中国实验血液学杂志
Journal of Experimental Hematology 중국실험혈액학잡지
- 主管单位： 实验血液学杂志
- 主办单位： 中国科学技术协会
- 影响因子： 0.98
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 11-4423/R
- 国内刊号： 陈潮
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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表观遗传调控在白血病发生中作用的研究进展——MicroRNA与白血病
表观遗传是指DNA序列不发生变化但基因的表达却发生了可遗传的改变,表观遗传调控与白血病的发生密切相关.随着发现一类新的非编码的微小RNA(microRNA)参与基因表达的转录后和翻译水平的调节,异常的mieroRNA的表达在白血病的发生中起着重要的作用.作为表观遗传研究范畴的microRNA,已成为了白血病发病机制中的异常表观遗传调控研究的新热点.本文就表现遗传调控与白血病的发生、miRNA的表达异常在白血病发生中的作用、miRNA在白血病诊断、分类、治疗和预后判断中的应用前景进行了综述.
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白血病细胞自噬调控的研究进展
自噬是真核细胞内一种保守的自降解系统,参与多种生理病理过程.自噬体是自噬发生的典型特征,针对自噬体形成和降解的调节是自噬的主要调控环节.自噬具有促进细胞存活和死亡的双重特性,在某种程度上,自噬决定了细胞的存亡.自噬与肿瘤的关系十分密切,涉及到肿瘤的发生发展、转移及耐药.靶向自噬有可能成为治疗肿瘤和解决耐药的新策略.随着细胞自噬在白血病研究中的深入,将进一步阐明白血病细胞自噬的诱导和调控机制,为其治疗提供新的靶点和策略,或使白血病治愈成为可能.本文就自噬特征与调控、自噬与肿瘤、自噬与白血病及白血病细胞自噬的调控进行了综述.
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RUNX1表观遗传机制在白血病发生中的作用研究进展
RUNX1又称为AML1,是RUNX转录因子蛋白家族中的成员之一,是白血病染色体易位常见的靶位点.RUNX1是十分重要的转录因子,可双向(促进或抑制)调节造血相关基因的表达.RUNX1蛋白可接受多种翻译后修饰,其活性可受这些翻译后修饰的影响,从而调节造血细胞的分化、凋亡及自我更新.本文重点综述RUNX1的靶基因、转录机制及翻译后修饰等表观遗传机制在白血病发生中的作用.
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Notch信号通路在白血病发生及血管新生中的作用
许多肿瘤的发生发展均与Notch受体表达异常有关,在不同组织中肿瘤发展的不同阶段,乃至同一系统肿瘤中不同Notch受体的作用可能不同,甚至相反.Notch信号通路在细胞增殖、分化、凋亡及肿瘤血管新生中起重要作用,是许多重要细胞信号通路的交汇点.血管发生依赖多种促进血管发生因子和抑制血管发生因子的交互作用.血管内皮生长因子和Notch信号传递途径参与了此过程.既往的研究已证实,Notch信号传递途径在胚胎发育和肿瘤血管发生中扮演重要角色.近研究还发现,Notch信号通路中有许多潜在的药物靶点,在深入研究Notch信号转导通路及其与白血病发病分子机制的基础上,针对这些靶点设计相关药物以阻断或者活化Notch信号,进行白血病及血管新生性疾病的治疗有广阔的应用前景.本文就Notch信号通路的组成;Notch信号通路在白血病发病及血管新生中的作用进行综述.
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CD4+T淋巴细胞功能研究新进展
细胞免疫是人体免疫系统的重要组成部分,在清除癌变组织和病原菌入侵中发挥重大作用.T细胞在细胞免疫中居中心地位.长期以来,T细胞免疫的研究重点主要集中于CD8+细胞毒T细胞.而关于CD4+T细胞功能的研究多限于CD8+细胞毒T细胞的"辅助"功能,或作为调节细胞抑制免疫反应的研究上,而其杀伤和清除肿瘤细胞的作用似乎被忽视.新近的研究表明,特异性CD8+细胞毒T细胞效应在动物实验或临床研究上均未见理想的效果,CD4+T细胞不是功能单一的一类细胞,而是功能复杂的细胞群.CIM+T细胞的功能不仅限于辅助细胞毒T细胞,而且可以协助NK细胞清除和杀灭肿瘤,甚至还具有不依赖于CD8+ CTL的肿瘤杀伤作用.CD4+T细胞在机体抗肿瘤免疫中具有重大意义.本文就CD4+ T细胞的分类,分化;CD4+ T细胞的功能和分泌的细胞因子;CD4+T细胞与肿瘤免疫;CD4+T细胞的肿瘤免疫调节作用及CD4+T细胞的临床研究进行了综述.
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Notch信号通路与间充质干细胞分化
间充质干细胞(MSC)是具有多向分化能力的成体干细胞,在体外培养中可以被诱导分化为骨、软骨、脂肪、肌肉细胞;另外,MSC也可跨系分化为神经细胞、心肌细胞、肝脏细胞等多种其他组织细胞.Notch信号通路广泛存在于各种动物细胞中,在调节细胞分化、增殖和凋亡中发挥重要作用,它的配体和受体都是细胞膜表面蛋白,因此是介导细胞间通讯的一种重要方式.现有研究表明:在MSC多条分化途径中都有Notch通路存在.本文针对Notch信号通路在MSC分化中的影响做一综述.
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急性非淋巴细胞白血病的细胞和分子遗传学研究进展
随着细胞与分子遗传学技术在急性白血病(AL)的研究进展中的运用,AL的诊断分型已由1976年提出的以形态学为主的FAB分型发展到2001年的MICM分型,突出体现了细胞和分子遗传学的改变在AL诊断分型的重要地位.除此之外,细胞和分子遗传学改变还对急性白血病的危险度分层、预后判断、治疗指导及新药研发起着重要的指导作用.本文将论述染色体异常和融合基因的表达对急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)的诊断分型、预后评估和治疗的指导作用,并对染色体核型正常的ANLL几种常见的基因突变对疾病预后评估做个总结.近年来,对ANLL各型白血病分子细胞遗传学机制的进一步阐释有助于开发新的白血病治疗策略.
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骨髓增生异常综合征的表观遗传改变
表观遗传改变是指不涉及DNA序列变化但影响细胞基因表达的一些可遗传的改变,主要包括DNA启动子的甲基化和组蛋白的各种共价修饰.表观遗传改变与肿瘤的发生密切相关,在多种表观遗传相关分子共同参与下,组蛋白氨基酸残基去乙酰化或甲基化,抑癌基因启动子甲基化,使各种转录因子无法与DNA结合而导致抑癌基因失活.目前已知,骨髓增生异常综合征(MDS)存在多种抑癌基因的表观遗传改变,也存在着表观遗传调节蛋白PcG的表达异常,这些都与MDS的进展和预后有着密切的关系,提示了它们可作为新的疾病标志物应用于临床.本文就MDS的存在的表观遗传改变分子机制、抑癌基因失活和PcG蛋白异常作一综述.
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vWF基因单核苷酸多态性与血栓性疾病发病的关系
近发现,不仅血管性血友病因子(vWF)减少会造成血管性血友病,而且vWF水平增加也会造成各种血栓性疾病.vWF水平受遗传因素的影响,不同单核苷酸多态性(SNP)基因型的人群对疾病的易感性不尽相同;不同血型的个体vWF表达水平也不同.环境因素也可影响血浆vWF水平.了解vWF基因的启动子、外显子和内含子区域多态性与血栓性疾病的关系有助于临床疾病的预防与治疗.本综述讨论vWF基因的启动子、外显子和内合子区域SNP与血栓性疾病关系的研究进展.
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25Gyγ射线辐照对手工富集人血小板CD62p表达的影响
本研究观察25 Gy γ射线照射对22℃保存条件下的手工富集血小板悬液不同保存期CD62p、血小板计数及平均血小板体积(MPV)的影响.将富浆法分离的16袋血小板,每袋平均分为两份,其中1袋经25 Gy 137铯γ射线辐照,另1份不辐照,然后按美国血库协会(AABB)标准保存72小时.经辐照的血小板作为观察组,未辐照的血小板作为对照组.流式细胞术检测两组血小板辐照前及保存24和72小时后P选择蛋白的表达水平;同时用血细胞计数仪检测血小板数和平均血小板体积(MPV).结果表明:辐照组与对照组血小板表达CD62p百分率均随保存时间的延长而增高;保存24小时与新鲜血小板比较有显著性差异(p<0.05),保存72小时与保存24小时比较有非常显著性差异(p<0.01).在保存24、72小时后,两组血小板CD62p表达率、血小板计数无显著差异(P>0.05);但两组血小板在保存72小时后MPV与新鲜血小板比较有显著性差异(p<0.05).结论:γ射线照射不影响血小板的数量和质量,但手工血小板液态储存时间应尽可能缩短.
