人工抗原提呈细胞的制备和应用的研究

目的 制备人工抗原提呈细胞(artificial antigen presenting cell,aAPC)并用它从HLA-A2阳性健康个体外周血单个核细胞(PBMC)中诱导和扩增特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL).方法 将HLA-A2-EBV四聚体分子和抗CD28抗体分子吸附固定在细胞大小的聚苯乙烯乳胶微球(5μm)表面制成aAPC;采用流式细胞仪表型分析;aAPC和HLA-A2阳性个体人外周血单核细胞进行混合淋巴细胞反应;用HLA-A*0201-EBV四聚体染色法检测特异性CTL的频率;应用细胞内细胞因子染色法检测特异性CTL功能性细胞因子IFN-γ的分泌;采用LDH释放法检测特异性CTL的特异杀伤活性.结果 流式细胞仪分析显示微球表面吸附有HLA-A2-EBV四聚体分子和抗CD28抗体分子;四聚体检测及细胞内细胞因子染色法检测与经典细胞毒试验结果一致,结果表明aAPC在体外可诱导抗原特异性CTL的生成.结论 aAPC制备成功,并在体外有效地诱导抗原特异性CTL的生成.

磷脂酰肌醇3激酶对TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞增殖、凋亡和转化生长因子β1表达的影响

目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)对TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)增殖、凋亡和转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响.方法 以肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及PI3-K特异性抑制剂wortmannin作为工具药,分别将TNF-α、TNF-α+wortmannin接种ASMC,置37℃,5%CO2培养箱中培养.逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PI3-Kp85α、TGF-β1 mRNA表达,免疫细胞化学染色法检测PI3-Kp85α、PCNA、Bcl-2蛋白表达及定位,Sandwich ELISA检测NF-κB活性,四甲基偶氮唑蓝(MTT)微量比色法测定ASMC增殖,AnnexinV/PI双标记流式细胞仪分析法检测细胞凋亡,ELISA测定TGF-β1蛋白质含量.结果 (1)培养的ASMC PI3-K p85α的阳性定位在胞浆.TNF-α组ASMC PI3-Kp85α mRNA及蛋白表达水平均显著高于对照组及TNF-α+wortmannin组(P＜0.01);(2)TNF-α组ASMCNF-κB活性与对照组相比显著增高(P＜0.01),TNF-α+wortmannin组NF-κB活性与TNF-α组相比显著降低(P＜0.01);(3)TNF-α组ASMC的增殖反应与对照组及TNF-α+wortmannin组相比显著增加(P＜0.01);TNF-α组细胞凋亡率与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05),TNF-α+wortmannin组细胞凋亡率显著高于TNF-α组及对照组(P＜0.01).(4)TNF-α组ASMC的PCNA、Bcl-2蛋白表达量均显著高于对照组及TNF-α+wortmannin组(P＜0.01);(5)TNF-α组ASMC的TGF-β1的mRNA表达水平、培养液上清TGF-β1的蛋白质含量均显著高于对照组及TNF-α+wortmannin组(P＜0.01).结论 PI3-K可能参与调控TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞的增殖、凋亡及TGF-β1的表达和分泌,NF-κB作为PI3-K的下游信号参与此过程.

4-1BB信号对小鼠树突状细胞表面TLR4表达的调节

目的 探讨4-1BB(CD137)激发型单克隆抗体2A对小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)表面TLR4表达的调节.方法 用不同剂量2A、LPS以及2A与LPS联合,或用LPS预刺激后再加入2A,以流式细胞术检测这些处理因素作用下DC表面TLR4表达情况.结果 LPS可下调DC TLR4的表达,下调作用可维持24 h,而2A可使DC TLR4的表达上调,上调作用可维持12 h,并可拮抗LPS对TLR4的下调作用.用LPS预处理DC后再加入2A,也可拮抗LPS的下调作用.结论 4-1BB信号可以上调DC表面TLR4的表达.

