模建,预测多肽的抗原性,然后用淋巴细胞转化的方法验证其抗原性.结果同源模建与实验结果一致,多肽抗原性有待进一步的提高.结论同源模建是一种高效寻找具有保护性抗原多肽的经济快速方法.

多发性硬化患者B淋巴细胞B7-1、B7-2的表达及临床意义

多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)病因及发病机制至今未明,我们选择抗原提呈细胞B淋巴细胞,观察其B7分子表达,探讨MS患者免疫学发病机制.研究对象为45例MS患者,男性23例,女性22例,年龄20～42岁,平均32.5±9.1岁,病程2月～11年,平均病程2.18年,标准:依据Poser诊断标准为临床确诊的MS患者,其中活动期(active MS,AMS)25例,稳定期(stable MS,SMS)20例.

基因差异显示法在器官移植排斥反应预测中的应用

目的用基因差异显示(DDRT-PCR)方法观察器官移植后患者白细胞mRNA表达变化,为建立无创性预测免疫排斥反应指征提供依据.方法对1例心脏移植和1例心脏瓣膜置换术加肾移植患者术后外周血白细胞mRNA表达进行DDRT-PCR分析,并对差异条带进行测序.结果差异分析显示,(1) 在肾移植术中开放动脉后,即有Rab-oncogene、SLAM(signaling lymphocytic activation molecule)、酪氨酸蛋白激酶P59fyn、IAP(inhibits apoptosis protein)-family等基因的表达,于术后72h～5d降低,术后7d表达出现高峰;在术后5d有ZincfingerA基因表达.(2) 心脏移植术后10d,有10条cDNA条带的灰度发生了不规则变化,它们分别为核糖体蛋白、鲨烯合成酶、信号识别颗粒、mRNA识别蛋白、酪氨酸激酶和FK506结合蛋白等基因.结论本实验所得的异常基因表达比临床监测指标变化提前3～5d.应用DDRT-PCR可动态观察白细胞活化过程中早期多个相关基因的变化规律及其因果关系.

肾综合征出血热患者外周血淋巴细胞Fas/FasL表达及与血清sFas/sFasL的相关性研究

目的探讨Fas/FasL系统介导的细胞凋亡在肾综合征出血热(HFRS)致病机理中的作用.方法采用SABC免疫组化法检测HFRS病人外周血淋巴细胞Fas/FasL的表达;采用ELISA法测定HFRS病人血清sFas/sFasL的浓度.结果 HFRS病人发热期、低血压休克期、少尿期及多尿期外周血淋巴细胞Fas的表达明显增强,与正常对照组比较差异有极显著性(P＜0.001);发热期、低血压休克期及少尿期淋巴细胞FasL的表达明显增强,与正常对照组比较差异有极显著性(P＜0.001);HFRS病人各期血清sFas的浓度增高,与正常对照组比较差异有显著性(P＜0.01),其中少尿期sFas的浓度高,与其它各期比较差异有显著性(P＜0.01);发热期与低血压休克期血清sFasL的浓度增高,与其它各期及正常对照组比较差异有显著性(P＜0.01);淋巴细胞Fas及FasL的表达经直线相关分析(r=0.885 5,P＜0.001),呈高度正相关;淋巴细胞FasL的表达与血清sFasL浓度经直线相关分析(r=0.480 3,P＜0.01),呈高度正相关.结论 HFRS的致病过程中存在Fas/FasL介导的细胞凋亡,sFas浓度的高低与机体损害的程度有关;淋巴细胞FasL的高表达及血清sFasL的浓度增高,由此而引起的细胞凋亡是机体清除病毒的主要机制之一.