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中国北方汉族人群HLA-Cw*高分辨等位基因频率分析
本研究从基因水平了解HLA-Cw*位点在中国北方汉族人群中的分布频率,分析HLA-Cw*等位基因的群体遗传学特点及基因频率分布的地区差异.采用PCR-SSP分型技术对420名中国北方汉族人群HLA-Cw*位点进行高分辨基因分型,并时其分布规律进行统计学分析.结果表明:共检出30个HLA-Cw*等位基因,分布频率高的有Cw*0102;0702;0602(0.1776;0.1217;0.1150),其他频率较高的等位基因依次为Cw*0304,0801,0303,0302,0401,1402.首次在该人群中检测到HLA-Cw*0506,0810,1510,1601和1701较少见等位基因.统计分析表明,HLA-Cw位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05).结论:采用高分辨等位基因分型,可准确了解HLA-Cw*位点等位基因在我国北方汉族群体中的分布规律和特征,为HLA-Cw*座位的相关研究提供了依据.
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罕见的ins(22;9)t(9;13)/Ph-慢性髓系白血病实验研究
本文报告1例罕见的具有ins(22;9)t(9;13)的Ph(-)慢性髓系白血病.骨髓细胞经24小时短期培养法制备染色体标本,采用G显带技术进行核型分析;用9号、22号全染色体涂染探针进行染色体涂染;用LSI bcr/ab1 双色双融合探针进行FISH分析;用实时荧光定量PCR法检测bcr/ab1融合基因转录本及其拷贝数.结果表明,染色体核型为45,XX,der(9)t(9;13)(q34;q10),-13[20],abl基因插入到der(22)形成插入性的bcr/ab1基因重排;实时荧光定量PCR检测到bcr/ab1融合基因.结论:插入性的bcr/ab1基因重排是t(9;22)的一种罕见的变异类型,可用分子学方法检测,但全染色体涂染及常规的染色体显带分析容易导致误诊.
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核糖体蛋白RPL36A siRNA对U937细胞的促增殖、抑凋亡作用
本研究探讨RPL36A基因在急性髓系白血病(AML)病人的表达情况及可能的作用机制.应用RT.PCR检测急性髓系白血病细胞、正常人单个核细胞、U937细胞中RPL36A基因的表达情况;RPL36A siRNA经脂质体介导转入U937细胞,采用MTT法及DNA倍体分析检测细胞增殖.AO/EB、TUNEL、Annexin V/FITV检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blot检测RPL36A基因及蛋白表达水平的变化.结果表明:RPL36A在初治AML细胞和U937细胞中表达明显增高;MTT法及DNA倍体分析发现,U937细胞增殖受到抑制.细胞周期阻滞;AO/EB染色、TUNEL、Annexin V/FTTV检测显示,转染RPL36A siRNA的细胞组凋亡率高于对照组;RPL36A siRNA作用可引起U937细胞的RPL36A的mRNA水平的降低和蛋白表达量的下降,且呈时间依赖性(r分别为0.9813和0.9537).结论:AML细胞高表达RPL36A基因,RPL36A基因的高表达可能促进AML细胞的过度增殖并抑制其凋亡.
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NF-κB mRNA在急性髓系白血病中的表达
本研究目的旨在应用实时定量PCR技术(qPCR)检测急性髓系白血病(AML)患者NF-κB mRNA的表达,以揭示NF-κB在AML发病中的作用.收集60例初诊AML患者的新鲜骨髓,用TRIzoL一步法提取总RNA,合成cDNA,以GAPDH为内参照进行荧光定量检测NF-κB mRNA的表达;在实验中选择12例正常人作为对照.结果表明,NF-κB mRNA在AML患者中的表达高于正常人,差异显著(p<0.05).M4,M5亚型的NF-κB mRNA表达高于M1,M2,M3亚型组.结论:NF-κB在AML中表达升高,其表达上调在AML的发病中可能起了重要作用.
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经裸鼠体内多次传代所致的高致瘤HL-60细胞模型的建立及其细胞生物学特征
本研究探讨裸鼠体内多次传代的高致瘤性HL-60细胞的生物特性的变化,探索高致瘤性HL-60细胞致瘤率提高的机制.用裸鼠体内和体外传代方法建立高致瘤性白血病细胞系HL-60模型,并对其生物特性改变进行比较.用台盼蓝染色法检测HL-60细胞生长水平,流式细胞术分析细胞周期,电子显微镜观察HL-60细胞的超微结构和荧光水平.结果表明:细胞生长速度加快,细胞群体倍增时间缩短;S期细胞比率有上升的超势.细胞线粒体数目显著下降(p<0.01),且多数内室扩张,嵴数目减少,有的空泡化;细胞微丝荧光减弱,差异显著(p<0.01);克隆形成率有明显的增加.结论:裸鼠体内多次传代的HL-60细胞高致瘤性与致瘤细胞增殖能力增强,细胞中线粒体数目与结构的改变和细胞骨架微丝的变化有关.
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rhG-CSF动员对异基因造血干细胞移植供者外周血CD4+T细胞S1P1表达的影响
CD4+T细胞主要通过其表面的SIP1受体与外界的第一信使1磷酸鞘氨醇(SIP)相互作用调节免疫功能.本研究旨在探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员对异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)供者外周血CD4+T细胞S1P1表达的影响.17例allo-HSCT供者于rhG-CSF动员前及动员后第4天采集外周血,使用磁珠分选法纯化CD4+T细胞,提取微量RNA,用实时定量PCR法检测S1P1的表达.结果显示,rhG-CSF动员前后CD4+T细胞均表达S1P1,且动员后SIP1在CD4+T细胞中的表达明显低于动员前.结论:rhG-CSF动员使alloHSCT供者外周血CD4+T细胞SIP1的表达明显下调.
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前列腺素E2对Thl/Th2和Tcl/Tc2淋巴细胞免疫平衡的调节
本研究探讨前列腺素E2(PGE2)对外周血T淋巴细胞体外增殖的影响,以及对Th1/Th2和Tc1/Tc2细胞的免疫平衡的调节作用.不同浓度PGE2与抗CD3和抗CD28单克隆抗体(mAb)和健康成人外周血单个核细胞(MNC)共同培养120小时,测定细胞增殖程度.ELISA方法测定24、48、72和120小时细胞培养上清液中IFN-γ 和IL-4浓度变化.流式细胞仪测定CD4+ IL-4+T细胞和CD4+IFN-γ+T细胞以及CD8+IL-4+T细胞和CD8+IFN-γ+T细胞比值.各实验均以不加PGE2为对照.结果表明:①随PGE2的浓度增加,T细胞体外增殖的抑制率明显增高(p=0.001);T细胞增殖抑制率与PGE2浓度之间呈明显的正相关(r=0.889,p=0.000).②实验组培养120小时的IFN-γ浓度与第72小时的IFN-γ浓度差异无显著性(p=0.917),对照组细胞培养上清液中的IFNN-γ浓度随时间持续增高(p=0.046);实验组不同时间的IFN-γ浓度均明显低于对照组(p<0.05).实验组在不同时间产生IL-4浓度无明显变化(p=0.400);对照组24小时细胞培养上清中IL-4浓度高于48、72和120小时(p值分别为0.007、0.003和0.002):实验组细胞培养24小时时几4浓度明显低于对照组(p=0.037);实验组细胞培养48、72和120小时与对照组IL-4浓度差异无显著性(p>0.05).③实验组与对照组CD4+IFN-γ+T细胞的比例无明显变化(p=0.767);实验组CD4+IL-4+T细胞比例略高于对照组(p=0.051);实验组CD4+IL-4+T细胞与CD4+IFN-γ+T细胞的比值明显高于对照组(p=0.011).实验组与对照组CD8+IFN-γ+T细胞的比例无明显变化(p=0.441);实验组CD8+IL-4+T细胞的比例明显高于对照组(p=0.015);实验组CD8+IL-4+T细胞与CD8+IFN-γ+T细胞的比值明显高于对照组(p=0.038).结论:PGE2体外抑制外周血T细胞的增殖;PGE2作用24小时即可抑制IFN-γ和IL-4的产生,并且明显影响T细胞IFN-γ的高峰出现,对IFN-γ具有持续性的抑制作用,对IL-4的持续性影响并不明显;PGE2使CD4+IL-4+T细胞与CIM+IFN-γ+T细胞的比值和CD8+IL-4+T细胞与CD8+IFN-γ+T细胞的比值增加,调节T细胞的免疫反应向Th2/Tc2方向发展.
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NK细胞活化受体及配体在急性白血病患者外周血中的表达和脱离
本研究旨在从NK细胞活化性受体NKG2D及其相应配体-MICA/B、ULBP-1、2、3的表达和血清中脱离情况来探讨急性白血病患者NK细胞免疫防御功能损伤的可能机制.选择30例初发未治疗的急性白血病患者作为观察对象,10例健康者作为对照,应用流式细胞术检测白血病细胞表面MICA/B,ULBP-1、2、3表达水平,用ELISA法检测血清可溶性MICA、MICB(sMICA,sMICB)及可溶性ULBP1-3(sULBPI13)水平.结果表明,急性白血病患者NK细胞NKG2D的表达低于正常对照组;急性白血病患者白血病细胞表面不表达或弱表达MICA/B、ULBP1-3;急性白血病患者血清中游离的sMICA和sMICB水平均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01),血清sULBP1-3水平与时照组无明显差异.结论:急性白血病细胞表面MICA和MICB的脱离及ULBP表达缺乏可能是急性白血病细胞发生免疫逃逸的机制之一.