短期运用免疫抑制药物对非去髓异基因骨髓移植方案诱导的混合嵌合体和移植耐受的影响

目的 探讨免疫抑制药物对CTLA4-FasL重组腺病毒和供者骨髓移植联合方案诱导的混合嵌合耐受的影响.方法 将BALB/c(H-2d)小鼠皮肤移植于C57BL/6(H-2b,B6)小鼠,同时经尾静脉给B6小鼠注射BALB/c小鼠骨髓细胞和腺病毒AdCTLA4-FasL,B6小鼠接受皮肤移植术后4周内每天注射环孢素A(CsA)或霉酚酸酯(MMF)或这两种药物同时注射;然后观察移植皮肤存活情况,通过流式细胞仪测定受体外周血Vβ11+的T细胞的水平和供体来源细胞的嵌合水平,通过单向混合淋巴细胞反应了解对供体抗原的耐受状态.结果 在CTLA4-FasL重组腺病毒和供者骨髓移植联合方案诱导的混合嵌合耐受模型中,短期运用免疫抑制药物均促进早期供体骨髓细胞植入,但注射CsA或CsA与MMF联用的受体小鼠在皮肤移植后140 d时混合嵌合降低到很低水平,且单用CsA或CsA与MMF联用的受体小鼠中供体皮肤平均生存时间显著低于不用免疫抑制药物或用MMF的受体小鼠(P＜0.05);皮肤移植后21 d时单用CsA或CsA与MMF联用的受体小鼠Vβ11+的T细胞水平显著高于不用免疫抑制药物或用MMF的受体小鼠(P＜0.05);皮肤移植后150 d时单用CsA或CsA与MMF联用的受体小鼠脾细胞未显示对同种抗原特异性耐受.结论 CsA或含CsA的免疫抑制方案对CTLA4-FasL重组腺病毒和供者骨髓移植联合方案诱导的混合嵌合耐受有抑制作用,其机理可能与早期外周供体特异性T细胞删除减少有关;而MMF与该嵌合耐受方案兼容.

LFn-PSCA融合蛋白的表达和生物活性研究

目的 研究大肠杆菌中表达的炭疽毒素致死因子氨基端与前列腺干细胞抗原(PSCA)融合蛋白的生物活性.方法 分别扩增炭疽毒素致死因子LF(lethal factor)N端254个氨基酸(LFn)的基因片段和PSCA氨基酸29～100的基因片段,将两片段先后克隆进分泌型载体pAS22中,构建成表达质粒pAS-LFn-PSCA,在大肠杆菌中表达,并对融合蛋白进行纯化和活性检测.结果 实现了融合蛋白LFn-PSCA的分泌型表达.纯化后纯度可达90%以上.体外试验显示LFn-PSCA对小鼠巨噬细胞无毒性,并保留了LFn与保护性抗原结合的活性.结论 在大肠杆菌中实现了LFn-PSCA的分泌型表达,为继续进行以炭疽毒素为载体增强机体免疫应答的研究打下基础.

EHEC O157:H7志贺样毒素Ⅱ(Stx2)的克隆表达与活性研究

目的 克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7志贺样毒素Ⅱ(ShigaliketoxinⅡ,Stx2),并鉴定其生物学活性.方法 采用PCR法自EHEC O157:H7基因组扩增志贺样毒素Ⅱ的编码基因stx2,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11c(+)-stx2,经测序鉴定后转化E.col iBL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDS-PAGE、Western blot分析目的蛋白的表达.以EHEC O157:H7野生菌株作对照,通过对HeLa细胞的细胞毒作用及对小鼠攻毒实验,鉴定重组蛋白的生物学活性.结果 扩增的stx2基因约1230bp;原核表达质粒pET-11c(+)-stx2经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli BL21(DE3)中得到表达,蛋白表达率约25%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约72×103;重组蛋白Stx2对HeLa细胞具有细胞毒作用,CD50为35 pg/ml;Stx2对小鼠致死剂量LD100为10μg.结论 成功克隆并表达了Stx2重组蛋白,为探讨O157:H7菌的感染机制及其防治研究奠定了一定的基础.