异质性胞核核糖核蛋白A2基因的克隆、表达、纯化及其临床应用

目的构建含异质性胞核核糖核蛋白A2 (hnRNP A2) cDNA片段的基因克隆,制备并纯化重组蛋白hnRNP A2,用以检测抗hnRNP A2/RA33的抗体.方法从人外周血单个核细胞提取细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增hnRNP A2 cDNA,将其克隆于pUC-T1质粒中,测定其序列.构建高效表达载体pET28a-hnRNP A2,转化大肠杆菌BL21(DE3)plys S并进行诱导表达,将含目的蛋白的组分经金属螯合树脂亲和层析柱进行蛋白纯化.以该纯化蛋白为包被抗原,ELISA方法检测类风湿关节炎(RA) 97例、系统性红斑狼疮(SLE)50例、混合性结缔组织病(MCTD)8例、其他关节炎29例、其他弥漫性结缔组织病(CTD)99例.结果构建hnRNP A2重组表达载体并在大肠杆菌中获得hnRNP A2高效表达;在RA、SLE、MCTD、其他关节炎、其他CTD患者中抗hnRNP A2/RA33抗体阳性率分别为36.8%、24%、75%、3.75%、10.10%;在RA中特异性为86.67%.结论以纯化的基因重组蛋白hnRNP A2为抗原检测hnRNP A2/RA33抗体是早期诊断RA的可靠方法.

再生障碍性贫血患者淋巴细胞表型变化

目的研究再生障碍性贫血(AA)患者骨髓(BM)及外周血(PB)淋巴细胞及其活化相关分子的表达及临床意义.方法采用单色和双色免疫荧光标记法、流式细胞仪分析AA患者的BM和PB中淋巴细胞膜分子的表达.结果 AA患者BM和BP中CD8+细胞增加,CD4/CD8比例下降,BM中CD25+细胞和HLA-DR+细胞增多,急性AA增加尤为显著(P＜0.01),BM中CD16+或CD56+细胞也明显增多(P＜0.05);双标记分析提示T细胞主要为CD8+细胞;急性AA患者CD8+-CD25+细胞显著增多(P＜0.01),AA患者BM中淋巴细胞活化相关分子表达增多,尤其是4-1BB+、CD95L+和CD40L+细胞显著增多(P＜0.01).结论 AA患者BM中淋巴细胞活化相关膜分子增多,是AA免疫功能异常及终导致造血功能衰竭的原因之一.

脑膜炎奈瑟菌ACPS-BOMPC偶联物的免疫原性、安全性和稳定性

目的评价脑膜炎奈瑟菌(Nm)A群荚膜多糖和B群外膜蛋白复合物(ACPS-BOMPC)偶联物的免疫原性、安全性和稳定性.方法通过小鼠和家兔免疫试验、ELISA和杀菌力试验,测定了偶联物的免疫原性和稳定性.通过小鼠和豚鼠毒性试验及热原性试验测定了BOMPC与偶联物的安全性.结果免疫后87.5%的小鼠抗偶联物的抗体滴度达到1∶7240～1∶20480;81.25%小鼠抗偶联物中的ACPS抗体滴度达1∶320以上,偶联后抗ACPS的抗体滴度比未偶联的ACPS的抗体滴度提高了8～128倍.偶联物免疫家兔产生了较高的抗体滴度,5个月未见抗ACPS-BOMPC抗体滴度明显下降;动物实验初步证明偶联物对B群Nm菌株有一定的保护作用;偶联物具有较好的稳定性,对小鼠、豚鼠无毒性.结论所制备的ACPS-BOMPC偶联物具有较好的免疫原性,动物实验安全且稳定,有可能成为一种有效的抗A群和抗B群Nm感染的疫苗.

HIV-1CN54合成gag DNA疫苗鼻内免疫BALB/c小鼠诱发的免疫应答

目前80%的HIV感染是通过粘膜表面(主要是肠道和生殖道)发生的.粘膜免疫保护粘膜表面不感染HIV,除抗体的作用之外,CD8+ CTL细胞应答也发挥重要作用.HIV-1CN54是B′/C重组毒株,中国与欧盟合作以其为代表毒株研制疫苗,以期预防和控制艾滋病.我们以前的研究表明用HIV-1CN54合成gag(syngag)的DNA疫苗进行肌肉注射免疫小鼠诱发比较强的体液和细胞免疫应答,本研究则采用鼻内接种DNA疫苗的方法,观察是否诱发系统和粘膜的免疫应答.

聚乳酸微球对破伤风类毒素疫苗免疫效果的影响

破伤风全程免疫需要连续3次注射疫苗.为减少注射次数,提高接种覆盖率,降低辍种率,开发具有长效作用的单剂破伤风类毒素控释系统是全球儿童疫苗发展计划的主要目标之一.微球作为疫苗载体是近年来免疫学和疫苗研究领域中的一个热点.本文观察了聚乳酸微球对破伤风类毒素疫苗免疫效果的影响.

