微小残留病检测方法及其临床应用

尽管目前白血病的诊治水平已显著提高,但复发仍不可避免.近10年来研究认为,患者体内微小残留病(MRD)与白血病复发密切相关.传统形态学检测由于敏感度较低限制了其在MRD检测中的应用.随着分子检测手段的不断改进,尤其是近年来实时定量RT-PCR的出现为MRD检测提供了准确、敏感、快速的手段.大量临床研究已证实,MRD的有无及其高低不但反映了个体对治疗的反应情况,而且与预后非常相关,其在白血病早期复发的预示中有显著作用.MRD检测还能用于评价不同治疗方案的疗效,为寻找佳治疗手段提供了依据.本文对MRD检测方法及其临床应用做一综述,相信随着标准化MRD检测体系的建立必将对白血病复发的预防起重要作用.

恶性血液病血管新生过程中VEGF/R、内皮抑素和基质金属蛋白酶的相互调控探讨

恶性血液病血管新生过程中涉及的一些因子,如血管内皮生长因子/受体系统(VEGF/R)、基质金属蛋白酶(MMP)和内皮抑素等(ES)所起的作用及其相互调控机制一直是学术研究的热点.虽然近年来相关研究发展很快,但仍未能形成系统理论.本文就近年来有关VEGF/R系统的正负调控因素,MMP的调控及其与VBGF/R的相互影响,ES的调控及其与VEGF/R和MMP的相互影响等研究进展作一综述.

RNA干扰是静止基因表达的新方法

RNA干扰(RNAi)是一种封闭基因表达的有效方法,通过小干扰RNA片段(siRNA)启动细胞内的RNAi反应,显著增加对目标mRNA的表达抑制.本文综述了RNAi机理,哺乳动物细胞siRNA靶点选择,以及siRNA载体构建和转染哺乳动物体细胞的研究现状.

血液肿瘤多药耐药的研究进展

化疗是血液肿瘤的主要治疗手段,但目前存在的关键问题是肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药(MDR).这种现象由多种耐药机制导致,包括了如过度表达耐药相关蛋白的生化机制和涉及造血微环境的生理机制等.本文简要回顾了MDR的产生机制和逆转策略方面的研究进展,重点讨论了MDR的检测和结果分析,以及和造血微环境的关系.

C-PG血小板聚集试验在单采血小板捐献者筛查中的应用

本研究探讨以阳离子没食子酸丙酯(C-PG)为激活剂的血小板聚集试验用于单采血小板捐献者筛查的可行性,并调查血小板献血者血小板功能缺陷的发生率.测定不同浓度C-PG诱导的健康献血者的血小板聚集率,以确定C-PG的适应用浓度;检测30名志愿者服用阿司匹林前和服药24小时后的血小板聚集率,以确定血小板功能不良的筛查界点值;检测483例血小板捐献者的C-PG诱导的血小板聚集率,并对聚集功能不良者进行活化血浆凝固时间(APCT)测定.结果表明:血小板聚集率随C-PG浓度的增加而升高,当C-PG浓度达200μmol/L时,血小板聚集率达高;服用阿司匹林24小时后的血小板聚集率与服药前相比,均表现明显减低(P＜0.001),但以C-PG诱导180秒时的血小板聚集率减低显著.血小板功能不良的筛查界点值确定为C-PG诱导180秒时的血小板聚集率小于20%;在483例血小板捐献者中,检出25例有血小板聚集功能不良,其中有11例表现为血小板促凝血活性减低.结论:C-PG诱导的血小板聚集试验能有效的检出血小板功能不良者,适用于血小板捐献者血小板功能的筛选;在血小板献血者中,血小板功能缺陷者的检出率大约为5%.

单管PCR扩增鉴定ABO血型基因型

本研究目的是建立单管PCR扩增鉴定ABO血型基因型的方法.采用盐析法抽提DNA,应用单管PCR扩增结合基因扫描技术对ABO血型的基因型进行鉴定.结果表明:用本方法鉴定出的132例样本的ABO基因型结果与其血清学结果完全符合,A、B、O基因频率分别为0.205、0.159、0.636,其中AA基因型8例(6.1%),AO基因型31例(23.5%),AB基因型7例(5.3%),BB基因型6例(4.5%),BO基因型23例(17.4%),OO基因型57例(43.2%).结论:单管PCR扩增结合基因扫描技术能鉴定ABO血型基因型.

腺苷对血小板体外激活的抑制作用

本研究的目的主要是研究腺苷对血小板的体外激活抑制作用,为血小板冻干前处理过程筛选血小板功能保护剂提供依据.采用流式细胞术(FCM)测定血小板膜表面CD62P和PAC-1的表达,应用APACT-2聚集仪测定瑞斯托菌素(restocetin)、凝血酶(thrombin)、二磷酸腺苷(ADP)和没食子酸(propyl gallate)诱导的血小板聚集率.研究结果表明,冻干预处理后血小板膜表面CD62P表达显著增加,腺苷浓度为0.75 mmoL/L时可抑制CD62P表达,且呈剂量效应;腺苷可抑制没食子酸诱导的血小板聚集反应,但对瑞斯托霉素诱导的血小板聚集无抑制作用,腺苷浓度≥1.0 mmol/L对凝血酶诱导的聚集有显著抑制作用.因此,腺苷可抑制体外处理导致的血小板激活,对瑞斯托霉素和凝血酶诱导血小板聚集反应无明显抑制.结论:腺苷可作为血小板体外激活抑制剂及冻干前处理的功能保护剂.

利用兔模型研究糖基化对冷藏保存人血小板体内生存的影响

利用兔动物模型研究了糖基化对4℃冷藏保存人血小板体内生存的影响.静脉输注棕榈酸乙酯(0.75g/kg)抑制兔网状内皮系统以建立兔动物模型;应用核素标记法检测血小板生存时间;取浓缩人血小板悬液(2×10"/L),添加5g/L的尿嘧啶二磷酸半乳糖(UDG-Gal),置4℃冰箱冷藏保存,尔后测定输入兔模型体内的冷藏人血小板的生存率.结果表明:添加UDG-Gal的人血小板,冷藏保存10天后输入兔模型体内的生存时间显著高于空白对照组(P＜0.01),而与新鲜血小板对照组相近(P＞0.05);输注兔模型体内2小时时的血小板生存率在新鲜血小板对照组、冷藏糖基化血小板组和冷藏空白对照组分别为(68.9±8.5)%、(65.4±8.0)%和(5.0±2.6)%.结论:尿嘧啶二磷酸半乳糖能保护冷藏保存的人血小板,延长冷藏人血小板在兔模型体内的生存时间.

Rhesus盒检测技术

为了研究Rhesus盒的检测技术及意义,根据RHD基因上游盒、下游盒及杂交盒的DNA序列特异性设计引物,用PCR-SSP和错配PCR技术检测上游、下游和杂合的Rhesus盒.结果表明:DNA标准品验证本技术可靠,随机非血统关系RhD阳性者中,RHD+/RHD-型占9.00%,RHD+/RHD+型占91.00%;RhD阴性者中RHD+/RHD-型占26.14%,RHD+/RHD+型占3.92%,RHD-/RHD-型占69.94%.结论:Rhesus盒检测技术可用于分析RhD单倍型基因结构,用于遗传、临床输血及新生儿溶血病等研究.