2000年-2004年杭州地区副溶血弧菌分离株的PFGE和RAPD分型

应用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)及随机放大多态性DNA分析(random amplified polymorphicDNA analysis,RAPD)方法对2000年-2004年在杭州地区分离的03:K6型和O4:K8型致病性副溶血弧菌菌株进行分子分型,探讨近年杭州地区分离的O3:K6型和O4:K8型副溶血弧菌菌株与国际"大流行"O3:K6型菌株间的关系.

肺炎支原体诱导A549细胞胞内TLR2的表达

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是能独立存活的病原微生物,其通过黏附、定植于呼吸道上皮细胞进而引起呼吸道的炎性反应.Mp的感染存在着复杂的免疫学机制,国外近来研究显示,Toll样受体2(TLR2)在启动机体天然免疫系统并介导支原体感染所致的炎性反应中起了重要作用[1].

空肠弯曲菌鞭毛蛋白FlaA的原核表达

空肠弯曲菌(CJ)为常见的人兽共患病原菌,实验表明,CJ的菌体蛋白和LPS抗原均在引起自身免疫反应的神经性疾患的发生过程中具有重要意义.CJ的鞭毛抗原亦有可能参与某些神经性疾患的病理作用导致机体损伤.

广州检出星状病毒4型的全基因组序列测定及分析

目的 探讨广州地区儿童感染的星状病毒基因组分子结构特点和基因型.方法 参考GenBank上的星状病毒基因组设计分段扩增引物,进行RT-PCR分段扩增星状病毒基因组,克隆于T载体上,序列测定,用Clustal W和DNAStar软件分析基因组序列.结果 星状病毒HASTVgz01全基因组为6721 bp,提交到GenBank上的序列号为DQ344027,其中5'端非编码区(5'UTR)长82bp,3'端非编码区末端长81 bp,病毒基因组编码区全长6558个核苷酸,分别编码ORF1a、ORF1b、ORF2,ORF1a基因长2763 bp(83～2845 nt),ORF1b基因长1557bp(2785～4332 nt),其中ORF1a、ORF1b两基因有71个核苷酸的重叠区;ORF2全长2316 nt,位于基因组中4325～6640 nt.ASTVgz01与GenBank中8种基因型星状病毒的ORF2基因氨基酸序列同源性比较发现,HASTVgz01与4型的同源性为93%,其他的同源性在61%～70%之间.结论 广州地区儿童腹泻感染的星状病毒HASTVgz01全基因组为6721bp,GenBank序列号为DQ344027,HASTVgz01与4型星状病毒的ORF2基因氨基酸序列比较同源性为高,确认HASTVgz01是4型星状病毒.

HUT78淋巴细胞感染HIV-1病毒后基因表达变化的研究

人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)攻击的靶细胞有CD4阳性的T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和骨髓树突状细胞.HIV-1感染对宿主细胞的形态、基因表达以及新陈代谢有明显影响[1],并且在mRNA水平和蛋白质水平上改变了宿主细胞的基因表达[2].本文应用基因芯片分析HUT78细胞在HIV-1感染后发生的基因表达变化.

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)糖蛋白gp120部分糖基化位点突变对其抗原性影响

目的 研究HIV-1包膜糖蛋白gp120特定糖基化位点突变后对gp120抗原性的影响,并推测糖基化位点突变对结构的影响.方法 采用连接PCR方法,将获得的野生型gp120中选定N糖基化位点的Asn定点突变为Cln,使该位点去糖基化,构建DNA疫苗,免疫小鼠,ELISA检测鼠血清中的抗体,进行统计学分析,推测糖基化位点突变对gp120抗原性和结构的影响.结果 2组糖基化位点突变的gp120诱发非V3特异性抗体的能力较之野生型gp120有明显提高,但诱发V3特异性抗体能力没有显著提高,7个位点突变的gp120诱发V3特异性抗体能力有很大降低.结论 gp120部分糖基化位点的突变在一定程度上能提高或改变gp120的抗原性,这可能由突变导致的构象变化和/或糖基化寡糖链移除使原来被遮盖的抗原表位暴露引起.