共表达HIV-1与IL-6核酸疫苗质粒诱导小鼠免疫原性的研究

目前我国AIDS的流行已进入快速增长期,因此应用现代生物技术研制新型AIDS疫苗,改进早期开发疫苗的缺陷,提高其质量是当前的迫切任务.本研究利用分子生物学方法在真核表达载体基础上构建HIV结构基因与细胞因子IL-6基因共表达重组质粒作为核酸疫苗,进行小鼠免疫试验,探讨核酸疫苗对机体细胞免疫反应能力及细胞因子IL-6作为免疫佐剂的效果.

幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB基因融合及表达的研究

目的构建和表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的重组融合蛋白,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究.增出1713bp的ureB基因,并克隆至pFS2.2载体中与ltB基因融合,将ltB-ureB融合基因插入改造后的原核表达载体PinPointTMXa-Ⅱ,并在工程菌E.coli 方法采用PCR技术从幽门螺杆菌染色体DNA中扩JM109中诱导表达.因由2103个碱基组成,为编码701个氨基酸残基的多肽.SDS-PAGE和Western 结果经序列分析,ltB-ureB融合基blot检测发现,融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为75×103,并与幽门螺杆菌感染的阳性血清发生抗原抗体反应,ELISA检测显示,融合蛋白中存在LTB组分.同时发现所表达的融合蛋白无尿素酶活性,但保持与LT受体-神经节苷脂GM1结合的活性.结论 LTB-UreB融合蛋白有可能用于幽门螺杆菌基因工程疫苗的研究.

用噬菌体肽库筛选重组日本血吸虫线粒体相关蛋白的表位

目的筛选和鉴定重组的日本血吸虫(中国大陆株)线粒体相关蛋白rSj338的表位.方法用纯化的rSj338/26GST免疫家兔获得抗rSj338/26GST的多克隆抗体IgG,将抗体进一步纯化,获得抗rSj338单特异多克隆抗体IgG.用纯化抗rSj338抗体对噬菌体12肽库进行5轮免疫学筛选,挑取克隆;采用Western blot免疫识别,核苷酸序列测定分析其获得的表位并与rSj338/26GST进行同源性比较.将获得的不同表位的阳性克隆分别免疫小鼠,并采用Western blot及dot-ELISA方法筛选能刺激小鼠产生较高滴度抗rSj338抗体的阳性克隆.并将阳性噬菌体免疫的小鼠血清对纯化的rSj338/26GST、26GST、日本血吸虫成虫及虫卵抗原进行Western blot识别.结果经5轮免疫学筛选后挑取的32个克隆,用Western blot方法30个克隆能被抗rSj338抗体识别.核苷酸序列分析发现共有11种表位,与rSj338无一级结构的同源性.经动物免疫初步实验筛选,共获得4个免疫原性较强的阳性克隆,其免疫鼠血清均可识别rSj338/26GST、日本血吸虫成虫及虫卵抗原.结论获得了4种日本血吸虫中国大陆株线粒体相关蛋白rSj338的表位,均为模拟表位,这将为日本血吸虫病的疫苗研究开辟新的途径.

EB病毒潜伏膜蛋白2 DNA疫苗的构建及其初步免疫效果观察

目的以EB病毒潜伏膜蛋白2(latent membrane protein 2,LMP2)为靶基因,构建EBV-LMP2的侯选DNA疫苗;并初步探讨其在小鼠体内诱导特异性细胞毒方面的作用,为研制鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)等EB病毒相关肿瘤的治疗性疫苗提供有益资料.方法将EB病毒LMP2全cDNA片段克隆至含CMV早期启动子的真核表达载体pcDNAⅢ上,构建CMV启动子EB病毒LMP2 DNA疫苗.在体外将重组质粒转染COS细胞,以RT-PCR和间接免疫荧光法检测重组质粒在转染的COS细胞中的转录和表达.采用50μg、100μg、200μg 3种质粒剂量进行初步的小鼠免疫试验.结果重组质粒可在真核细胞中有效地转录和表达LMP2.免疫接种小鼠后可诱发机体产生针对LMP2蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫.50μg、100μg、200μg 3种免疫剂量产生的抗体水平差异不大.在免疫接种6周后,重组质粒免疫的小鼠产生针对LMP2的特异性CTL均明显高于空载体免疫小鼠.3种剂量的CTL结果显示:在100μg、200μg免疫组,小鼠诱导产生的CTL水平要略高于50μg免疫组.结论 EB病毒重组质粒LMP2 免疫小鼠可以诱发小鼠产生特异的体液和细胞免疫应答.这些结果为研制鼻咽癌DNA疫苗提供有益的资料.