维生素C对人全血红细胞的抗氧化保护作用

为了研究维生素C(vitamin C)对全血中红细胞的抗氧化保护作用,将维生素C作为血液保存添加剂,加入盛有无偿献血者静脉血的塑料血袋中(含CPA抗凝液),在25℃条件下,以红细胞ATP酶活性,红细胞超氧化物歧化酶(S0D)酶活性,血浆丙二醛(MDA)含量,血浆K+离子含量等作为指标,观察维生素C对全血红细胞保护的抗氧化作用.结果表明:全血中加入维生素C之后,ATP和SOD活性在保存期内均高于对照组,且有显著性差异(P＜0.05,P＜0.01),MDA和血浆R+浓度的动态变化均显著低于对照组(P＜0.05,P＜0.01),超氧化物自由基浓度低于对照组(30%),pH下降速度低于对照组.结论:维生素C对提高红细胞ATP酶活性、超氧化物歧化酶(SOD)酶活性,降低血浆丙二醛(MDA)含量、血浆K+离子含量和血浆中的超氧自由基浓度等方面均有良好的作用.

一例类孟买型表型的分子机理研究

为了研究1例类孟买型的分子机理,在血清学方法初步鉴定先证者为A类孟买型的基础上,用PCR扩增先证者ABO基因第6、7外显子、FUT1基因(H)和FUT2基因(Se)的编码区序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序分析,并应用PCR-SSP和基因扫描方法证实测序所发现的突变.FUT1基因突变通过克隆到质粒载体后测序分析.结果表明:直接测序发现先证者ABO血型基因型为A102A102,FUT1基因第682位A→G错义突变、第547-552位两碱基AG缺失(CAGAGAG→CAGAG)突变.克隆证实1条染色体上FUT1基因为A682G突变,导致M228V氨基酸突变;另一条染色体上第547-552位两碱基AG缺失,导致阅读框架发生移码,提前形成终止密码.FUT2基因为分泌基因Se357和弱分泌基因Se357,385杂合(第357位为T/T纯合,385位为A/T杂合).结论:FUT1基因A682G和547-552 delAG双杂合突变是引起该例先证者表现为类孟买型的分子机理,A682G是一个新的引起类孟买型的FUT1基因突变.

浙江汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性研究

本研究的目的是分析浙江汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因的多态性及基因型.采用序列特异性引物PCR法(PCR-SSP)进行KIR基因低分辨率检测和基因型分析.结果表明:①在浙江汉族人群中共检出目前已知的17个KIR基因.2DL4、3DL2和3DL3基因存在于所有个体,其基因频率为1.00.2DL1、2DL3、2DP1、3DP1*003、3DL1、2DS4*001/002基因较为常见,频率分别为0.902、0.902、0.902、0.902、0.7598、0.5615;而2DL2、2DL5A、2DL5B、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4*003、2DS5、3DS1和3DP1*001/002基因频率较低.②浙江汉族人群中以A型单倍型为主,频率高达74.7%.在检测样本中共明确检出12种单倍型,常见的是单倍型2,频率为53.0%.③共检出26种基因型,常见为AJ(2,2)、AF(1,2)型,其次为AH(2,5)、NN2(2,6)、AI(1,5)和AG(1,1).其中有15种基因型在白人中尚未见报道,4种基因型无法根据相关文献标准分析出单倍型.结论:浙江汉族人群有其独特的KIR基因频率和基因型频率分布.

非清髓性骨髓移植诱导异基因受者小鼠免疫耐受的实验研究

本研究通过非清髓性预处理方案联合髓腔内骨髓移植(IBM-BMT)建立异基因小鼠免疫耐受模型,并探讨其诱导耐受的机理.受鼠为雌性C57BL/6(H-2b,B6)小鼠,于第0天接受60Co γ线全身照射(TBI),4小时内输注雄性BALB/c(H-2d)小鼠来源的骨髓细胞(BMC),2天后腹腔注射环磷酰胺(CTX).通过皮肤移植、混合淋巴细胞反应(MLR)检测耐受状态,并通过体外过继转移实验、IL-2逆转实验等探讨免疫耐受的机制.结果显示,经骨髓移植的B6小鼠对BALB/c小鼠的皮肤移植物平均存活时间(MST)＞150天,较对照组明显延长(P＜0.01);骨髓移植后第90天,受鼠(黑色)表型开始呈现供鼠(白色)颜色特征.MLR结果证明,B6小鼠获得供体特异性耐受,该耐受可以被IL-2逆转且可被过继转移;所有受鼠均未出现GVHD表现.结论:非清髓预处理联合髓腔内骨髓移植可以有效地诱导异基因小鼠免疫耐受,克隆无能、抑制细胞存在及嵌合体产生均参与耐受的形成.

LPS刺激来自人单核细胞的树突状细胞在调节自体CD4+CD25+T细胞活性作用研究

树突状细胞(DC)是现今被认为具潜能的专职抗原呈递细胞.应用不同方法在体内诱导细胞毒T细胞(CTL)来识别肿瘤相关抗原的肿瘤免疫治疗研究已有报告.然而,在体内免疫治疗的有效性可能仅限制在局部或系统抑制CTL产生和功能.为了检测LPS刺激人单核细胞的DC来抑制自体CD4+CD25+T细胞能力,使用HLA-A2限制性p53264-272肽作为肿瘤抗原,用LPS(DC-LPS+)或不用LPS(DC-LPS-)产生的DC分别与自体T细胞共同培养.结果显示:在DC-LPS+活化的T细胞的CD4+CD25+T细胞群比DC-LPS-活化的T细胞要低.这个结果提示,DC-LPS+与CD4+CD25+T细胞群有关联,而且这种特性可能是由于T细胞对肿瘤相关抗原的调节作用.

IFN-γ激活的树突状细胞对患者急性髓性白血病细胞的杀伤作用

为检测干扰素-γ(IFN-γ)激活的外周血树突状细胞(DC)对患者急性髓细胞白血病(AML)细胞的直接杀伤活性并探讨其杀伤机制,分离健康供者外周血单核细胞,用重组粒-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4诱导生成DC.于诱导第7天在合成培养液中加入IFN-γ继续培养12小时,将其激活.从6例初发的急性髓细胞白血病患者外周血分离单个核细胞作为靶细胞,以不同效靶比与DC共同培养18小时,采用51Cr释放试验检测DC激活前后抗肿瘤活性的差异.同时,用流式细胞术检测DC表面共刺激分子,细胞膜及细胞内Fas配体(FasL)、TNF-α及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的改变,以明确IFN-γ激活的DC对肿瘤细胞直接杀伤活性的作用机制.结果表明:IFN-γ可增强DC对AML细胞的杀伤活性,在效靶比为20:1时杀伤率为(33.8±1.6)%,与未加刺激因子前相比有显著差异(P＜0.05);IFN-γ可上调DC表面共刺激分子CD86和CD83的表达;IFN-γ刺激后,DC细胞内TRAIL表达明显增强,但其在细胞表面仍呈现低表达,而细胞内及细胞表面Fas L及TNF-α在IFN-γ刺激前后均无明显变化.结论:IFN-γ激活的DC可有效杀伤患者AML细胞,其作用机制与DC的成熟及TRAIL凋亡途径部分相关,而与Fas L及TNF-α凋亡途径无关.