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CsA,MTX,MMF联合ATG预防非亲缘供者外周血造血干细胞移植后GVHD的疗效观察
本研究旨在探讨非亲缘供者外周血造血干细胞移植(URD-PBSCT)后的移植物抗宿主病(GVHD)预防方法、疗效及其对患者生存、复发的影响.对我院HLA高分辨相合或1个位点不合URD-PBSCT患者33例的临床资料进行总结.主要比较了不同GVHD防治方法下的GVHD发生率、疾病的复发率及患者的生存率.GVHD防治方法:环孢素A(CsA)+短疗程甲氨喋呤(MTX)+霉酚酸酯(MMF)+抗胸腺细胞球蛋白(URD-ATG组),其中13例加用CD25单克隆抗体(URD-ATG+CD25组).结果显示,移植后所有患者100%植入,造血重建顺利.URD-ATG+CD25组、URD-ATG组急性GVHD的发生率分别为23.07%、45%%,慢性GVHD的发生率分别为0和47.4%,后者均显著高于前者(p<0.05);疾病的复发率分别为53.84%、15%,前者显著高于后者(p<0.05).根据移植前患者疾病状态(稳定、进展)分层分析显示,进展期疾病的复发率显著高于稳定期(p<0.01),而URD-ATG+CD25组进展期疾病的复发率高达100%.URD-ATG+CD25组和URD-ATG组患者的1年总生存率(OS)分别为53.8%、75%;5年OS分别为38.5%、65%,URD-ATG组高于URD-ATG+CD25组(p<0.05);同时移植前疾病进展期患者的生存率显著下降.结论:在HLA相合或1个位点不合的URD-PBSCT中采用CsA+MTX+MMF+ATG的GVHD防治措施是安全可行的,对于进展期患者可考虑进一步减少ATG用量以减少复发,提高存活.
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6年随访1例伴染色体1,11核型异常演变的骨髓增生异常综合征
本研究探讨骨髓增生异常综合症-原始细胞增多型(MDS-RAEB)患者的染色体核型演变与疾病进展的关系.通过对1例MDS-RAEB-Ⅱ患者长达6年的随访,动态检测染色体核型、骨髓以及血常规,并采用荧光原位杂交技术(FISH)对患者的异常核型进行验证.结果表明,随访72个月中发现急性髓系白血病型化疗对患者无效,而全反式维甲酸、6-巯基嘌呤的诱导及支持治疗对患者有效.在初诊时为正常男性核型,病程第48月出现核型演变46,XY,2q+[1]/46,XY[19],第56月演变为46,XY,dup(1q)[3]/46,XY[7],第68月出现以dup(1)和der(11)为主的复杂染色体异常,并有血小板进行性下降.结论:染色体核型的演变与骨髓增生异常综合症疾病的进展可能有相关性.
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28例噬血细胞性淋巴组织细胞增多症临床分析
为了深入认识噬血细胞性淋巴细胞组织增多症(hemophagocytic lymphohistocytosis syndrome,HLH)的临床和实验室特征及疾病的诱因,对28例HLH患者进行了回顾性分析.结果表明,所有患者均有持续1周以上的发热、全血细胞减少、铁蛋白升高、低纤维蛋白原血症及肝功能障碍表现,部分患者尚有以下特点:9例HLH为恶性淋巴瘤的前期表现,1例以类似于暴发性肝功能衰竭的临床表现起病,1例以明显的精神异常为主要表现而在脑脊液中查见有明确的噬血细胞,1例因淋巴结活检发现噬血现象而确诊.另外,28例HLH的发生源自不同的诱因.其中EB病毒感染11例、杜氏利什曼原虫感染2例、淋巴瘤11例(以T细胞性淋巴瘤为主)、自身免疫病3例.结论:HLH临床表现与诱因具有高度异质性,来自牧区的患者需除外寄生虫感染(如利什曼原虫)的可能.
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多发性骨髓瘤伴椎管浸润10例临床分析
本研究旨在分析多发性骨髓瘤(MM)伴椎管浸润的临床特点,提高对多发性骨髓瘤(MM)伴椎管浸润的认识,减少漏诊的发生.对我科2007年6月至2009年9月收治的10例MM伴椎管浸润的患者,进行骨髓细胞学、血常规、肝肾功能、电解质、β2微球蛋白、C-反应蛋白及免疫球蛋白(M蛋白)水平的检测;对髓外受累部位进行MRl或CT等影像学检查;按照国际分期系统(ISS)及Durie-Salmon分期系统进行分期并分析其临床资料.结果表明:在10例椎管浸润的患者中,累及胸髓的7例,腰髓的2例,骶髓1例.用手术以及含有硼替佐米的方案或顺铂、异环磷酰胺、足叶乙甙、泼尼松(DECP)对该类患者进行治疗,总有效率为8/10.未出现严重不良反应.结论:MM伴椎管浸润患者应及早发现、及早治疗,一旦出现截瘫则治疗效果差、进展迅速、难以恢复,而早期治疗可得到较好疗效.
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网织血小板检测在血小板减少症病因鉴别中的意义
本研究探讨外周血网织血小板(RP)检测对各型血小板减少症的鉴别意义.以恶嗪为RNA荧光染料,使用Sysmes XE2100血液细胞分析仪测定137例血小板减少症患者与187名正常人(对照组)外周血的RP绝对值及其与总血小板数量的比值(IPF).结果表明,免疫性血小板减少症(TTP组)共109例,IPF为(10.28±7.84)%,显著高于对照组的IPF(1.07±0.82)%(p<0.01).RP绝对值高于对照组,差异有统计学意义(p=0.036).在rrP组中,原发性ITP(PITP)组IPF为(10.47±7.69)%,继发性ITP(SITP)组IPF为(9.45±8.69)%,两组与对照组比较,差异有统计学意义(p<0.01),而PTTP与SITP组之间IPF值无显著差异(p=0.635).骨髓增生低下组共28例,IPF为(2.37±1.13)%,较对照组增高,但两者之间差异无统计学意义(p=0.252),RP绝对值则显著低于对照组(p<0.05).IPF佳临界值为2.45%.该点灵敏度92.7%,特异度94.1%.结论:IPF检测可作为一个鉴别血小板减少症患者骨髓增生及血小板生成情况良好的初筛指标.
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多参数流式细胞术检测B细胞非霍奇金淋巴瘤骨髓侵犯
本研究比较多参数流式细胞术(MPFC)与骨髓细胞形态学分析(BMA)检测B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)骨髓侵犯的临床价值.采用MPFC与BMA对96例B-NHL患者治疗前的骨髓同时进行检测,并进行二者之间的比较.96份骨髓标本中,BMA检测阳性者12例(12.5%),MPFC检测阳性者38例(39.6%),二者比较差异有显著性(p<0.05),12例BMA检测阳性者MPFC检测均为阳性.MPFC检测阴性的患者与MPFC检测阳性的患者的3年预计总生存率无明显差异,但它们的4年预计总生存率分别为(73.18±6.65)%和(44.13±19.55)%,二者差异显著(p<0.05).结论:MPFC检测B-NHL骨髓侵犯的敏感性高于骨髓细胞形态学检测,MPFC检测阴性患者的4年平均生存率显著高于MPFC检测阳性患者,MPFC检测淋巴瘤骨髓侵犯可能成为淋巴瘤临床分期和预后判断的有效指标之一.
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CD20阳性成人急性B淋巴细胞白血病患者临床特点及生存分析
本研究分析成人CD20阳性急性B淋巴细胞白血病(B-lineage acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)患者的临床特点和生存情况.回顾性总结分析郑州大学第一附属医院血液科2004年5月至2008年12月收治的119例成人B-ALL患者的临床特点和生存情况.结果表明:119例成人B-ALL中CIY20阳性40例(33.61%),CD20阴性者79例(66.39%),CD20阳性组和CIY20阴性组男性患者比例分别为72.50%和50.63%(p<0.05),CD20阳性组和CD20阴性组发病时外周血白细胞数分别为(27.35 ±30.29)×109/L和(50.11 ±81.72)×109/L(p<0.05).两组患者在年龄分布、肝脾、淋巴结和中枢神经系统浸润、发病时血红蛋白和血小板水平、髓系抗原表达、Ph染色体、超二倍体和正常核型比例、4周内完全缓解率、诱导死亡率和复发率方面的差异无统计学意义(p>0.05);Kaplan-Meier曲线生存率分析显示,C020阳性组和CD20阴性组成人B-Lin ALL的中位总体生存(OS)时间分别为11.0个月和12.0个月,3年总生存率分别为28%和20%,两组间差异无统计学意义(p=0.832).结论:CD20在成人B-ALL中的表达与患者的性别分布、外周血白细胞数相关,与其它临床特点无显著相关性,对患者的预后无显著影响.