中国HIV-1感染人群中和抗体水平与疾病进展关系研究

目的 研究中国HIV感染者、AIDS患者及疾病长期不进展者(LTNP)HIV-1中和抗体水平,探讨中和抗体对HIV-1感染疾病进程的影响.方法 提取正常人外周血单个核细胞(PBMC),应用HIV-1 SF33毒株进行Single-Round PBMC中和试验,流式细胞仪分析CD4+T细胞内p24-Ag表达.Aleast-squares regression计算中和抗体滴度.结果 HIV感染者、AIDS患者及LTNP中和抗体平均滴度分别为1:29.09、1:22.07、1:154.37.LTNP中和抗体滴度显著高于HIV感染者(t=-2.220,P＜0.05)及AIDS患者(t=-3.812,P＜0.01);HIV感染者与AIDS患者中和抗体滴度差异无统计学意义(t=0.424,P＞0.05).结论 中和抗体水平影响中国HIV感染者疾病进展,高水平中和抗体有利于延缓病情进展.

糖基化异常IgA1自身聚合或与IgG形成的大分子可能与IgA肾病病理表型相关

目的 IgA肾病是常见的原发性肾小球疾病之一,其临床病理表型多种多样.血清中糖基化异常的IgA1及其与其他免疫球蛋白所形成的大分子复合物可能是本病重要的发病原因.本文探讨IgA1大分子复合物的组成和结构特征,及其与IgA肾病不同病理表型之间的关系.方法 制备偶联有去唾液酸IgA1(DesIgA1)和去唾液酸去半乳糖IgA1(DesDeGalIgA1)的琼脂糖亲和层析柱(DesIgA1/Sepharose,DesDeGalIgA1/Sepharose).取10名轻度系膜增生性IgA肾病患者、10名局灶增生硬化性IgA肾病患者及10名正常人血清,分别经DesIgA1/Sepharose和DesDeGalIgA1/Sepharose分离,测定IgA1结合蛋白(IgA1-BP)含量及其中IgA1和IgG浓度,并检测IgA1-BP中IgA1糖基化程度,比较其在IgA肾病不同病理表型间的差别.结果 从两种亲和层析柱上所洗脱的IgA1-BP含量,在不同病理类型IgA肾病患者及正常人间无明显差别.在DesDeGalIgA1/Sepharose上洗脱的IgA1-BP中,两种病理类型IgA肾病患者IgA1唾液酸均严重缺失;在局灶增生硬化性IgA肾病患者中,IgA1分子半乳糖缺失比正常人严重.同时,局灶增生硬化性IgA肾病患者血清中与DesDeGalIgA1/Sepharose结合的IgG的含量显著多于正常人.结论 糖基化缺陷的IgA1自身聚合及与IgG聚合形成的大分子复合物可能与IgA肾病的病理表型相关.