脐血体外同时诱导扩增T,NK和CD34+细胞

体外研究表明,人脐血含有比骨髓细胞更原始更早期的造血干细胞群.移植后所引起的GVHD发生率及程度都比骨髓及外周血要低,但其相应的GVL效应也较低,容易复发.单份脐血所含有的造血细胞量仅可以满足一定体重以下的儿童患者需求,对需移植的大部分成人患者则要进行体外扩增.脐血体外扩增后进行干细胞移植是一种新的设想和尝试,移植物中免疫细胞的组成和功能是决定干细胞移植能否成功重建造血与免疫、以及平衡GVHD和GVL的重要因素.为了研究脐血体外同时诱导扩增T、NK和CD34+细胞的可能性,本实验无菌采集健康正常足月产新生儿脐血,并分离出单个核细胞,在不同的细胞因子组合作用下用IMDM培养液培养14天.在培养0、3、7、14天时收集细胞,用FCM分析扩增前后脐血干/祖细胞及T、NK免疫细胞含量.结果表明,与无细胞因子的对照组相比,所有细胞因子SCF,IL-3,IL-6,IL-7,IL-2组合组别均能显著扩增脐血中的单个核细胞.所有细胞因子组合组别均能显著增加脐血中的CD34+细胞比例,使其含量从新鲜脐血中的1.6%升高到高D组的11.9%.第7天时CD34+细胞平均增加10至50倍不等.新鲜脐血中CD3+T细胞平均为(18.7±4.3)%,在无细胞因子的对照组中CD3+T细胞下降明显,而在含细胞因子的组别中CD3+T有不同程度的增加,扩增高的组别中CD3+T细胞是新鲜脐血的2倍.在新鲜脐血中含(3.6±1.9)%CD56+细胞.CD56+细胞数量仅在含细胞因子IL-2的组别中有显著增加,其它组则无明显变化.结论:脐血中T细胞、NK细胞在一定细胞因子组合下,可与干/祖细胞同时在体外被扩增和诱导分化.

维生素K2对骨髓增生异常综合征细胞株MDS-JSN04生长抑制作用及其机理研究

为了探讨维生素K2(VK2)对骨髓增生异常综合征细胞株MDS-JSN04生长的抑制作用及其作用机制,采用细胞形态学方法观察VK2处理后细胞形态的改变;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测VK2对细胞生长的抑制作用;流式细胞术分析细胞凋亡、细胞周期变化和髓系分化抗原CD11b、CD13的表达情况;RT-PCR技术检测抗凋亡基因bcl-2、survivin和促凋亡基因bax的表达;用发光比色法检测caspase-3活性.结果表明:VK2作用细胞株72小时后,细胞呈现典型的凋亡细胞的形态特征;细胞的凋亡率随着VK2浓度的增加和作用时间的延长而逐渐增高,经统计学处理与对照组比较有显著性差异(P＜0.01);S期和G2期细胞随着药物浓度的增加而逐渐减少,G0/G1期细胞逐渐增多,与对照组比较有显著性差异(P＜0.01),细胞被阻滞在G0/G1期,而且在G0/G1期前出现明显的亚G1期细胞即凋亡峰;抗凋亡基因bcl-2、survivin表达随着VK2浓度的增高而明显下调((P＜0.05),而促凋亡基因bax表达无明显变化((P＞0.05),caspase-3的活性随着VK2浓度的增加和作用时间的延长而逐渐增强.结论:VK2主要是通过激活caspase-3途径诱导MDS-JSN04细胞发生凋亡,同时抗凋亡基因bcl-2和survivin也参与了凋亡调控过程.

人类胚胎组织完整RNA的分离

为探讨人类胚胎组织完整RNA的分离方法及其影响因素,采用液氮研磨及匀浆器两种制备组织匀浆方法,对不同引产方式的人类胚胎组织进行总RNA分离,并对RNA质量进行鉴定.结果发现,液氮研磨组分离完整RNA的阳性率高于匀浆器处理组,分别为68.42%和29.29%,两组比较有显著性差异;药物引产组及非药物引产组在分离完整RNA阳性率、胚胎组织RNA的0D260/OD280比值和胚胎组织β-actin基因表达量上均无统计学差异.结论:液氮研磨方法可以应用于胚胎组织匀浆分离完整RNA,而不同引产方式对胚胎组织RNA质量并无直接的影响.

实时定量PCR技术在转基因肿瘤细胞株筛选中的应用

为了探讨实时定量RT-PCR技术用于筛选转基因细胞株的可行性,以转染RbAp46基因的细胞株为研究对象,利用优化的SYBR Green I染料实时定量PCR技术检测RbAp46基因的的表达水平,并与半定量PCR及Western blot检测结果相比较.结果表明:K562/RbA46中RbAp46N为2064.42±253.47,KA562/CMV中RbAp46N为860.94±291.07;单克隆SHG44/RbAp46的细胞株中RbAp46N为234.46±31.08,多克隆SHG44/RbAp46的细胞株RbAp46N为18.17±5.14,SHG44/CMV为1.46±0.54.与半定量RT-PCR及Western blot检测结果比较,三者之间具有非常好的一致性.结论:实时定量RT-PCR技术可以用于筛选转基因细胞株,与半定量RT-PCR及Western blot检测方法比较,具有简便、快捷、重复性好、灵敏度高且不需要后期处理等优点.

组蛋白去乙酰化酶抑制剂对HL-60细胞和K562细胞的抗肿瘤作用

为了观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)、曲古抑菌素(TSA)对K562细胞和HL-60细胞的抗肿瘤作用以及它们同全反式维甲酸(ATRA)之间的协同效应,采用绘制细胞生长曲线,计算半数抑制浓度(IC50)以及集落抑制试验等方法观察VPA,TSA以及全反式维甲酸(ATRA)在不同浓度或不同组合条件下对HL-60细胞和K562细胞的增殖抑制作用.采用细胞化学染色、分化抗原检测、细胞周期测定、联合NBT与MTT还原试验计算A(NBT)/A(MTT)值等方法分析细胞的分化或凋亡特点.结果显示,在体外培养体系中,VPA对HL-60细胞的IC50值低于对K562细胞的IC50值.ATRA能明显增强VPA、TSA对HL-60细胞以及VPA对K562细胞集落形成的抑制.HL-60经VPA处理后出现粒系表型,NBT还原率增加,CD11b表达增强,而K562细胞未显示分化迹象.结论:VPA和TSA抑制HL-60细胞增殖,VPA诱导HL-60细胞向粒系分化,这些作用均能被ATRA增强;VPA和TSA对K562细胞增殖抑制作用较弱,不能诱导K562细胞分化.

急性白血病细胞CD19和CD20表达比较

本研究目的是观察CD19和CD20在急性白血病(AL)细胞中的表达与分布,为急性B系白血病靶向分子的选择提供合理依据.采用27个荧光直标单克隆抗体及CD45/SSC双参数设门多色流式细胞术对321例AL细胞进行免疫诊断和分型,并对CD19和CD20在各种类型AL细胞中的表达情况进行分析.结果表明,在116例B系ALL病例中,CD19持续稳定表达,其阳性率(115/116,99.1%)明显高于CD20(33/116,28.4%,P=0.001);在17例含B系成分的混合型白血病(acute mixed lineage leukemia,AMLL)细胞中,前者的阳性率也明显高于CD20(P＜0.01),而在29例T细胞系ALL和7例T/My HAL细胞中,两者均无表达;在152例急性髓系白血病(AML)细胞中,CD19和CD20阳性率均很低,分别为7.2%和2.0%;CD19和CD20在B-ALL及B/My AMLL组中的荧光强度差别有显著性(t=20.68,P＜0.001);CD19和CD20的特异性分别为92.3%(132/143)和92.7%(38/41),敏感性分别为99.2%(132/133)和28.6%(38/133),前者敏感性明显高于后者(X2=144.018,P=0.001).结论:CD19在B细胞系细胞的各分化阶段上持续稳定表达,反应谱比CD20宽,特异性及敏感性均高,尤其是其敏感性显著高于后者.这提示CD19抗原分子可能成为治疗B系ALL的佳靶点.