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干扰素-α2b对慢性髓系白血病抗血管生成作用的体外研究
本研究旨在应用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及K562细胞探讨干扰素-α2b在慢性髓系白血病(CML)中抗血管生成作用.用ELISA法检测K562细胞系培养上清液中VEGF和bFGF水平;应用real-time RT-PCR法检测103、102、10 U/ml IFN-α2b作用K562细胞24、36、48小时VEGF、bFGF mRNA的表达;通过MTT法、Transwell室及体外微管形成实验研究K562细胞培养上清液及IFN-α2b对HUVEC增殖、迁移及体外分化的影响.结果表明:K562细胞系表达和分泌VEGF和bFGF,细胞培养上清液能明显促进HUVEC的增殖、迁移、体外微管形成,其作用随着细胞培养上清液浓度的增加而增强;IFN-α 10 U/ml作用K562细胞24、36、48小时,VEGF相对表达量为1.64±0.18、1.49士0.14、1.31±0.05,bFGF相对表达量分别为1.53±0.10、1.29±0.15、0.79±0.13(p=0.002),随着药物浓度增高,细胞VEGF、bFGF相对表达量无明显差异.结论:CML存在血管新生,K562细胞分泌和表达促血管新生因子VEGF和bFGF,促进HUVEC的增殖、迁移、体外微管形成,干扰素通过抑制HUVEC的增殖、迁移、微管形成,下调K562细胞VEGF和bFGF mRNA表达,具有一定程度的抗血管新生作用.
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葛根总黄酮对不同急性髓系白血病细胞株增殖抑制的影响
为了探讨葛根总黄酮对急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的作用及其可能的机制,观察不同浓度葛根总黄酮体外对4种AML细胞株Kasumi-1、HL-60、NIM和U937的增殖抑制影响和细胞周期的变化.应用MTT法检测细胞株细胞的增殖抑制作用.用流式细胞术检测细胞周期的变化.结果表明:一定浓度葛根总黄酮对4种AML细胞株增殖抑制作用差异显著,抑制强度依次为NIM细胞>Kasumi-1细胞>U937细胞>HL-60细胞;葛根总黄酮不同程度地改变NB4、Kasumi-1、U937及HL-60细胞周期进程,使G1期细胞比例下降,S期细胞比例增高,出现亚二倍体峰,呈现浓度依赖性.结论:葛根总黄酮体外对不同AML细胞株具有选择性增殖抑制作用,以对N1M细胞株的影响为显著.
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全反式维甲酸诱导APL细胞分化过程中钙信号途径基因表达水平的变化
为研究钙信号途径在髓系分化中的作用,采用基因芯片技术检测了钙信号途径相关基因在全反式雏甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒细胞性白血痛(APL)细胞株NB4细胞分化过程中的表达情况,并运用实时定量RT-PCR验证基因芯片部分结果,同时检测这些基因在ATRA和8-CPT-cAMP单独和联合作用于NB4-R1细胞和ATRA诱导APL初诊患者原代细胞分化时的表达情况.结果发现:在ATRA诱导NB4细胞分化过程中,许多能直接调节胞内钙离子浓度的基因发生了变化,同时发现许多钙信号途径下游的效应分子的表达上调,并得到实时定量RT-PCR验证.这些基因在ATRA和8-CPT-cAMP单独作用于NB4-R1细胞时变化不大,而在ATRA和8-CPT-cAMP联合作用于NB4-R1细胞分化时与ATRA诱导NB4细胞分化时的表达变化相似.另外,以上基因在ATRA诱导APL初诊患者原代细胞分化的变化情况与诱导NB4细胞分化时相似.结论:钙信号途径可能参与了ATRA诱导的APL细胞分化.
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重组人PDCD5蛋白对U937细胞化疗的增敏作用及机制
本研究探讨重组人PDCD5(rhPDCD5)蛋白对U937血液肿瘤细胞化疗增敏作用的机制.利用流式细胞术检测rhPDCD5蛋白对化疗药诱导的细胞凋亡以及细胞周期的影响;用Hochest33258荧光染色观察细胞凋亡的形态变化;用caspase-3荧光活性检测分析rhPDCD5蛋白诱导凋亡的可能机制;用RT-PCR检测rhPDCD5蛋白对耐药基因表达的影响.结果表明:rhPDCD5蛋白可以通过caspase-3相关的途径促进化疗药诱导的U937细胞凋亡.增强化疗药对细胞周期的阻滞作用.另外,rhPDCD5蛋白也能通过减少耐药基因的表达而增强肿瘤细胞对化疗药的敏感性. 结论:rhPDCD5蛋白的作用机制比较复杂,它可能通过促进凋亡、影响细胞周期、逆转耐药等途径发挥化疗增敏作用.
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表没食子儿茶素没食子酸酯对人急性单核细胞白血病细胞株U937的作用及机制研究
本研究探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人急性单核细胞白血病细胞株U937的作用.采用磺酰罗丹明B(SRB)法检测EGCG对U937细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测EGCG对U937细胞周期的影响;采用RT-PCR、Westren blot法分别检测p16 mRNA、蛋白的表达;采用nMSP法检测U937细胞p16甲基化状态变化;采用RT-PCR法检测DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNMT3A、DNMT3B基因mRNA的表达.结果表明:EGCG可以剂量依赖性和时间依赖性地抑制U937细胞增殖(r=0.71),且呈剂量依赖性诱导G0/G1期细胞阻滞;EGCG可以呈剂量依赖性上调U937细胞p16 mRNA、蛋白的表达;EGCG可以呈剂量依赖性减弱U937细胞p16甲基化程度;EGCG可以剂量依赖性地下调U937细胞DNMq3A、DNMT3B mRNA表达,而对DNMT1 mRNA的表达无影响.结论:EGCG在体外通过抑制DNMT3A、DNMT3B和(或)直接使异常高甲基化的p16启动子CpG岛DNA去甲基化,恢复p16 mRNA水平和蛋白水平的表达,调控U937细胞阻滞于G0/G1期,抑制U937细胞的增长.
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Notch通路与骨髓基质细胞衰老的关系探讨
本研究探讨Notch通路活化与骨髓基质细胞衰老的关系.用脂质体转染法将Notch1胞内区(ICN)转入体外培养的小鼠骨髓基质细胞,转染后3天,用MTT法检测细胞增殖率;用流式细胞术检测细胞周期分布;用细胞化学法检测衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated β galactosidase,SA-β-ga1)阳性细胞百分率;用RT-PCR及Western blot法分别检测周期蛋白激酶抑制因子P53、p21cip1/waf1基因水平和蛋白水平的表达.结果表明,ICN转染入小鼠骨髓基质细胞后3天,骨髓基质细胞增殖受抑,细胞周期阻滞在Gl期,sA-β-gal阳性细胞百分率增加,无论从基因水平还是蛋白水平均显示P53、p21Cip1/Waf1表达增高,与未转染组及转空质粒组相比差异均具有统计学意义.结论:Notch通路活化可导致骨髓基质细胞衰老,这种作用可能是通过增加p53、p21Cip1/Waf1蛋白的表达实现的.
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人骨髓瘤细胞株基因表达谱经沙利度胺诱导的变化
本研究通过检测沙利度胺(thalidomide,TLD)作用于多发性骨髓瘤细胞株RPMI-8226后基因表达谱的改变,探索TLD抗骨髓瘤作用的分子机制.通过逆转录PCR,将TLD处理前后的人骨髓瘤细胞株RPMI-8226的mRNA分别制备成2种探针,应用Cy3和Cy5荧光染料分别标记,随后与包含1 152条待研究的人类基因表达谱基因芯片杂交,通过扫描和计算机软件分析,寻找经TLD作用后表达有差异的基因,并分析这些差异表达基因的功能.结果表明,100 μmol/L TLD作用于RPMl8226细胞72小时后,筛选出22个差异表达基因,其中4个基因下调,分别为rpB2、scya3、mmpl和igbpl基因,18个基因表达上调,其中主要为wars、tubb4q、ubelI、txrtrdl和fyb基因等5个基因表达明显上调.研究显示:①TLD能使编码色氨酸-tRNA合成酶的wars基因表达上调,同时使编码基质金属蛋白酶1的mmpl表述下调,这2个基因的变化可能与TLD抑制血管生成的作用有关;②TLD能使编码巨噬细胞炎症反应蛋白1a(MIP-1a)的scya3和编码免疫球蛋白结合蛋白1的igbpl表达下调,其表达下降可能参与了TLD抑制细胞增殖的过程;③TLD能诱导编码微管蛋白β4的tubb4q、编码泛索激活酶E1相关蛋白的ubell 和编码硫氧还蛋白还原酶1(TRl)的txnrdl表达上调,这些基因的表达变化与TLD的促凋亡作用有关;④TLD能使编码酪氨酸激酶Fyn结合蛋白(Fyb)的fyb表达上调,该基因的表达上调与TLD杀伤骨髓瘤细胞的作用有关.结论:22个差异表达基因通过不同的作用环节和途径发挥抗骨髓瘤功能,它们分别涉及到蛋白质的合成和降解、细胞信号转导、细胞骨架运动、免疫调节、细胞代谢、抑癌基因的调控、细胞凋亡等方面,直接或间接与TLD的分子作用机制有关.