HIV-1高暴露持续血清阴性者对Nef、Gag肽段库的特异性CTL应答的研究

目的 研究中国HIV-1高暴露持续血清阴性(highly exposed persistently seronegative,HEPS)者的Nef、Gag特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)应答特点,探讨HIV-1特异性CTL应答在这类特殊人群中抵抗感染的作用机制.方法 选取10例HIV-1高暴露持续血清阴性者,11例经性接触感染且从未接受抗病毒治疗的HIV/AIDS患者及4例未经暴露的健康志愿者.以覆盖HIV-1 gag全长和部分nef的14个肽段库为刺激原,应用IFN-γ ELISPOT法测定3组人群的特异性CTL应答,并对3组的应答强度、宽度以及对肽段库识别比例进行比较.结果 50%(5/10)的HEPS,100%(11/11)的HIV/AIDS患者均存在Nef及Gag特异性CTL应答,而4例健康对照均为阴性.存在应答的HEPS者对14个肽段库的平均应答强度和宽度分别是HIV/AIDS患者的4.3%和37.7%.在HEPS者中主要识别的肽段库均为HIV/AIDS患者中识别比例相对较低的肽段库.结论 与HIV/AIDS患者相比,HEPS者中的HIV-1特异性CTL应答存在着不同的特点和规律,可能在保护机体免于HIV-1感染中发挥着重要作用.

慢性乙型肝炎后肝硬化与HLAⅡ类抗原等位基因相关性研究

人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)是目前所知复杂的遗传多态性系统,作为个体组织细胞的遗传标志,特别是免疫活性细胞上的HLA具有向抗原特异性T细胞受体传递抗原多肽的生物学特性,HLA分子在抗原识别、免疫应答和免疫调控,破坏外来抗原靶细胞方面起着重要作用.

肺炎球菌荚膜多糖和溶血素结合疫苗的制备及其免疫原性的研究

目的 研制肺炎球菌荚膜多糖(PS)与肺炎球菌溶血素(蛋白)偶联结合疫苗.方法 用PCR扩增肺炎球菌溶血素(Pn)基因,将其克隆入表达载体pET-28a质粒中,然后转化大肠杆菌JM109(DE3)宿主细胞,并以IPTG诱导进行蛋白质表达,对所得蛋白质用固相Ni-NTA树脂作纯化,再用SDS-PAGE鉴定表达的纯化蛋白(rPn).以福尔马林脱毒rPn,去除其溶血活性,然后用氨基还原法将脱毒的rPn与PS(19F血清型)偶联结合,加入铝佐剂制备成疫苗.以该疫苗腹腔注射接种小鼠,用ELISA法检测小鼠血清中抗PS及抗Pn的体水平.结果 成功扩增和克隆了Pn基因,经诱导表达得到rPn蛋白,纯化后纯度达90%以上.PS与Pn结合物经凝胶层析柱分离,其洗脱峰较PS与Pn二峰明显前移.用该结合疫苗免疫的小鼠血清中抗PS(19F)抗体及抗Pn抗体的效价均明显高于阴性对照组(P＜0.01).结论 用基因工程技术制备的肺炎球菌溶血素作为蛋白载体,脱毒后与肺炎球菌多糖偶联而成的结合疫苗能在小鼠体内诱导出明显的免疫应答反应.

重组质粒pcDNA3.1IL-2/Fc对HBV preS2S DNA疫苗免疫作用的影响

目的 探讨IL-2/Fc融合表达后对HBVpreS2S基因疫苗诱导免疫反应的佐剂效应.方法 采用HBV preS2S DNA疫苗作为基础免疫,重组质粒pcDNA3.1IL-2/Fc作为佐剂加强免疫BALB/c小鼠,采用0、2、4周的方案接种,检测各次接种后抗体水平.初次免疫后7周,测定免疫脾细胞的杀伤活性、增殖活性和细胞因子的分泌水平.结果 pcDNA3.1IL-2/Fc作为佐剂在HBV preS2S注射3 d后免疫组小鼠抗体滴度、免疫脾细胞的杀伤活性和增殖活性、TH1型细胞因子的分泌水平,均比各对照组明显增强.结论 IL-2/Fc是有效的HBV preS2S DNA疫苗佐剂之一.