同源盒基因HoxA10在急性白血病中的表达及相关研究

本研究探讨HoxA10基因在急性白血病患者中的表达及其临床意义.运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测50例急性白血病患者和10例对照者(7例正常人、3例ITP)中HoxA10mRNA的表达水平;分析其在急性白血病中的表达规律及与临床预后的关系.结果表明:HoxA1o在各型急性髓系白血病中均表达,在急性淋巴细胞白血病和部分对照者中低表达.3例正常人不表达HoxA10.HoxA10 mRNA表达水平在急性髓系白血病明显高于急性淋巴细胞白血病患者和对照组(P＜0.01),在急性髓系白血病中,M1型和M2型表达水平高于M4型和M5型,在M3型有显著高表达.骨髓中原、幼细胞比例和HoxA10mRNA表达水平呈正相关关系(r=0.635,P＜0.01).未缓解组9例患者HoxA10表达水平高于缓解组8例患者,但无显著差异(P=0.258).1例M2患者和1例M5患者缓解后HoxA10不表达.结论:HoxA10在急性髓系白血病中有异常高表达,具有髓系特异性,可作为区别淋系和髓系的标志性基因,但不是肿瘤细胞特有的基因,而是一类调控造血的转录因子,能与多种协同因子共同影响白血病的发生和发展.HoxA10的表达水平与肿瘤细胞负荷有关,与急性白血病的疗效有一定关系.

CD3AK/iNOS细胞对慢性粒细胞原代细胞白血病体外净化效应

本研究旨在探讨免疫细胞性一氧化氮供体CD3AK/iNOS细胞对慢性粒细胞白血病(CML)原代白血病细胞的体外净化效应.培养并扩增PA317/iNOS细胞并用G418筛选;用MH3T3细胞测定病毒滴度,分离外周血单个核细胞并用抗CD3单克隆抗体激活;病毒感染靶细胞CD3AK及用G418筛选,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD3AK/iNOS中iNOS cDNA的转录;用硝酸还原酶法检测CD3AK/iNOS细胞培养上清中NO含量以及iNOS活性;用系列稀释半定量巢式RT-PCR检测CML患者白血病原代细胞经CD3AK/iNOS细胞净化后bcr/abl融合基因的表达水平.结果表明,PA317/iNOS细胞能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒;MH3T3细胞测定病毒滴度为1.0×105CFU/ml;RT-PCR检测发现CD3AK/iNOS细胞中有iNOS cDNA的转录;CD3AK/iNOS细胞培养上清中NO含量和iNOS活性较CD3AK细胞明显升高.上述两项指标,经统计学检验,均有显著性差异(P＜0.001,P＜0.001).系列稀释半定量RT-PCR检测发现,经CD3AK/iNOS细胞净化后CML患者白血病细胞bcr/abl融合基因的表达明显下调.实验结果统计分析表明,CD3AK/Neo细胞组净化后与CD3AK/iNOS细胞组净化后bcr/abl mRNA表达的比较具有显著性差异(P＜0.001).结论:逆转录病毒可介导iNOS基因转入CD3AK细胞,成功地构建了CD3AK/iNOS;CD3AK/iNOS能明显地增加NO含量和iNOS活性,应用CD3AK/iNOS可能成为一个有效的AHSCT体外净化方法.

胞浆CD79a和其它B系相关抗原在急性白血病细胞表达的比较研究

为了比较胞浆CD79a(CyCD79a)与包括胞浆CD22(CyCD22)、CD19、CD20和CD10等其它4种常用B系相关抗原在各种急性白血病细胞上的表达情况并寻找针对急性前体B淋巴细胞白血病(pB-ALL)的敏感和特异的免疫学标志,对采用流式细胞术方法检测的221例成人和儿童急性白血病的免疫表型资料及常规细胞形态学和酶细胞化学染色资料进行了回顾性分析.另外,还对其中的45例急性早幼粒细胞白血病和13例怀疑存在AML1/ETO和CBFβ/MYH11等融合基因的急性髓细胞白血病(AML)进行了细胞遗传学和/或分子生物学检测.结果发现,对于pB-ALL来说,在这5种常用的B系抗原中,CyCD79a的敏感性高,而CyCD22的特异性好.CyCD79a在全部58例pB-ALL中的表达率为100%,而CyCD22在全部147例AML和15例急性前体T淋巴细胞白血病(pT-ALL)中则无1例表达,即在非pB-ALL的急性白血病中的表达率为0%.结论:联合检测CyCD79a和CyCD22是诊断pB-ALL的合适的免疫学指标,能够准确地将pB-ALL与AML,和pT-ALL相鉴别.

急性淋巴细胞白血病中hMSH2 mRNA及突变型P53蛋白的表达

为了探讨hMSH2 mRNA及突变型P53蛋白表达与急性淋巴细胞白血病发病的关系,采用寡核苷酸探针原位杂交技术及免疫细胞化学技术检测急性淋巴细胞白血病(ALL)患者骨髓单个核细胞的滴片hMSH2 mRNA和突变型P53蛋白的表达.结果显示:ALL组hMSH2 mRNA表达百分比低于对照组,分别为(32.88±11.46)%和(64.22±8.51)%,两组比较有显著性差异(P＜0.05);ALL组突变型P53蛋白表达百分比高于对照组,分别为(29.25±9.45)%和(12.63±6.66)%,两组比较有显著性差异(P＜0.05);ALL组、对照组中hMSH2的mRNA表达百分比与突变型P53蛋白表达百分比呈负相关(r值为-0.45,P＜0.05).结论:hMSH2基因表达缺失及P53蛋白突变可能参与ALL的发生和发展;hMSH2 mRNA表达缺失与突变型P53蛋白的高表达共同促进了ALL的发生.

PLZF-RARα/RARα-PLZF双阳性转基因小鼠发生白血病模型研究

本研究目的是从生物整体水平上研究PLZF-RARα/RARα-PLZF双融合基因的表达在急性早幼粒细胞白血病(APL)发病中的作用及发病机制.通过交配建立PLZF-RARα/RARα-PLZF双阳性转基因小鼠(TM)模型;采用PCR、RT-PCR方法检测融合基因的整合和表达;应用血象、骨髓象、病理和流式细胞术等对疾病表型进行检测分析;并观察全反式维甲酸(ATRA)或ATRA与tricostatin A(TSA)联合用药对PLZF-RARα/RARα-PLZF双阳性转基因小鼠骨髓细胞的作用.结果表明,在近18个月的时间观察到51只PLZF-RARα/RARα-PLZF双阳性转基因小鼠中有5只小鼠发病,发病率约10%,与我所同期的仅PLZF-RARα转基因阳性小鼠11.3%的发病率相似.发病时间均在6月龄以后,与PLZF-RARα转基因阳性发病小鼠相比示提前,但疾病表型不同,2只(40%)为急性早幼粒细胞白血病(APL)改变,3只(60%)为慢性粒细胞白血病(CML)改变.ATRA处理组的骨髓细胞形态无改变,而ATRA+TSA组骨髓原始细胞核浆比例降低,染色质固缩,呈现粒细胞分化趋势.结论PLZF-RARα/RARα-PLZF TM小鼠发病存在异质性,其骨髓细胞对ATRA无反应,而ATRA与TSA联合用药可诱导骨髓原始早幼粒细胞分化.