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重型再生障碍性贫血发病相关T淋巴细胞基因表达谱的生物信息学分析及作为药物筛选新方法的探索
本研究初步探索重型再生障碍性贫血(Severe aplasdc anemia,SAA)发病相关的T淋巴细胞基因表达谱特征,并根据药物与疾病基因表达谱相似性对比的原理,探索SAA治疗药物新的筛选方法.以SAA和T淋巴细胞为关键词,在人类基因表达数据库和基因芯片数据库中检索与SAA发病相关的基因表达数据库,并对此基因表达数据库进行显著性检验后筛选与SAA发病相关的基因表达谱,并进行聚类分析.然后,在3 000种药物基因表达谱数据库中筛选与SAA发病相关基因表达谱特征相反者.结果表明,在上述数据库中检索到1个满足条件的相关基因表达数据库GSE3807.与SAA发病相关的T淋巴细胞基因一共有515个(表达水平变化超过2倍),其中上调者202个,下调者313个.聚类分析发现,这些基因分别属于核酸代谢、泛素依赖的蛋白降解通路、免疫球蛋白/主要组织相容性复合体、高尔基体蛋白运输以及蛋白质磷酸化等通路.SAA发病相关基因与药物基因表达谱相似性分析发现,羟基喜树碱、盐酸二甲双胍可能具有治疗SAA的作用.结论:采用生物信息学方法,比较疾病发病相关基因表达谱与药物基因表达谱的相似性,有可能成为SAA治疗药物筛选的新方法.
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人ID4基因表达调控启动子及其亚克隆荧光素酶报道重组子的构建
本研究旨在克隆ID4基因启动子及上游调控序列,并构建一系列启动子亚克隆-pGL3 Basic荧光素酶报道重组子,以探讨ID4基因表达调控机制.方法与结果:以ID4基因cDNA全长作为探针,在NCBI的人类基因组数据库中搜索并下载ID4基因转录起始位点上游5'侧翼区约2242 bp及下游5'非翻译区212 bp的基因组序列;利用TESS和Genomax等在线启动子分析软件进行启动子及上游调控元件的特征分析,据此设计PCR引物,采用分段扩增法,获得了2条长度分别为1 829 bp和784 bp的产物片段,分别插入pGEM-T载体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之先后应用KpnI/NheI、KpnVEcom对获得的2个pCEMT重组载体及pGL3 Basic荧光素酶报道重组载体进行双酶切,用T4 DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性茼落,成功构建了人ID4基因启动子-pGL3 Basic荧光素酶报道重组子;经Kpnl/NheI双酶切和测序鉴定,获得了与GenBank相应序列一致、长度为2 459 bp的目的片段;以此片段为模板,相隔400 bp左右设计了5对3'端平齐、5'端不同的PCR引物,进行半巢式PCR扩增,获得5条长度分别为2 112 bp、1 703 bp、1 290 bp、784 bp和496 bp片段,回收纯化后分别插入pGEM-T栽体,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落;继之用KpnI/NheI对获得的5个pGEMT 重组载体及pet3 Basic荧光素酶报道载体双酶切,T4 DNA连接酶连接,转化至TOP10感受态大肠杆菌,筛选阳性菌落,经KpnI/NheI双酶切和测序鉴定.结论:成功克隆了长度为2.5 kb的ID4基因启动子及上游表达调控序列,构建了一系列ID4启动子亚克隆-pCt3-Basic荧光素酶报道重组子.
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AS203逆转人恶性淋巴瘤CA46细胞系p16基因甲基化状态及激活转录的实验研究
本研究旨在探讨三氧化二砷(AS2O3)逆转恶性淋巴瘤CA46细胞株p16基因甲基化状态和调节转录作用及其可能的机制.以高甲基化的恶性淋巴瘤细胞株CA46作为研究基因甲基化与表达关系的实验对象.采用SRB法检测AS2O3对人恶性淋巴瘤CA46细胞系增殖、活力的影响;nMSP法检测药物作用后p16甲基化状态变化;RT-PCR法检测p16、甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达;利用流式细胞术DNA倍体分析法探讨AS2O3,对恶性淋巴瘤细胞周期的影响.结果表明:①AS2O3作用CA46细胞株72小时后p16基因甲基化程度明显减弱,p16基因异常甲基化的现象被逆转;②未处理组细胞p16基因呈微弱表达,AS2O3作用72小时后p16基因表达增强,0.5 μmol/L组、1.0μmol/L组和2.0μmol/L组p16基因表达阳性条带与β-actin灰度的比值分别为(0.33±0.10)、(0.57±0.11)、(0.67±0.09),阳性对照灰度比值为(0.73±0.13),差异有统计学意义(p<0.01);③与未处理组相比,AS2O3作用72小时后甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B的表达下降并呈浓度依赖性,而DNMTI表达不受影响;④与对照组相比,3组不同浓度AS2O3均能明显抑制肿瘤细胞生长,G0/G1期细胞增加.结论:AS2O3可能通过抑制甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B或(和)直接逆转p16基因甲基化状态,使p16基因表达上调,并恢复其活性,从而实现其细胞周期调控功能,将细胞阻滞于G0/G1期,抑制肿瘤细胞的增长.
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脐血造血干/祖细胞部分归巢受体功能缺陷的研究
本研究旨在了解来源于脐血造血干细胞表面部分归巢受体(homing receptor)的功能缺陷并探讨体外干预的效果和可行性.用流式细胞术对来源于脐血的CD34+造血干/祖细胞表面的P、E选择蛋白配体活性基团表达、CD26的表达及活性进行检测,同时检测骨髓和外周血作为对照.采用岩藻糖基转移酶体外处理脐血CD34+造血干/祖细胞并检测其表面选择蛋白配体活性基团的表达水平.结果表明,CD26在脐血、骨髓及外周血的CD34+造血干/祖细胞表面的表达率分另q为:(7.62±0.63)%,(6.35 ±0.89)%和(6.18±0.91)%(P>0.05),其活性分别为:67.15 U/1 000个细胞(1 U=1 pmol/min),26.85 U/1 000个细胞和20.95 U/1 000个细胞,脐血CD34+造血干/祖细胞表面CD26的活性明显高于其它两者(p<0.001).P选择蛋白配体活性基团在脐血、骨髓和外周血CD34+造血干/祖细胞表面的表达率分别为:(83.46±6.33)%,(15.65±0.89)%和(80.17±6.85)%;E选择蛋白配体活性基团的表达率为:(25.31 ±1.03)%,(26.34±0.89)%和(29.79 ±1.78)%(P>0.05).脐血CD34+细胞体外行岩藻糖基化工程后,E选择蛋白配体活性基团表达率由(25.31±1.03)%提高至(63.23±1.08)%.结论:3种不同来源CD34+造血干/祖细胞表面的CD26分子表达无明显差别,但其活性不一.脐血的CD34+造血干/祖细胞CD26活性高,骨髓的次之,外周血的低.P选择蛋白配体活性基团在脐血及外周血CD34+造血干/祖细胞表面的表达无明显差别,但在骨髓干细胞表面表达偏低.体外经岩藻糖基化工程处理的脐血CD34+造血干/祖细胞可明显上调其表面E选择蛋白配体活性基团的表达.
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过氧化氢酶在人脐带间充质干细胞中作用的研究
本研究通过携带过氧化氢酶(catalase,CAT)基因的逆转录病毒载体转染人脐带组织源间充质干细胞(UC-MSC),探讨CAT对人UC-MSC增殖以及多向分化潜能的影响.将携带绿色荧光蛋白(GFP)空载体质粒pMSCV-GFP和携带CAT基因的pMSCV-GFP-CAT逆转录病毒载体分别转染体外培养的人UC-MSC,用流式细胞仪分析并分选获得MSC-GFP、MSC-GFP-CAT两种细胞株;用过氧化氢酶检测试剂盒检测上述细胞株和UC.MSC中过氧化氢酶活力;用cell counting kit-8检测转染后细胞的增殖能力;用von Kossa和油红O染色观察成骨和成脂定向诱导分化.结果表明:转染48小时后即可观察到UC-MSC发出绿色荧光,3天后达到稳定状态,随着细胞的传代荧光强度不会减弱.流式细胞仪检测GFP+转染率显示,MSC-GFP为(25.54 ±8.65)%,MSC-GFP-CAT为(35.4±18.57)%;体外传代培养后检测UC-MSC、MSC-GFP、MSC-GFP-CAT细胞CAT活性分别为:19.5、20.3、67.2 U;MSC-GFP-CAT能被诱导分化为成骨和脂肪细胞;携带CAT基因载体转染对UC-MSC的增殖无显著影响(p>0.05).结论:成功获得高表达CAT的UC-MSC,其CAT的表达水平为对照组的3.4倍.转染对UC-MSC的增殖和分化能力无显著影响,基因转移使UC-MSC保留了成骨和成脂的能力.
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脐血造血细胞体外扩增过程中DNA损伤的研究
本研究检测脐血(CB)单个核细胞(MNC)体外培养DNA损伤情况,以探讨体外培养的佳收获时机.脐血MNC分别接种于含细胞因子无血清培养体系并进行集落接种,分别在0、7、14及21天收集细胞,用流式细胞仪检测CD34+及CD133+细胞数,采用单细胞凝胶电泳试验检测培养后不同时间点脐血造血细胞及集落细胞的DNA链断裂损伤情况.结果表明,体外短期培养(14天内)时,脐血CD34+及CD133+细胞数多.脐血细胞DNA损伤率均低于5.0%,21天时CD34+及CD133+细胞数降到低于0天的比例,细胞DNA损伤率为28.2%,DNA损伤率比0天时高(p=0.000),损伤细胞彗星尾长度明显大于0天(p=0.000);而其余各培养时间点(7天和14天)损伤细胞彗星尾长度与培养0天组损伤细胞的彗星尾长度比较,差异无统计学意义(p=0.863及p=0.253);集落培养细胞DNA损伤率均低于5.0%.结论:利用本方法进行脐血造血细胞短期(14天)培养DNA损伤率均低于5.0%,但超过14天时DNA损伤明显增加,体外培养的佳收获时机应在14天内.