含三联密码AAA的Kozak类似序列特异性增强口蹄疫DNA疫苗的免疫效果

目的 引入6种不同的Kozak类似序列制备口蹄疫DNA疫苗,比较分析Kozak类似序列中不同碱基组成对口蹄疫DNA疫苗表达水平及免疫效果的影响作用.方法 在口蹄疫DNA疫苗抗原编码基因VP1起始位点引入Kozak通用序列及所设计的5种Kozak类似序列(KZ1-KZ6),插入真核表达载体pVAX1,制备口蹄疫DNA疫苗,对6～8周龄BALB/c小鼠进行免疫,用间接ELJSA分析实验动物外周血VP1的抗体滴度;同时插入带有绿色荧光蛋白的融合表达载体pEGFP-N1构建6种体外表达质粒,转染HeLa细胞,进行瞬时表达并分析体外表达水平.结果 引入含三联密码AAA的Kozak类似序列KZ6的疫苗质粒pKV6接种动物后产生的免疫抗体滴度高于其他组;相应的体外表达质粒pKG6转染HeLa细胞后体外表达水平亦高于其他组.结论 含三联密码AAA的Kozak类似序列KZ6的口蹄疫DNA疫苗,能特异性地增强口蹄疫DNA疫苗的表达水平及免疫效果.

幽门螺杆菌Omp11重组蛋白的表达、纯化和抗原活性鉴定

幽门螺杆菌(Hp)外膜(outer membrane)是革兰阴性细菌表面的一种连续性结构,其作为免疫攻击的潜在靶标在人体保护性免疫反应中具有重要的作用.

中华医学会杂志社总编辑游苏宁喜获"韬奋出版新人奖"和中国科协先进工作者荣誉称号

结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药相关基因突变的分子特征

目的 阐明结核分枝杆菌异烟肼(INH)耐药相关基因突变特征.方法 对137株结核分枝杆菌临床分离株(耐异烟肼菌株87株,异烟肼敏感菌株90株)的9个结构基因furA、katG、inhA、kasA、Rv0340、iniB、iniA、iniC和efpA以及两个调控区oxyR-ahpC基因间隔区和mabA-inhA启动子进行DNA片段扩增及序列分析.结果 82株(94.3%)INH耐药分离株的katG基因存在突变,其中katGSer315Thr突变占优势(55.2%).50株INH敏感的分离菌katG的463密码子没有突变.35株(40.2%)INH耐药的分离株katG的463有突变.87株INH耐药株中,20株(23.0%)的katG基因存在两重突变.13株(14.9%)分离菌inhA基因的启动子区存在突变,4.6%的分离菌有inhA结构基因突变,11.5%oxyR-ahpC基因间区存在突变.iniBAC区域和efpA中发现耐药性关联突变.结论 研究证实多个基因突变与异烟肼耐药之间的关系,并且为阐明结核分枝杆菌耐药机制提供线索.

广州地区产ESBL肺炎克雷伯菌SHV型质粒的分子流行病学调查

目的 运用变性高效液相色谱(DHPLC)技术调查广州地区产SHV型β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌各种亚型的流行分布情况,试图建立一种方便快捷的分子诊断及其流行病学监测的新方法.方法 对73份产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)肺炎克雷伯菌进行SHV质粒基因扩增,分别采用变性高效液相色谱(DHPLC)和测序法对扩增产物进行分析,以明确基因类型,并建立各个已知SHV基因亚型的特征性DHPLC图谱库.结果 73株产ESBL的肺炎克雷伯菌中68株确定为SHV基因型,其中62株为已知基因型,分别为SHV-1225株,SHV-1a 14株,SHV-17株,SHV-2a 8株,SHV-28 5株,SHV-2 2株,SHV-26和SHV-33各1株;6株为新的SHV基因型,其中5株获得命名;非SHV型菌株5株,分别为LEN-4型1株,OKP型4株.经过DHPLC分析,全部样本均表现为异常的洗脱峰,各种亚型的异常洗脱峰的形态迥异,其敏感性达100%(68/68),特异性为93.2%(68/73).SHV型质粒基因的突变集中在nt92、nt324～nt402及nt703～nt786这3个区段.结论 SHV-12是广州地区产SHV型β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌主要的基因亚型,高比例基因变异的检出预示本地区即将或已经面临肺炎克雷伯菌新耐药机制的抵抗和流行,因此必须加强对产ESBL肺炎克雷伯菌的分子流行病学监测,及时调整抗菌策略;DHPLC可作为一种快速敏感的筛查方法用于产ESBL肺炎克雷伯菌的分子流行病学监测.