自制免疫胶体金层析条检测恶性疟原虫的初步研究

目的建立一种简易快速、适合于基层使用的自测式免疫胶体金层析(GICA)法用于恶性疟原虫的检测.方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)单抗2A5,并以另外4株单抗作为包被抗体,制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条,探索佳配对模式及估计低检测量.以镜检和PCR法为对照,用GICA条检测门诊"四热"病人血样,评价其敏感性和特异性,并对其稳定性进行了初步研究.结果 GICA检测重组LDHpf,低检测量为1ng.以镜检法和PCR法为标准,GICA条检测恶性疟原虫的敏感性分别为88.37%和86.67%,GICA与镜检法的符合率均为91.55%.并且当虫体密度＞200个/μl时,GICA的敏感性为100%.GICA条在4℃下可保存3个月以上.结论 GICA检测恶性疟原虫简易快速、灵敏度高,无需特殊仪器设备,有望成为一种恶性疟原虫快速免疫诊断试剂盒.

系统性红斑狼疮患者中TNF的检测

本研究检测系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血TNF-α、β,sTNFR水平以及淋巴细胞TNF-α、β基因的转录变化,从多层面分析SLE患者中TNF系统的变化.TNF-α、TNF-β(也称淋巴毒素α,LTα)的编码基因位于与免疫调节密切相关的MHCⅢ类区.近在该区发现了与TNF基因结构相同的新基因,编码的蛋白(称淋巴毒素β,LTβ)与TNF高度同源,可能在免疫调节中起重要作用[1].我们初步观察了SLE患者中TNF-α、sTNFR 以及LTβ可能的转录变化.

吸烟对大鼠肺和肺泡Ⅱ型上皮细胞间粘附分子1表达的检测

为了解吸烟肺组织和肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)mRNA的表达,我们通过对不同时间吸烟大鼠肺组织和肺泡Ⅱ型上皮细胞ICAM-1蛋白质水平和mRNA水平测定来探讨吸烟致慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病的可能途径.

粘附性NK细胞的制备及免疫学特性初探

目的初步探讨粘附NK细胞的制备方法及免疫学特性.方法首先经淋巴细胞分离液、贴壁粘附及尼龙毛柱粘附对外周血NK细胞进行初步分离,然后联合使用Percoll不连续密度梯度离心法和T细胞Panning法进一步纯化NK细胞,应用流式细胞仪鉴定NK细胞并检测其纯度.rhIL-2(6 000IU/ml)诱导纯化的NK细胞(R-NK)转变为粘附NK(A-NK)细胞,然后利用细胞计数法、MTT法和RT-PCR方法检测A-NK细胞的增殖和杀伤等免疫学特性.结果经过纯化、诱导获得较高纯度、较高活性的A-NK细胞.结论初步建立了利用人外周血NK细胞制备A-NK细胞的方法.

慢性HBV感染者T细胞CD28表达及相关细胞因子的检测分析

目前认为,乙型肝炎病毒(HBV)持续感染与宿主免疫应答低下或形成免疫耐受以及TH1/TH2细胞失衡等密切相关.已知T细胞表面的CD28分子与其配体B7结合,在防止形成免疫耐受方面起重要作用[1];IL-12、IFN-γ和IL-10等对TH1/TH2平衡有调节作用[2,3].我们采用流式细胞术和双抗体夹心法,分别对112例慢性HBV感染者外周血T细胞亚群CD28表达及血清中上述细胞因子水平进行检测并探讨其临床意义.

肾综合征出血热患者血清汉坦病毒基因的PCR-ELISA方法建立

目的建立检测肾综合征出血热(HFRS)患者血清标本中HV基因的PCR-ELISA方法.方法设计并合成互补于HV S基因片段的标记引物,对108例HFRS患者血清进行巢式RT-PCR扩增,并用酶免方法分析扩增产物.结果 108例患者不同病日采集的血清标本的巢式RT-PCR平均检出率仅为62.0%,而PCR-ELISA平均检出率为81.5%.结论 PCR-ELISA用于早期HFRS患者的HV基因检测是一种理想的检测方法.