垂体肿瘤转化基因与碱性成纤维细胞生长因子在急性白血病中的表达和临床意义

为了探讨垂体肿瘤转化基因(PTTG)与碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)在急性白血病中的表达及其与急性白血病预后的相关性,采用免疫细胞化学染色方法检测53例急性白血病患者及15例非急性白血病患者的PTTG蛋白和b-FGF的表达水平.结果表明,急性白血病组PTTG蛋白和b-FGF表达较非急性白血病组明显升高,两者呈显著性差异(P＜0.01).在急性白血病组中,化疗后完全缓解的患者与初发的病人比较有显著差异(P＜0.01),并且PTTG蛋白和b-FGF的表达呈正相关(r=0.61,P＜0.01).结论:PTTG蛋白和b-FGF在急性白血病中高表达,而且与化疗疗效密切相关,这提示PTTG蛋白与b-FGF的检测对于急性白血病的诊断、疗效评价及预后估计均有一定意义,PTTG与b-FGF参与了急性白血病的发展.

具有11q23染色体异常的急性髓系白血病的细胞生物学和临床生物学研究

为了研究伴11q23染色体异常的成人急性髓系白血病(AML)的形态学、免疫学、和临床特征,对210例初治AML患者进行了回顾性分析,包括细胞形态学、免疫表型、G带或R带核型分析和临床资料.结果表明:13例AML患者存在11q23易位和缺失(发生率为6.19%),其中6例为M5a,4例为M5b,M4Eo、M3和M2各占1例,84.6%的病例为急性单核系白血病.免疫表型检测显示伴11q23异常的患者除了高表达造血干/祖细胞标志分子CD34和CD117等外,通常高表达单核系统相关标志分子,如CD14、CD15和CD11b.伴11q23异常组的化疗完全缓解率(CR)与正常核型对照组无明显差异(P=0.075),但无病生存期(DFS)低于正常核型对照组(P＜0.001).结论:伴11q23异常的AML占所有AML的6.19%,似与单核细胞的分化阻滞相关,临床预后不良.

CD138/Syndecan-1在多发性骨髓瘤免疫表型中的意义

为了建立多发性骨髓瘤(MM)免疫分型的测定方法,分析各种抗原的表达特点,并分选高纯度原代骨髓瘤细胞,应用CD45/侧向角(SSC)设门的三色免疫荧光流式细胞术(FCM)测定18例MM患者、20例急性白血病(AL)患者和7例正常人骨髓免疫分型特点;应用抗CD138和免疫磁珠从MM患者的骨髓中分选骨髓瘤细胞.结果表明:骨髓瘤细胞CD45阴性或弱阳性,SSC介于有核红细胞和中性粒细胞之间,CD138和CD38均阳性,T、B细胞及髓系抗原多为阴性,CD56阳性率为83.3%,HLA-DR阳性率为44.4%.与MM患者相比,AL患者CD138均阴性,而CD38为100%阳性,CD56阳性率为25%.正常人CD138和CD56均为阴性.磁珠分选获得的原代骨髓瘤细胞纯度在73%-95%之间,平均为86%.结论:CD45/SSC设门的三色免疫荧光FCM是测定MM免疫分型的稳定可靠方法,CD138是骨髓瘤细胞表面较为特异的抗原标志,应用抗CD138和免疫磁珠可以获得高度富集的原代骨髓瘤细胞.

肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

骨髓间充质干细胞的增殖、分化及迁移等生物学特性受骨髓微环境的调节.肝细胞生长因子(HGF)是骨髓微环境分泌的主要因子之一,但它对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响并不清楚.本研究目的是观察重组人HGF对骨髓MSC生物学特性的影响.用免疫组织化学方法检测c-Met的表达,用MTT法测定细胞增殖,定量测定ALP的活性,进行细胞迁移分析和失巢凋亡(anoikis)诱导MSC凋亡分析.结果表明,重组人HGF不影响骨髓间充质干细胞的增殖和向成骨细胞的分化,但可明显促进骨髓间充质干细胞的迁移并抑制anoikis诱导的细胞凋亡;PI-3K和MAPK途径参与了HGF促进细胞迁移的作用.结论:肝细胞生长因子通过受体c-Met影响骨髓间充质干细胞的生物学特性.

不同年龄段人骨髓间充质干细胞生物学特性的研究

本研究通过对不同年龄段人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的研究探讨MSC生物学特点与年龄的关系,从而为临床寻找合适供体,迅速获取所需MSC提供实验依据.骨髓供体按年龄分为4组:A组(胚胎)、B组(0-20岁)、C组(20-40岁)和D组(40岁以上).观察各组骨髓MSC的生长、增殖、分化特点;用流式细胞仪检测细胞表面标志,用ELISA方法检测培养上清造血相关因子的水平;进行核型分析及成瘤试验;评价不同年龄段供体骨髓MSC在临床造血干细胞移植中的应用价值.结果显示:各组骨髓均可培养出MSC,各组MSC表面标志无显著差异;各组MSC均具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的能力;原代培养B组骨髓MSC含量较多,贴壁时间早,传代时间短,P0至P1时间为5.5天,传至P10需33天,8×106MNC培养至P10时MSC数达(5.19±2.15)×1010;A、C、D组P0至P1时间分别为15、7和13天,传至P10分别需50、60和72天,8×106MNC培养传代至P10时MSC数分别为(4.98±2.08)×1010、(1.86±0.47)×1010、(0.64±0.22)×1010.A组MSC较细长,细胞融合后生长无接触抑制,P15增殖速度开始减缓;B、C、D组MSC形态相似,有生长接触抑制B组P10开始增殖减缓,C、D组P8开始增殖减缓;B组MSC培养上清中SCF、FLT3-L、IL-6及SDF-1水平高于其它各组.各组间细胞的增殖指数无显著差异.核型分析均为正常核型,成瘤实验为阴性.结论:MSC增殖生长特性与年龄密切相关;根据临床造血干细胞移植的需要,0-20岁年龄组骨髓是短时间内获取足够细胞数的理想供体,分泌HGFs水平亦占优势;0-20岁组骨髓MSC的生物学特性优于其他各组,可以作为MSC的供源.

期望肿瘤细胞凋亡还是坏死?

尽管不同抗癌药物诱导细胞凋亡的机制和途径不尽相同,但实验研究证明小剂量抗癌药物都可诱导体外培养细胞凋亡.近年来,新的肿瘤治疗策略往往以诱导肿瘤细胞凋亡为主,本文讨论其利弊:诱导肿瘤细胞凋亡的主要优点是不引起炎症反应,但这也是它的主要弊端,即会引起机体免疫抑制;另一弊端是凋亡细胞被吞噬后其基因(包括癌基因等致癌物质)横向传播而成为肿瘤复发的起因之一.本文提出,应该以促使肿瘤细胞坏死、诱导机体抗肿瘤免疫反应为抗肿瘤治疗的主导思想和研究方向.

Fenretinide诱导白血病细胞凋亡的机理研究

Fenretinide(4-HPR)是人工合成的全反式维甲酸衍生物,能够通过诱导凋亡抑制多种肿瘤细胞生长和增殖,但是其机理尚不很清楚.本研究考察4-HPR对几种白血病细胞的影响,并用U937为对象研究其作用机制.在研究中进行了细胞生长和增殖实验,以膜联蛋白检测细胞凋亡,测定活性氧(ROS)和线粒体跨膜电位(△ψm)及用Western blot检测蛋白表达.研究结果表明,4-HPR能够剂量依赖性地抑制多种白血病细胞株的增殖,进一步发现4-HPR能够诱导U937细胞发生凋亡,并且此凋亡可以被维生素C所抑制.此凋亡过程伴有活性氧的升高,线粒体跨膜电位的下降,以及酶原型胱冬酶-8(caspase-8),-3的蛋白水平表达下降.结论:4-HPR可能通过升高细胞内ROS的水平,造成线粒体膜损伤,引发由caspase家族成员介导的凋亡,提示4-HPR可能是一种线粒体靶向的药物.