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兔骨髓源性血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
本研究探讨兔骨髓源性血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)的分离、培养及鉴定方法.抽取兔骨髓细胞,用梯度密度离心法获得单个核细胞,以内皮细胞培养液培养,通过细胞形态观察、免疫组织化学试验、流式细胞术以及内皮祖细胞吞噬功能进行鉴定.结果表明,新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养48小时后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接呈梭形的内皮样细胞.内皮祖细胞免疫组织化学检测结果显示CD133(+),CD34(+),Ⅷ因子(++),KDR(++);流式细胞术鉴定结果显示CD133的阳性率为(18.23±7.12)%,CD34的阳性率为(47.71 ±14.85)%,CD31的阳性率为(71.61 ±13.51)%,KDR的阳性率为(87.24 ±11.40)%.细胞吞噬功能鉴定说明超过80%的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-acLDL和FITC-UEA-1.结论:密度梯度离心法体外分离兔骨髓源的单个核细胞,在一定的诱导培养条件下能分化成为血管内皮祖细胞.
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β-榄香烯对人骨髓瘤细胞RPMI-8226增殖与凋亡的影响
为了研究β-榄香烯对人骨髓瘤细胞系RPMI-8226增殖、凋亡的影响,探讨其作用的分子机制.用MTT法检测β-榄香烯对人骨髓瘤细胞系RPMI-8226增殖的影响;Annexin V/PI双染色流式术检测β-榄香烯对RPMI-8226骨髓瘤细胞凋亡的作用;Western blot法检测β-榄香烯对RPMI-8226骨髓瘤细胞BCL-2、caspase-3、DR-4和NF-κB P65蛋白表达影响.结果表明:β-榄香烯对RPMI-8226骨髓瘤细胞生长具有明显抑制作用,且呈浓度和时间依赖性;10-80 μmoVL β-榄香烯作用48小时可诱导骨髓瘤细胞凋亡,凋亡率随药物浓度而递增;β-榄香烯以时间依赖方式上调caspase-3、DR-4蛋白表达,并可下调BCL-2、NF-κB P65蛋白表达.结论:β-榄香烯通过诱导细胞凋亡有效抑制骨髓瘤细胞增殖,其诱导细胞凋亡与细胞内、外凋亡通路激活、抗凋亡机制被抑制有关.
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HSP90表达与人多发性骨髓瘤细胞迁移力的相关性研究
本研究探讨热休克蛋白90(HSP90)与人多发性骨髓瘤细胞迁移力的相关性.采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测经终浓度为50、100、150和200 nmol/L的蛋白酶体抑制剂硼替佐米作用于人多发性骨髓瘤细胞株U266 4小时后细胞中HSP90的mRNA的表达情况.应用Transwell小室迁移实验检测经上述相同浓度硼替佐米作用4小时后U266细胞迁移力的变化.结果表明:随着硼替佐米药物浓度的增加,U266细胞中HSP90α的mRNA表达量逐渐增加(p<0.05),而HSP90β的mRNA表达量虽然总体上有差别(p<0.05),但增加趋势不很明显.随着药物浓度的增加U266细胞迁移力逐渐减弱(p<0.05).结论:HSP90表达与人多发性骨髓瘤细胞迁移力存在相关性.
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多发性骨髓瘤病人骨髓细胞中Cmtm5基因异常低表达
本研究检测cmtm5(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing member 5)基因在多发性骨髓瘤(MM)骨髓细胞中的表达水平,并探索其与临床特征的关系.应用实时定量逆转录-聚合酶链反应(real-time quantitative RT-PCR,RQ-RT-PCR)技术检测MM患者骨髓细胞、MM细胞系及正常人骨髓细胞cmtm5基因的表达.以cmtm5拷贝数与abl拷贝数的比值表示cmtm5基因的相对表达水平.结果表明,51例初治及难治复发MM患者骨髓细胞cmtm5表达量(0.047±0.062)显著低于20例正常人骨髓细胞cmtm5表达量(0.255±0.333,p<0.01).ISS Ⅲ期患者组cmtm5基因表达量(0.034±0.034)显著低于ISS I期患者组的表达量(O.103±0.109,p<0.01).两种人多发性骨髓瘤细胞系RPM18226及CZI的cmtm5基因表达量(为0.014±0.009、0.004±0.006)均低于正常人骨髓细胞.15例治疗有效患者的cman5基因表达量与治疗前及复发时相比显著升高(0.020±0.005;0.227±0.038,p<0.01).cmtm5基因的表达量与骨髓浆细胞比例呈负相关(r=0.307,p<0.05),而与性别、年龄、血红蛋白水平、M蛋白量、免疫球蛋白分型、IgH是否阳性等没有明显的相关性.结论:多发性骨髓瘤患者骨髓细胞cmtm5基因表达水平降低,且与ISS分期有关,与骨髓浆细胞数呈负相关,此结果说明cmtm5基因在MM的发病机制中发挥一定作用.
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Livin在非霍奇金淋巴瘤中表达的临床意义
本研究旨在探讨凋亡抑制因子Livin在非霍奇金淋巴瘤组织中的表达及其临床意义.应用免疫组织化学法检测Livin蛋白在30例非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin'S lymphoma,NHL)患者及11例淋巴结反应性增生(reac-tive hyperplasia of lymph nodc)患者淋巴结中的表达,并应用real-time PCR对其中20例非霍奇金淋巴瘤、10例淋巴结反应性增生及4例正常人的淋巴结组织中Livin mRNA表达水平进行检测,分析livin蛋白和mRNA表达与NHL患者临床表现及其特征的相关性.结果表明,NHL患者淋巴结组织中Livin mRNA表达水平与正常淋巴结组织以及淋巴结反应性增生组织比较均显著增高(RQ中位数分别为12.4 vs 0.34和12.4 vs 0.61)(p<0.01).30例非霍奇金淋巴瘤中有16例Livin蛋白表达阳性,阳性率为53.3%;11例淋巴结反应性增生患者仅1例表达阳性,阳性率为9.1%;而且观察到Livin蛋白主要在细胞浆中表达,在胞核内极少见有表达.研究还显示,无论是LivinmRNA表达还是蛋白表达均与NHL的临床分期(p=0.023;p=0.009)、B症状(p=0.015;P:0.026)、血β2微球蛋白(β2-MG,p=0.031;p=0.012)及血清乳酸脱氢酶(LDH,p=0.037;p=0.007)密切相关,而两者的表达与年龄、性别及分型无明显相关性(p>0.05).结论:Livin mRNA及蛋白在NHL患者中表达增高.并与临床多项指标存在相关性,因此Livin表达水平对评价患者临床分期及预后可能具有重要的指导意义;对Livin在NHL中的作用机制的深入探讨将有助于揭示NHL的发生、发展及治疗的机理,并有望成为NHL未来治疗的重要突破点.
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多发性骨髓瘤免疫表型特征及其意义
本研究探讨多发性骨髓瘤细胞的免疫表型特征及其意义.采用流式细胞仪多参数直接免疫荧光技术、CD45/SSC设门,对31例多发性骨髓瘤患者骨髓瘤细胞标记CD138、CD38、CD56、CD117、HLA-DR、CD3、CD7、CD13、CD33、CD19、CD20、CD22、CD34进行检测,并辅以瘤细胞的形态学检查.结果表明:形态学检查观察到瘤细胞比例为10%-68%,CD45/SSC设门证实可疑瘤细胞比例为9.72%-67.77%;抗原阳性表达比例分别为CD13861.29%,CD38 100%,CD56 46.15%,CD13 70.00%,CD33 29.03%,HLA-DR 74.19%.CD117 33.33%.其余抗原均为阴性表达.结论:CD45/SSC设门技术可以较准确地设定需要分析的多发性骨髓瘤细胞群,与形态学分类瘤细胞的比例相接近;瘤细胞以表达CD138、CD38、CD56抗原为主,部分患者可伴有髓系抗原CD13、CD33、CD117表达,有关这些抗原表达的生物学意义尚待进一步研究.