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产生的超广谱β-内酰胺酶和质粒AmpC型β-内酰胺酶的分子流行病学研究

目的 研究北京大学第三医院分离的大肠埃希菌(E.coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,Kpn)中超广谱β-内酰胺酶(ESBL)和质粒AmpC型β-内酰胺酶(p-AmpC)的分子流行病学特征.方法 收集2003年6月至2004年7月无重复临床分离E.coli和Kpn共293株,对其中产ESBL和/或p-AmpC的86株进行研究.采用琼脂稀释法测定抗生素低抑菌浓度;等电聚焦电泳测定β-内酰胺酶等电点;接合实验判断β-内酰胺酶基因位置和移动性;PCR及其产物测序确定基因型;ERIC/BOX-PCR判断菌株克隆性(E.coli菌株分型同时结合种系进化群PCR结果).结果 PGR产物测序结果显示:我院E.coli和Kpn中只产生ESBL、只产生p-AmpC、同时产生两种酶菌株的发生率分别是30.8%(60/195)、17.3%(17/98)、0.5%(1/195)和1.0%(1/98)、0.5%(1/195)、6.0%(6/98);E.coli中ESBL以CTX-M-14型酶为主(70.5%),Kpn中则以CTX-M-3(30.4%)、CTX-M-9(30.4%)、CTX-M-14(21.7%)常见,p-AmpC均为DHA-1型;发现blacrx-M-52(GenBank登录号DQ223685),该基因编码的β-内酰胺酶和CTX-M-3相比有两处点突变(A77V和P167S),导致对头孢他啶的水解活性比头孢噻肟高(临床株相应接合子MICCTX=16 μg/ml,MICCAz≥256 μg/ml).产酶株多数呈多重耐药,对美罗培南敏感.E.coli种系进化群D群以一个克隆株为主,而Kpn则以两个克隆株常见.结论 我院存在分别或同时产生ESBL和p-AmpC酶的E.coli和Kpn,相应常见酶型分别是CTX-M型和DHA型,菌株间呈一定程度的同源性.应对产生两类酶的菌株进行持续的表型监测和深入的机制研究.

多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统的耐药作用

目的 探讨MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统(外排泵)在多重耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用.方法 选取25株外科监护室分离的多重耐药铜绿假单胞菌,用实时定量RTPCR测定结构基因mexA、mexX的mRNA表达水平来判断MexAB-OprM、MexXY-OprM外排泵表达情况;用PCR分别扩增其调控基因mexR、mexZ,并对其产物测序,用Blast软件在GenBank与已知序列比较,研究其过度表达的机理.结果 25株多重耐药铜绿假单胞菌中,14株高表达MexAB-OprM系统(56%),3株高表达MexXY-OprM系统(12%),这3株菌同时高表达2种外排泵.在8株mexA高表达的菌株中,5株菌发生mexR基因突变,出现氨基酸替代,1株mexR提前出现终止密码子,2株菌未发现mexR基因突变.2株mexX高表达的菌株均发生基因mexZ突变,出现氨基酸替代.结论 主动外排系统MexAB-OprM、MexXY-OprM在多重耐药铜绿假单胞菌中过度表达,是此菌多重耐药机制之一;外排泵MexAB-OprM、MexXY-OprM高表达分别与调控基因mexR、mexZ发生变异有关,同时存在其他调控机制.

TraSH技术可确定微生物基因组间功能差异

转座子定点杂交技术(transposon site hybridization,TraSH)是科技进步需要的产物,是近几年来通过对转座子研究的不断深入建立起来的一整套成熟技术.