WT1基因转染增加白血病细胞凋亡的实验研究

为了探讨WT1基因异构体对急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4凋亡的影响及其分子机制,应用电穿孔的方法将携带WT1基因异构体WTA(-17AA/-KTS)全长cDNA的真核表达载体及其对照质粒pCB6+转导白血病细胞株NB4,建立WT1基因异构体表达比例改变的单克隆细胞株;用MTT、形态学观察、DNA凝胶电泳、An-nexin V结合力测定等方法观察WT1基因异构体表达比例的转变对白血病细胞NB4诱导凋亡的影响;用RT-PCR方法检测细胞中p21、p53、bcl-2、bcl-XL、和c-myc等凋亡相关基因表达的改变.研究结果表明,MTT显示NB4/WTA细胞对As2O3的IC50值较对照组明显降低;经As2O3作用48小时,NB4/WTA细胞Annexin V结合力较对照组细胞升高,出现更为典型的凋亡形态学改变;在DNA凝胶电泳可见更为明显的DNA梯形条带,RT-PCR检测提示NB4/WTA细胞p21、c-myc基因的表达较对照组高,bcl-2表达下降,p53、bcl-XL基因表达无明显改变.结论:增加外源性WT1基因异构体WTA的表达从而将WT1基因异构体表达的比例由+17AA/+KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型,能使NB4细胞对As2O3引起的凋亡更为敏感,这些改变可能与p21、c-myc等基因的表达上调和bcl-2基因的表达下调有关.

调控抗凋亡基因survivin表达的因素研究

为了探讨调控存活蛋白(survivin)基因表达的影响因素,以NB4和HL-60细胞株作为实验对象,对细胞进行体外细胞培养、形态学观察,并用半定量RT-PCR检测survivin mRNA的表达.结果显示:NB4细胞株细胞survivin基因表达阳性,经1 μmol/L ATRA处理后,随着作用时间延长,其细胞分化抗原CD11b表达量逐渐增高(-x=47.002,P=0.000),而CD33表达量逐渐减低(-x=1.614,P=0.806),并见survivin基因表达下调,细胞周期阻滞于G0-G1期(-x=58.566,P=0.000);ATRA对HL-60细胞株细胞survivin mRNA表达有下调作用;G-CSF、GM-CSF和植物血凝素(PHA)均能使NB4和HL-60细胞株细胞survivinmRNA表达上调,并呈时效关系;100-1 000 nmol/L survivin反义寡聚核苷酸(AS-0DN)抑制NB4细胞株细胞survivin mRNA表达,随着浓度增加其抑制率增加,600nmol/L时其抑制率低为38%,增加浓度未见抑制率继续下降,而对照组、脂质体组和正义链组中NB4细胞株细胞sur-vivin mRNA表达几乎未受到抑制;在细胞形态学上,NB4细胞株细胞经survivin AS-ODN处理后出现典型的凋亡形态学变化.结论:PHA、GM-CSF和G-CSF对HL-60和NB4细胞株细胞survivin基因表达起正向调节作用,而sur-vivin AS-0DN和ATRA起负向调节作用;ATRA下调survivin基因表达,且细胞周期阻滞于G0-G1期,这说明survivin基因表达与细胞周期之间关系密切,抑制NB4细胞株细胞survivin基因的表达可促使细胞发生凋亡.

硝普钠诱导K562细胞凋亡机制的研究

为了研究外源性一氧化氮供体硝普钠诱导K562细胞凋亡机制,将不同浓度的硝普钠与K562细胞在体外培养,同时设高铁氰化钾(PFC)对照组和空白对照.用Annexin-V/PI双标记、DNA片段原位末端标记法、DNA凝胶电泳、DNA含量及细胞周期分析等方法检测细胞凋亡;用Rh123/PI测定线粒体跨膜电位(△ψm);以双氢罗丹明123(dihydrorhodamin123,DRH)和2',7':-二氯双氢荧光素二乙酸酯(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)为荧光探针,测定线粒体内和细胞胞质内过氧化物;用流式细胞术测定线粒体膜蛋白和bcl-2、bax、bad、p53和Fas凋亡调控基因蛋白.结果表明:K562细胞经硝普钠作用后出现典型的细胞形态改变,DNA片段化,亚G1峰检出并显著增加,annexin-V/PI和DNA片段原位末端标记表达增加,这些结果均证实NO能诱导K562细胞凋亡,大部分细胞阻滞于G0/G1期.硝普钠诱导K562细胞凋亡过程中,胞质和线粒体内活性氧自由基增加,线粒体跨膜电位降低,bcl-2基因蛋白表达下调,同时bax、bad、p53、Fas和线粒体膜蛋白表达均上调.结论:NO诱导k562细胞凋亡是通过产生活性氧自由基,使p53基因表达增加,下调bcl-2基因和使bax、bad基因表达上调,线粒体膜通渗性转运孔开放,△ψm降低来实现的,此外还存在Fas系统激活途径.

重组人粒细胞集落刺激因子对阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡的影响

为了研究重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对阿糖胞苷(Ara-C)诱导HL-60细胞凋亡的影响,体外培养HL-60细胞,加入rhG-CSF和(或)Ara-C,瑞氏染色观察细胞形态变化,吖啶橙/溴化乙锭双染色观察细胞凋亡情况,MTT实验检测细胞增殖活性.结果表明:加入rhG-CSF后Ara-C诱导的HL-60细胞的凋亡率升高(P＜0.01),而MTT实验的OD值降低(P＜0.01).结论:rhG-CSF有诱导HL-60细胞凋亡的作用,rhG-CSF可以促进Ara-c诱导HL-60细胞凋亡的作用.

氯化锂抑制K562白血病细胞增殖及诱导凋亡机理的研究

本研究旨在探讨氯化锂(LiCl)在体外抑制K562白血病细胞增殖和诱导凋亡的机制.在细胞培养体系中加入LiCl(30 mmol/L)进行培养;以流式细胞术分析细胞周期;用半定量RT-PCR检测bcr/abl融合基因mRNA的表达;用原子吸收光谱仪检测不同时间点细胞内Li+浓度及Na+、K+通道阻断剂TTX、FSK分别对细胞内Li+浓度的影响,并观察了Na+、K+通道阻断剂对LiCl抑制细胞生长的作用.结果显示:LiCl(30 mmol/L)导致K562白血病细胞出现G2/M期阻滞,bcr/abl mRNA表达下降,细胞内Li+的浓度从30分钟开始增加,在2小时达高峰,以后逐渐下降,4小时达到平衡;Na+、K+通道阻断剂TTX(3.4×10-7mol/L)与FSK(5×10-5mol/L)分别阻断Na+、K+通道后可升高细胞内Li+的浓度,并增加LiCl对K562白血病细胞增殖的抑制作用.结论:LiCl诱导K562细胞增殖抑制和凋亡的机制可能与K562细胞G2/M期阻滞、下调bcr/abl mRNA的表达及Na+、K+通道被阻断后Li+通道的状态有关.