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血清sRANKL/OPG比值在判断多发性骨髓瘤骨病中的意义
本研究探讨多发性骨髓瘤(MM)患者血清中可溶性核转录因子-κB受体活化因子的配体(sRANKL)和护骨蛋白(OPG)的水平与多发性骨髓瘤骨病(MBD)之间的关系.采用酶联免疫吸附法检测了42例初诊的MM病人(观察组)以及25例健康体检者(对照组)外周血清中sRANKL和OPG的水平以及破骨细胞代谢指标抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRAP-5b)与I型胶原蛋白羧基末端交联肽(CTP-I)的水平,同时根据全身X光摄片判断MM患者骨损害情况并分析sRANKL/OPG比值与TRAP-5b、CTP-I水平和骨损害发生及其程度之间的关系.结果发现:观察组患者血清中sRANKL水平升高(中位水平9.33μg/L),OPG水平下降(中位水平4.931μg/L),sRANKL/ OPG比值明显升高(比值2.65),与对照组相比各对应指标之间的差异均具有显著性(p<0.05);MM患者血清中sRANKL/OPG比值与TRAP-Sb(r=0.512,p<0.05)和CTP-I(r=O.481,p<0.05)水平之间均存在相关性.将观察组患者按有无骨损害分组发现,骨损害组(29例)和无骨损害组(13例)的sRANKL/OPG比值分别为5.13和1.12,有骨损害组的比值明显升高(p<0.05);如果按骨损害程度分组还发现,sRANKL/OPG比值与骨损害程度密切相关(r=0.445,p<0.05),但不同临床分型和不同临床分期(ISS分期)的MM患者之间,血清sRANKL/OPG比值的差异均无统计学意义(p>0.05).结论:MM患者血清中sRANKL/OPG比值明显升高,不仅与破骨细胞代谢增强有关,还与骨损害的发生及其程度相关,所以sRANKL/OPG比值可作为判断MBD的一个参考指标.
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CD44基因沉默对K562/A02细胞逆转耐药及生物学活性的研究
本研究旨在探讨CD44基因表达抑制对白血痛多药耐药细胞株K562/A02耐药性及生物学活性的影响.根据CD44基因表达序列设计有效的RNA干扰片段,将其插入质粒表达载体中,获得针对CD44 mRNA的特异性siRNA真核质粒(pGCsiRNA-CD44),转染K562/A02细胞.用实时荧光定量RT-PCR检测K562/A02细胞CD44、mdr-1和bcl-2 mRNA的表达;用MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术(FACS)检测细胞周期;Hochest 33258染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化.结果表明:针对CD44基因的siRNA真核质粒可有效沉默K562/A02细胞的CD44基因:与对照组相比,转染了4条pGCsiRNA-CD44质粒的K562/A02细胞CD44表达均明显受抑,以转染了siCD44-1的细胞中抑制强.转染pGCsiRNA-CD44质粒48小时后,K562/A02细胞CD44 mRNA表达水平下降64.1%(p<0.05),同时mdr-1与bcl-2 mRNA的表达量较对照组分别下降了25.6%与50.8%;K562/A02细胞IC50为(17.97±1.61)μg/ml,无义序列质粒转染后阿霉素对K562/A02细胞的IC50为(16.95±1.72)μg/ml,pGCsiRNA-CD44转染后IC50明显降低为(8.77±1.63)μg/ml(p<0.01).转染48小时后,G0/G1期细胞比例提高了10.7%;细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变.结论:特异性CD44 siRNA可显著抑制K562/A02细胞CD44基因的表达,抑制细胞增殖,诱导其凋亡.并有效逆转K562/A02细胞的多药耐药性.
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姜黄素诱导维甲酸耐药的NB4-R1细胞凋亡及其机制
为了探讨姜黄素时维甲酸耐药的急性早幼粒细胞白血病细胞生长抑制作用及其机制,以耐药的NB4-R1 细胞为实验对象,用MTT法检测细胞生长情况,用光学显微镜观察细胞形态特征,用流式细胞术测定细胞线粒体电位变化.用Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达水平.结果表明,虽然NB4-R1细胞对维甲酸耐药,但对姜黄素的敏感性与对维甲酸敏感的NB4细胞一致,姜黄素至少对NIM-R1细胞的生长抑制作用呈时间和剂量依赖性.细胞形态学检查显示,经20μg/L姜黄素处理后的细胞内出现凋亡小体.流式细胞术检测发现,NIM-R1细胞经姜黄素处理后线粒体膜电位下降.Western blot检测显示,caspase 3前体表达下降,活化caspase 3表达升高,BCL-XL表达降低,剪切形式的PARP表达水平明显上调.结论:姜黄素能抑制NB4-R1细胞生长并诱导其凋亡.
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多西他赛诱导HL-60/ADR细胞凋亡及对P-gp、BCL-2、BAX蛋白表达的影响
本研究观察多西他赛对白血病耐药细胞株HL-60/ADR诱导凋亡的作用并探讨其对P-gP、BCL-2、BAX蛋白表达的影响,为临床解决白血病耐药问题提供新的思路和理论依据.采用光学显微镜、透射电子显微镜观察细胞形态学改变,Annexin V FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡比率,MTT法检测细胞增殖抑制率,免疫细胞化学染色及计算机图文分析系统检测P-gP、BCL-2、BAX蛋白的表达水平.结果表明:HL-60/ADR细胞高表达P-gp,各浓度组之间P-gP的表达量没有差别.多西他赛对HL-60/ADR细胞生长有明显的抑制作用,并具有浓度和时间依赖性(r=0.853,r=0.989).多西他赛可以诱导HL-60/ADR细胞凋亡,凋亡率没有随浓度变化的趋势.多西他赛作用HL-60/ADR细胞使BCL-2蛋白表达下降,BAX蛋白表达上升.结论:多西他赛可以诱导HL-60/ADR细胞凋亡,使细胞BCL-2蛋白表达下降,BAX蛋白表达上升.
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吉西他滨对HL-60细胞c-myc基因表达的影响及其诱导细胞凋亡作用
本研究探讨吉西他滨对HL-60细胞c-myc基因表达及细胞凋亡的影响及吉西他滨应用于白血病治疗的可行性.体外培养人白血病细胞系HL-60细胞,以不同浓度吉西他滨作用于HL-60细胞.用RT-PCR方法检测细胞c-myc mRNA表达的变化;以Western blot方法检测细胞C-MYC蛋白表达水平;原位酶标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡情况.结果表明,1.0μg/ml吉西他滨作用于HL-60细胞12、24、36、48小时后,不同程度地抑制HL-60细胞c-myc mRNA的表达,并具有时间依赖性,其适作用时间为24小时,与阿糖胞苷(Ara-C)组及空白对照组比较,抑制作用差异有统计学意义(p<0.05).1.0μg/ml吉西他滨作用于HL-60细胞24、48、72小时后,C-MYC蛋白表达水平明显下降,于48小时抑制作用明显,抑制率为94.16%,方差分析显示,各时间点吉西他滨组与空白对照组和Am-C组比较,差异均有统计学意义(p<0.01);吉西他滨作用24小时组、48小时组及72小时组组间比较,也有显著性差异(p<0.01).1.0μg/ml吉西他滨作用于HL-60细胞24小时后,出现明显的诱导细胞凋亡作用,阳性率83.67%,与空白对照组(阳性率3.00%)和Ara-C组(阳性率10.67%)比较差异均有统计学意义(p<0.01).结论:吉西他滨对HL-60细胞c-myc基因及C-MYC蛋白表达有显著的抑制作用,能够诱导HL-60细胞凋亡,其抑制及诱导凋亡作用强于阿糖胞苷,提示吉西他滨可能作为白血病治疗的新选择.
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转染p16、p53对白血病细胞株K562及HL-60的抑制作用
本研究构建p53,p16基因真核表达载体,用脂质体法转染入白血病细胞,观察其在白血病细胞中的表达和对白血病细胞的作用.设计并构建包含野生型p53cDNA与p16cDNA的真核双表达载体pBudCE4.1-53-16,用脂质体法转染白血病细胞,用间接免疫细胞化学法、Western blot法检测鉴定外源性p53及p16的表达情况.通过CCK-8,流式细胞仪检测细胞的生长曲线、细胞周期、细胞凋亡.结果发现:p53 p16基因双表达真核载体构建成功,体外转染入白血病细胞后能检测到外源性P53、P16蛋白在白血病细胞中表达.转染48小时后.试验组与对照组比较,细胞周期阻滞(p<0.001);试验组和对照组比较,细胞增殖下降,细胞凋亡增加(p<0.001).结论:重组质粒pBudCE4.1-53-16构建成功,经体外转染白细胞细胞后2个目的基因能够在细胞中同时表达,并引起细胞周期阻滞于G0期,细胞凋亡增加.
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塞来昔布联合干扰素α对K562细胞增殖、凋亡、细胞周期和CD117表达的影响
本研究探讨塞来昔布(Celecoxib)对K562细胞增殖、凋亡、细胞周期和CD117表达的影响及其与干扰素α(IFN-α)联用的协同作用.通过以不同浓度组合的Celecoxib和IFN-α作用于培养的K562细胞,用MTT比色法观察各组的细胞生长抑制情况,流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡和CD117膜抗原表达情况.结果显示:Cele-coxib可明显抑制K562细胞增殖,抑制效应呈浓度依赖性(r=-0.91).K562细胞培养72小时后,空白对照组、IFN-α组、Celecoxib组和Celecoxib联合IFN-α组的细胞增殖率分别为(96.1±0.5)%、(90.2±0.4)%、(57.2±0.9)%和(21.9±0.3)%;细胞凋亡率分别为(5.5±0.8)%、(6.3±0.6)%、(26.4%±3.9)%和(57.3±4.5)%;K562细胞膜CD117表达率分别为54.7%、10.5%、36.3%和7.3%.两药联用还可使K562细胞阻滞于G0/G1期.结论:Celecoxib和IFN-α不同程度地抑制K562细胞增殖和诱导细胞凋亡、产生G0/G1期阻滞和降低CD117表达,两药联用对上述效应具有协同作用.