异体CD3AK细胞对白血病细胞的体外杀伤作用

肿瘤生物治疗是近年来肿瘤治疗中的重要进展之一,有关免疫效应细胞在自体造血干细胞的体外净化中的应用也引起了国内外学者的兴趣.我们观察了CD3AK细胞对残留CML细胞系及原代白血病细胞的体外杀伤作用,以期CD3AK细胞应用于自体移植体外净化.

干扰素调节因子-7对肿瘤细胞生长的影响

干扰素(IFN)调节因子(IFN regulatory factor,IRF)是一组通过与IFN基因中顺式元件结合来调节IFN及其诱导性基因表达的核因子.到目前为止,已发现至少有9种IRF,以IRF-1和IRF-2的研究多.基本明确IRF-1是免疫上调因子,促进IFN-γ表达;IRF-2是免疫负反馈调节因子,抑制IRF-1的过度表达.近年发现,IRF-1直接抑制肿瘤生长,上调MHCⅠ和MHCⅡ的表达.IRF-3也是肿瘤细胞生长的强抑制因子,诱发肿瘤细胞凋亡.IRF-7是1998年发现的另一IRF因子,与IRF-3在氨基酸序列上有多处同源性.报道认为IRF-7类似IRF-1和IRF-3,是多种IFN表达的重要上调因子[1].本文初步探讨IRF-7抑制肿瘤的免疫作用.

重组人Hsp70提呈的H22肝癌细胞混合抗原肽治疗小鼠肿瘤的研究

目的探讨H22肝癌细胞混合抗原肽体内抑制小鼠肿瘤的佳方式. 方法采用冻融、低渗振荡、加热沉淀及酸处理等方法从H22肝癌细胞中制备抗原肽;将接种过H22瘤细胞的小鼠分别给予Hsp70-H22肽复合物注射、复合物+pCH510质粒注射或化疗后给予复合物+质粒注射,观察肿瘤抑制情况. 结果上述方法制备的抗原肽为混合肽,其与Hsp70形成的复合物体内能够抑制小鼠肿瘤生长,并且这种复合物可与pCH510质粒协同完全抑制105接种的瘤细胞形成肿瘤,但不能完全抑制106接种的瘤细胞形成肿瘤,然而这种双因素与化疗进行衔接则可完全抑制106接种的瘤细胞形成肿瘤. 结论 H22肝癌细胞肿瘤混合抗原肽经rhHsp70提呈可诱导H22荷瘤小鼠产生特异性免疫保护作用,与其它因素联合应用可产生更好的治疗效果.

抗幽门螺杆菌牛初乳体外调理杀伤研究

免疫牛初乳是通过接种弱毒性的病原性微生物,刺激母牛机体发生免疫应答而分泌的乳汁,不仅含有高滴度的特异性抗体,还具有许多非抗体功能因子等,免疫乳被证实具有被动免疫保护作用,是目前国内外研究的热点.

全国第一届现代免疫诊断技术学术研讨会征文通知

第二届全国细菌耐药与抗感染化疗药物临床应用学术会议征文通知

全国首次疑难菌株研讨会暨临床微生物学学术研讨会征文通知

CD4+CD25+调节性T细胞研究的意义

以往的免疫学理论认为,实现自身免疫耐受的主要机制是胸腺细胞及前B(pre-B)细胞在中枢免疫器官中的克隆清除(clonal deletion).其次,进入外周的成熟淋巴细胞如果表达针对自身抗原的识别受体(TCR或者BCR),通常被诱导进入免疫无能(anergy)状态而不表现任何自身反应性.另外尚有部分淋巴细胞对自身抗原的免疫忽视(ignorance)也被认为是外周免疫耐受的机制之一.上述三种途径均以"被动"的方式实现自身免疫耐受(recessive tolerance).近年积累的大量实验证据表明,机体可能更主要地是通过CD4+CD25+调节性T(Tr)细胞以"主动"的方式维持自身免疫耐受(dominant tolerance).这一发现将改变我们对自身免疫耐受及免疫调节机制的认识,并将对免疫学基本理论的发展产生重大影响.