应用蛋白质芯片对汉防己甲素单用及与屈洛昔芬伍用逆转白血病细胞耐药机理的研究

本研究的目的是应用蛋白质芯片检测汉防已甲素(Tet)单独及与屈洛昔芬(Drol)伍用对作用的白血病细胞表面的耐药蛋白,包括P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MBP1)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)表达的作用,为逆转剂的临床应用提供理论依据.选择位于膜表面P-gp、MRP1、BCRP耐药蛋白及其相应的抗体为研究体系,制备蛋白芯片,直接对逆转剂作用12、24和48小时的K562/A02细胞进行检测.结果表明:Tet和Drol联合作用24小时时检测到P-gp表达下调(Tet+Drol组:85.27±3.095,对照组:93.67±2.748,P＜0.05).经逆转剂单独及联合作用K562/A02细胞48小时时均检测到P-gp表达下调,且联合应用两药对P-gp表达下调作用明显(Tet+Drol:82.62±3.227,Tet:86.44±2.906,Drol:87.23±2.049,对照组:93.67±2.748,P＜O.05).检测结果与流式细胞仪检测结果一致.结论:逆转剂Tet和Drol对K562/A02细胞的P-gp下调呈时间依赖性.联合作用24小时时出现下调P-gp表达,单独作用48小时均下调P-gp表达,联合用药时下调作用明显.不同检测时间均未见下调MBP1和BCRP的表达.

慢性粒细胞性白血病患者骨髓源bcr/abl融合基因阳性Flk1+CD31-CD34-干细胞体外抗STI571机制的初步研究

为进一步了解STI571对慢性粒细胞性白血病(CML)患者体内bcr/abl融合基因阳性的原始及定向白血病干/祖细胞分化及增殖的影响,更深入阐明部分CML患者在经历一段血液学甚至是细胞遗传学水平上的完全缓解后复发及对STI571的耐药机制,利用从CML患者骨髓分离到的具有血管母细胞特性、bcr/abl融合基因阳性、免疫表型为Flk1+CD31-CD34-细胞,体外检测了STI571对其在造血集落培养基中的分化及处于分化阶段时的增殖抑制作用.结果显示:浓度为5 μmol/L STI571,维持作用96小时(病人体内维持96小时的STI571浓度只可能达到1-2 μmol/L),即可有效抑制定向造血祖细胞的增殖.没有充分的证据显示,相对原始的bcr/abl融合基因阳性、免疫表型为Flk1+CD31-CD34-细胞的分化及增殖受到明显的抑制作用.结论:CML患者体内的原始白血病干/祖细胞对STI571具有一定的抗性,临床上所观察到的CML患者在运用STI571一段时间后出现正常的造血恢复现象,可能仅仅是因为STI571杀死或抑制了定向恶性白血病祖细胞的增殖,但随着时间的推移,在经历了短暂的血液学甚至是细胞遗传学水平上的缓解后,对STI571耐药的原始白血病干/祖细胞终究会再次导致CML的复发.

表达绿荧光蛋白的多药耐药微小残留白血病细胞的小鼠模型

为了方便研究多药耐药微小残留白血病的病理生理和治疗,采用携带绿荧光蛋白(EGFP)基因标记的小鼠多药耐药白血病细胞系P388/VCR-G和DBA小鼠建立一个检测多药耐药微小残留白血病的动物模型.结果显示,P388/VCR-G细胞腹腔接种DBA小鼠,白血病的发病率为100%,无自发缓解.P388/VCR-G白血病模型小鼠对环磷酰胺(Cy)敏感,有较好的药物剂量-生存时间关系,接种细胞的对数与Cy剂量间有良好回归相关关系.白血病诱导缓解后残留白血病细胞在肝、脾、胸腺及骨髓等脏器呈不均匀分布.冰冻切片荧光显微镜下观察EGFP+细胞是检测小鼠体内微小残留白血病细胞敏感的方法.结论:采用P388/VCR-G细胞和DBA小鼠可建立表达EG-FP的多药耐药小鼠微小残留白血病模型.

多药耐药K562/A02和敏感K562细胞来源的树突状细胞介导抗白血病效应对比研究

本研究探讨多药耐药(MDR)白血病K562/A02细胞和敏感K562细胞诱导树突状细胞(DC)分化及介导的抗白血病效应.采用慢性粒细胞白血病(CML)P-170糖蛋白(P-gp)高表达的MDR K562/A02细胞、敏感K562细胞在含细胞因子GM-CSF(1 000 U/ml)、IL-4(500U/ml)和TNF-α(100ng/ml)的RPMI1640完全培养液中诱导分化成DC,以光镜观察细胞形态、流式细胞术检测细胞表型,异基因混合淋巴细胞反应(allo-MLR)检测T细胞增殖活性,MTT法测定细胞毒作用.结果表明:培养14天的K562/A02细胞和K562细胞均出现典型的DC形态特征,表达DC的相关分化抗原及共刺激分子CD1a、CD83、HLA-DR、CD80、CD86.allo-MLR检测中,K562/A02-DC较K562-DC具有更强的刺激异基因T细胞增殖能力(P＜0.05).两种DC激活的CTL分别对K562/A02和K562细胞较HL-60细胞具有显著的杀伤活性(P＜0.01);更重要的是,K562/A02-DC较K562-DC激活的CTL对P-gp高表达的MDR K562/A02细胞、HL-60/VCR细胞具有更强的细胞毒作用,杀伤活性分别为(40.7±1.3)%、(28.4±0.9)%(P＜0.01)和(24.9±1.1)%、(8.2±0.7)%(P＜0.01).结论:P-gp高表达的MDR白血病细胞K562/A02和敏感K562细胞都可在GM-CSF、IL-4和TNF-α作用下诱导分化为成熟DC,均可活化CTL产生特异的抗白血病效应;尤其K562/A02细胞来源的DC可介导针对P-gp高表达的多药耐药白血病的特异细胞毒作用.

bcl-2小干扰RNA对HL-60/VCR细胞耐药性逆转的研究

为了探讨以bcl-2基因作为靶分子进行白血病多药耐药基因治疗的可行性,构建bcl-2基因的小干扰RNA载体并将其转导入HL-60/VCR细胞,在G418筛选后应用Western blot进行鉴定;MTT法检测细胞转染前后生长速度和药物敏感性的变化;Western blot检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bax和耐药相关蛋白ZNRD1的表达变化.结果表明:成功构建了bcl-2的小干扰RNA载体并转染HL-60/VCR;经蛋白质水平检测证实成功建立了bcl-2低表达的白血病细胞模型;转染后的细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增强,且低表达耐药相关蛋白ZNRD1.结论:bcl-2小干扰RNA真核表达载体能在一定程度上逆转白血病细胞的耐药性.

中剂量rhG-CSF对正常供者外周血CD34+细胞动员效果

本研究探讨中等剂量600μg/d粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对正常供者CD34+细胞的动员效果及动员前后外周血单个核细胞中T细胞亚群的变化.对2002-2004年我科31例健康供者给予rhG-CSF 600μg/d,在动员的第4天开始采集外周血干细胞(PBSC),并检测动员前后白细胞总数、动员后的有核细胞(NC)数、单个核细胞(MNC)数、CD34+细胞数及粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM),同时观察动员及采集过程中的不良反应.对12例供者G-CSF动员前后外周血单个核细胞中T细胞亚群的变化进行了观察.结果显示:600μg/d组与既往使用的300μg/d组相比,rhG-CSF动员后的外周血细胞中NC、MNC和CD34+细胞及CFU-GM显著增加(P＜0.05),受者造血重建时间缩短(P＜0.05),动员和采集过程中的不良反应发生率无明显上升(P＞0.05),无严重不良反应发生.动员后CD3+细胞在PBMNC中的比例较动员前下降(15.05±3.3)%,(P＜0.05).动员前后CD4+/CD8+淋巴细胞的比值无明显变化(P＞0.05).结论:600μg/d的G-CSF对正常供者的动员效果好,受者造血重建快,无严重不良反应发生.动员后PBMNC中CD3+细胞的下降及CD4+/CD8+淋巴细胞比值无明显变化,从而使得移植后急性GVHD的发生率无明显上升.

rhG-CSF对急性白血病化疗后中性粒细胞形态、功能、表型的影响

为了探讨急性白血病病人化疗后应用rhG-CSF对中性粒细胞形态、功能及表型变化的影响,采用油镜下观察细胞形态,过氧化氢释放法、琼脂糖测定法、免疫荧光技术和流式细胞术检测中性粒细胞的吞噬、趋化及氧化代谢功能;采用免疫荧光技术和流式细胞分析检测中性粒细胞表型.结果表明:应用rhG-CSF后,中性粒细胞胞浆内"中毒"颗粒数、空泡数和Dohle小体数增加;化疗后病人中性粒细胞吞噬、趋化及氧化代谢功能明显低于正常组,用rhG-CSF后功能均增强,基本接近正常组甚至超出;用rhG-CSF前中性粒细胞CD64、CD62L的表达明显高于正常对照组,用G-CSF后CD64表达上调,CD62L表达显著下调;CD16、CD32、CD14和CD11b则无明显改变.结论:急性白血病病人化疗后应用rhG-CSF可引起中性粒细胞形态、功能及表型出现变化,进一步增强机体的抗感染能力.