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葛根总黄酮诱导人早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞凋亡的实验研究
本研究探讨葛根有效成分对恶性白血病可能的凋亡诱导作用及其分子机制.采用葛根总黄酮(flavonoids of puerarin,PR)处理人早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4,用MTT法检测细胞增殖抑制率;FITC-Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率;实时定量PCR检测pml/rarα、bcl-2、survivin基因表达;Western blot检测.JNK、p38 MAPK、FasL及caspase相关酶的变化.结果发现,PR能明显抑制NB4细胞增殖,并诱导细胞凋亡.随着PR浓度的增加,pmL/rarα、bcl-2及survivin基因在mRNA水平表达下调,JNK、FasL、caspase 3及caspase 8蛋白表达增加,与PR浓度呈正相关;PR联合三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)处理后上述作用更为明显.结论:PR诱导NB4细胞凋亡的机制可能与JNK相关信号分子的活化有关;PR联合ATO具有协同诱导NB4细胞凋亡的作用.
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蛋白酶体抑制剂MG-132诱导L1210细胞凋亡及其机制研究
为了观察蛋白酶体抑制剂MG-132对淋巴细胞白血病细胞株L1210的致凋亡作用.探讨MG-132的致凋亡机制,分别以不同浓度的蛋白酶体抑制剂MG-132处理L1210细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力,应用Annexin-V和PI双染色细胞流式细胞术检测细胞凋亡率,比色法测定细胞中caspase 3的活性,采用Westernblot法检测细胞NF-κB P65核蛋白的表达.结果表明:在相同的作用时间下,随着MG-132浓度的增高(0、2.5、5、10、加μmol/L),细胞增殖抑制率、凋亡率、caspase 3活性逐渐升高;Western-blot法检测显示,细胞NF-κB P65核蛋白表达水平降低.结论:蛋白酶体抑制剂能够诱导L1210细胞凋亡,其机制可能是通过下调NF-κB的表达,进一步活化caspase 3的活性而诱导凋亡.
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雷帕霉素诱导骨髓增生异常综合征MUTZ-1细胞凋亡及机制研究
为了观察雷帕霉素(RAPA)对骨髓增生异常综合征(MDS)细胞系MUTZ-1增殖的抑制、凋亡作用并探讨其相关的机制.用MTT法检测RAPA对MUTZ-1细胞增殖的影响;流式细胞术分析MUTZ-1细胞Annexin V/PI、caspase 3、细胞周期、PTEN、P-Akt和p-mTOR蛋白的表达.结果表明,RAPA能显著抑制MUTZ-1细胞增殖,呈剂量和时间的量效关系(24、48和72小时的r=0.67,0.61和0.72).RAPA作用MUTZ-1细胞24-72小时,G0/G1期细胞较对照组明显增高(p<0.01),随着药物浓度增加而增多(r=0.94、0.93和0.92),细胞周期阻滞在G0/G1期.Annexin V+PI-细胞较对照组增多(p<0.01),且随着浓度的增高而增多(r=0.91、0.94和0.96).PTEN表达荧光强度与对照组比较显著增高(p<0.01),随着药物浓度增高表达增强(r=0.93),p-Akt和p-mTOR表达的荧光强度与时照组比较显著降低(p<0.05),随着药物浓度增高而表达减低(r=0.95和0.91).结论:RAPA与靶分子mTOR作用,抑制PTEN/P13K-Akt/mTOR信号转导通路,诱导MUTZ-1细胞凋亡.
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定量PCR方法用于恶性血液病患者侵袭性真菌感染的诊断研究
本研究建立恶性血液病合并侵袭性真菌感染患者的外周血真菌定量PCR检测方法并初步评价其诊断价值.选取真菌高度保守的区段序列18Sr DNA-ITS1区设计引物及探针,提取真菌菌株DNA进行定量PCR验证引物及探针的敏感性和特异性,利用pGEM-T质粒制备真菌DNA标准品并对患者血液中真菌DNA进行定量测定.结果表明:12株曲霉菌和14株念珠菌定量PCR结果均为阳性;真菌在血浆、单个核细胞和全血中分布差异无统计学意义(p>0.05).真菌定量PCR的ROC曲线分析显示,用于临床诊断侵袭性真菌感染的诊断界值为8 copies/ml全血,其敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、Kappa值分别为0.84,0.9,0.955,0.692,0.679.结论:真菌定量PCR检测可作为恶性血液病患者侵袭性真菌感染的早期诊断手段.
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慢性淋巴细胞白血病间期荧光原位杂交检测染色体异常及临床分析
本研究旨在了解慢性淋巴细胞白血病(CLL)常见染色体异常情况及其与临床指标和疗效的关系.以4种序列特异性探针P53、D13S25、ATM、RBI和1种着丝粒探针CSP12,采用间期荧光原位杂交技术(I-FISH)对10例正常对照者骨髓建立各探针的检测阈值,然后对9例染色体核型分析阴,性/无分裂相的CLL患者进行检测,检测结果大于阚值为阳性,小于阈值为阴性.结果表明:用p53与D13S25检测7例患者结果均呈阳性,ATM探针检测5例患者结果呈阳性,用RB1与CSP12探针检测4例患者结果呈阳性.9例患者I-FISH检测结果均显示有遗传学异常.检测显示,ATM缺失与患者血红蛋白水平有显著相关性,ATM缺失阳性的患者更易出现全身广泛淋巴结肿大.结论:I-FISH技术适用于CLL患者的细胞遗传学分析,提高了CLL的染色体异常检出率.但I-FISH检测的细胞遗传学异常是否是CLL患者的重要预后因素,尚需扩大样本量的研究和长期随访观察.
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HLA-A*0201/WTl五聚体联合胞内IFNγ染色在检测白血病患者外周血WT1特异性T细胞中的应用
本研究探讨五聚体及胞内因子染色在定性定量检测抗原特异性T细胞中的应用价值.用RT-PCR方法检测受试者WTl表达水平;用HLA-A*0201/WT1五聚体及胞内IFNγ/染色检测14例表达HLA-A*0201的白血病患者全相合移植前后及其供者外周血中的、WT1特异性T细胞.结果表明:14例供者中2例有低水平WT1表达,白血病患者均有不同水平的WT1表达.14例供者均未检测到WT1+CD8+CTL和WT1+IFNγ+细胞;移植前14例患者中2例可检出WT1+CD8+CTL,3例检出、WT1+IFNγ/+细胞,二者间无明显差异(p=0.357),而移植后均可检出WT1+CD8+CTL和WT1+IFNγ+细胞,明显高于移植前(p值均<0.01).移植后大部分患者均在30天内检出WT1+CD8+CTL和WT1+IFNγ+细胞,但后者检出率高于前者(p=0.014).14例患者中WT1+CD8+CTL峰值中位数为0.18%,而WT1+ IFNγ+细胞峰值中位数为0.83%,明显高于前者(p=0.005);WT1+CD8+CTL峰值中位时间为移植后75天,WT1+IFNγ+细胞峰值中位时间为移植后105天,但二者间无明显差异(p=0.455).结论:五聚体及胞内IFNγ染色能有效检测白血病患者外周血中白血病抗原特异性T细胞;两种方法联合检测有助于抗原特异性T细胞的准确定性定量检测.
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IL-27通过信号通路p38 MAPK和P13K途径调节中性粒细胞Mac-1、fMLP-R及IL-1β表达
本研究探讨IL-27调节人外周血中性粒细胞中黏附分子Mac-1、趋化因子受体fMLP-R和促炎因子几-1β表达的信号通路.采用Ficoll密度梯度离心及低渗裂解残存红细胞方法分离高纯度的外周血中性粒细胞.用RT-PCR方法检测中性粒细胞IL-27受体(WSX-1/TCCR和gpl30)mRNA表达.分别应用IL-27及信号通路p38MAPK、P13K和ERK抑制剂SB203580、LY294002、U0126处理中性粒细胞,用实时定量RT-PCR检测作用前后fMLP-R和IL-1β mRNA水平变化;应用放射免疫法检测作用前后培养上清液中IL-1β的水平变化;流式细胞术检测作用前后Mac-1表达水平变化.结果表明:人外周血中性粒细胞协同表达IL-27受体的两个亚单位WSX-1/TCCR和gp130.IL-27下调中性粒细胞表面黏附分子Mac-1表达(p<0.05),SB203580阻断了IL-27对Mac-1的下调作用(p<0.05),而LY294002及UO126无阻断作用(P>0.05).相反,IL-27上调中性粒细胞中fMLP-R和IL-1β mRNA的表达并能增加IL-1β释放(p<0.05),LY294002阻断了IL-27对fMLP-R和IL-1β的上调作用(p<0.05),而SB203580及U0126无阻断作用(P>0.05).结论:IL-27与IL-27R相互作用,可能通过p38 MAPK和P13K信号途径调节人外周血中性粒细胞中Mac-1、fMLP-R及IL-1β表达.
| 年 | 期数 |
| 2019 | 01 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 |
| 2000 | 01 02 03 04 |