GM-CSF对脐血CD34+巨核祖细胞体外扩增及分化的影响

本实验旨在研究GM-CSF对脐血CD34+细胞诱导分化为巨核细胞的影响.采用免疫磁珠法分选CD34+细胞,在含有TPO+IL-3+SCF并添加了不同浓度(5、20、100ng/ml)的GM-CSF的无血清培养基中进行培养.培养6、10、14天后计数单个核细胞(MNC),检测CD41+细胞比例和CFU-MK.结果表明,培养14天后3种不同浓度GM-CSF对MNC均有明显的扩增作用,其中以20和100ng/ml GM-CSF的扩增效果较好.3种不同浓度的GM-CSF均使CD41+细胞比例增加,20和100ng/ml与5 ng/ml GM-CSF相比更能提高CD41+细胞的比例.5和20 ng/ml的GM-CSF能促进CFU-MK的形成,但100ng/ml的GM-CSF却抑制CFU-MK的形成.结论:在TPO+IL-3+SCF细胞因子组合中添加GM-CSF有利于促进脐血CD34+细胞诱导分化为巨核细胞.

纤维蛋白原Bβ-链复合杂合突变导致的遗传性无纤维蛋白原血症

遗传性无纤维蛋白原血症是一种由于纤维蛋白原基因缺陷所致常染色体隐性遗传病.为了对1例遗传性无纤维蛋白原血症家系进行表型和基因型分析,采集了该家系三代10人外周血,吸取上层血浆用血凝仪检测活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TI);纤维蛋白原(Fg)含量分别用Clauss法和免疫比浊法进行检测;以常规酚-氯仿法抽提家系所有成员外周血基因组DNA,PCR扩增Fg基因FGA、FGB和FGG所有外显子及其侧翼序列和启动子区,PCR产物纯化后直接测序以检测基因突变.102例健康献血者作为正常对照.结果表明:先证者表型诊断为无纤维蛋白原血症;基因型呈Fg B β-链Arg17stop和Gly347Arg复合杂合突变,前者来源于母系,后者来源于父系.结论:Fg B β-链Arg17 stop和Gly347Arg复合杂合突变是引起该家系先证者产生无纤维蛋白原血症的原因.

巨核细胞逸核和胞核胞质连体分离的形态学研究

为了观察巨核细胞逸核和胞核胞质连体分离的形态学变化,用光镜观察4例初诊血液病患者的血片、骨髓涂片和骨髓切片中巨核细胞形态特征.4例初诊血液病患者为1例原发性骨髓纤维化(PMF),1例骨髓增生异常综合征(MDS),1例急性粒细胞白血病部分成熟型(M2)和1例红白血病(M6).结果显示:在4例患者骨髓象中均观察到多种病态巨核细胞,其中例A(PMF)和例D(M6)多为撕拉分离状的病态巨核细胞;例B(MDS)和例C(M2)多为脱核的或胞核胞质分离状的病态巨核细胞,胞体大或巨大,部分胞核远离母体,有的残留少量胞质成为小(或)淋巴样巨核细胞,细胞免疫化学染色可显示分离的胞核胞质.结论:巨核细胞存在逸核和(或)胞核胞质分离现象,提示巨核细胞在成熟中存在多核胞核分散向周边逸去的过程,甚至完全脱离母体;微小巨核细胞可能是由多小核巨核细胞的胞核连胞质分离或分割而成的部分.

人vW因子A2区基因表达及其生物学活性的研究

血管性血友病因子(vWF)在血管性血友病(vwD)以及血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的发病中起着重要的作用,并受血浆vwF裂解蛋白酶(ADAMTS-13)的调节.本研究表达vwF中的A2区蛋白,并研究ADAMTS-13对其裂解活性.首先,应用基因重组技术在大肠杆菌中表达人vwF-A2区蛋白,经纯化、复性获得重组蛋白(rvWF-A2),并与正常人以及TYP患者血浆进行反应,分析rvWF-A2蛋白的生物学活性.结果表明:重组表达载体pQE-30-vwFA2在大肠杆菌M15中得到高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的42%,Ni-NTA agrose柱层析纯化后,其纯度为98%,经复性的rvwF-A2可作为ADAMTS-13良好的酶解底物,可被枸橼酸钠抗凝的正常人血浆切割,其切割程度随时间的延长而增加,而EDTA抗凝的正常人血浆以及TTP患者血浆无法切割此蛋白.结论:在大肠杆菌中高效表达的rvWF-A2具有良好的生物学活性,为建立定量测定ADAMTS-13活性的方法奠定了坚实的基础.

恶性血液病并发肺部霉菌感染14例临床分析

为了探讨恶性血液病并发肺部霉菌感染的发病原因及其诊断和治疗,对14例患者的临床症状、体征、体温、血常规检查、痰病原学结果、影像学诊断、抗生素及激素使用情况进行了收集和分析.结果表明:14例中有呼吸道症状者¨例,7例痰粘稠不易咳出,11例胸片检查可见大小不等的点片状阴影;10例白色念珠菌感染(71.4%),2例曲霉菌感染;8例中性粒细胞＜0.5×109/L(57.1%),3例＜1.0×109/L(21.4%);对这些霉菌感染病例均用广谱抗生素联合抗感染治疗7天以上;对曲霉菌感染者给予二性霉素B,余12例用氟康唑治疗2周以上;治疗1周内症状改善并消失者6例(42.9%),治疗2周内症状改善并消失者5例(35.7%),3例死亡.结论:恶性血液病合并肺部霉菌感染原因与强烈化疗、中性粒细胞减少、大量广谱抗生素的应用有关,早期诊断较困难,对此临床上应予以重视,及时发现,及时治疗.

单倍相合骨髓移植术后中枢神经系统并发症

为了探讨单倍体骨髓移植术后神经系统并发症的发生情况,对10例单倍相合骨髓移植术后神经系统并发症的发生时间、病因、治疗措施及预后等临床资料进行了总结分析.结果表明:74例接受单倍体相合骨髓移植病人中10例发生并发症,其中3例病人出现脑出血,感染3例(真菌感染,CMV脑炎,单纯疱疹病毒性脑炎各l例),癫痫、格林-巴利综合征、脑病和精神分裂症各1例,因神经系统并发症直接导致死亡的患者4例.结论:神经系统并发症是单倍相合骨髓移植术后常见的严重并发症之一,并导致较高的死亡率,尤其是脑出血对病人的威胁较大;单倍相合骨髓移植术后免疫重建缓慢,对相关感染并发症和周围神经的病变应引起重视.

2005年13卷中文关键词索引

2005年13卷英文关键词索引

2005年13卷作者索引