中国实验血液学杂志
Journal of Experimental Hematology 중국실험혈액학잡지
- 主管单位： 实验血液学杂志
- 主办单位： 中国科学技术协会
- 影响因子： 0.98
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 11-4423/R
- 国内刊号： 陈潮
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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膜微粒子与造血调控
膜微粒子是细胞膜脱落下来形成的微粒样物质.多种细胞受到激活或者凋亡时产生膜微粒子并且释放到细胞外环境.膜微粒子成分取决于微粒子的起源细胞和微粒子形成过程.膜微粒子参与细胞之间的信息传递.某些细胞来源的膜微粒子具有调节造血干祖细胞的存活、增殖、分化、黏附及迁移的作用.本文就膜微粒子的成分,形成机制及其造血调控作用作一概述.
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线粒体DNA突变与骨髓增生异常综合征
骨髓增生异常综合征是以造血干细胞的异常克隆性增生、血细胞减少、骨髓出现病态造血为特征的一类疾病.近的研究发现:环形铁粒幼细胞作为MDS的一个重要病态造血现象,可存在于各型MDS中,并且具有明显的异质性.这种克隆内的异质性现象与线粒体DNA突变有关,线粒体DNA突变主要引起呼吸链异常,继而导致多种病理生理改变,在MDS的发病机制中可能有重要的作用.
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1-磷酸鞘氨醇对T细胞功能的影响
1-磷酸鞘氨醇(S1P)是鞘磷脂代谢过程中产生的一种重要信号分子,可与多条信号通路交联而产生广泛的生物学效应.T细胞表达5种S1P受体,即S1P1-S1P5.S1P信号可以调节T细胞的多种免疫效应,包括T细胞增殖和凋亡、T细胞向Th2细胞分化、细胞因子分泌及T细胞迁移等.抑制S1P信号通路的药物FTY720可将T细胞阻滞于次级淋巴器官,造成外周血T细胞显著减少而发挥强烈的免疫抑制作用.本文对S1P的合成和降解、S1P受体及其介导的信号途径、T细胞S1P受体的表达、S1P对T细胞功能的调节及S1P信号通路的免疫抑制药物作了概述.
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人血浆对红细胞保存的影响
为了研究人血浆对保存的红细胞结构和功能的影响,对悬浮红细胞、洗涤红细胞以及添加不同量血浆的红细胞成分血在不同保存时间内的红细胞的功能指标,包括pH值、K+浓度、Na+浓度、渗透脆性、血浆游离血红蛋白、乙酰胆碱酯酶活性、ATP含量、2.3-DPG、P50含量进行了比较.结果证明,血浆有利于保存血液维持其高pH值、低K+浓度和高Na+浓度,有利于保存红细胞维持其ATP含量、携氧能力和红细胞变形性,但对保存血液维持低渗透脆性,对保存血液的血浆游离血红蛋白、乙酰胆碱酯酶活性、ATP含量和2.3-DPG含量无影响.结论:在红细胞成分血中加入一定量的血浆可能有利于红细胞的长期保存.
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人血小板冻干前海藻糖负载技术的优化
本研究以建立血小板负载海藻糖基本技术为基础,进一步优化海藻糖负载技术,包括负载温度、负载时间、海藻糖负载浓度和负载溶液.通过比较缓冲液和血浆负载效果,比较生理温度(37℃)和相变温度(16℃)下血小板胞内海藻糖浓度与负载时间曲线、血小板平均体积(MPV)与负载时间、海藻糖负载浓度的曲线、计算海藻糖的负载率,优选负载率较高的负载溶液、负载温度、负载时间和海藻糖浓度等血小板海藻糖负载技术参数.结果表明:37℃血浆负载率高于缓冲液负载率,且血浆负载4小时,在37℃海藻糖负载率可高达19.51%,明显高于16℃的负载率6.16%;血小板MPV在16℃比在37℃明显增大43.2%,随海藻糖负载时间(1-4小时)延长和负载浓度(0-100mmol/L)增加未见明显改变;血小板MPV在37℃与海藻糖负载时间和负载浓度呈正相关性,且海藻糖负载时间与负载浓度存在协同效应,海藻糖负载浓度高于50 mmol/L,MPV随浓度(0-100mmol/L)、负载时间(1-4小时)增加而增大.结论:在原血浆中负载海藻糖、温度37℃、时间4小时、浓度低于50 mmol/L可以作为优化后血小板海藻糖负载技术基本参数,负载浓度需根据冻干保存需要进行调整.
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猕猴非清髓单倍相合造血干细胞移植模型的建立
为了研究用非清髓预处理是否能建立猕猴单倍相合造血干细胞移植模型,采用健康、单倍相合的亲代猕猴为供者,子代为受者.受体用氟达拉滨+环磷酰胺+全身照射+兔抗人胸腺细胞球蛋白作非清髓性预处理;用环胞菌素A、霉酚酸酯、鼠抗人CD25单克隆抗体作为移植物抗宿主病(GVHD)预防方案;第0天输注供者动员后的外周血造血干细胞;定期监测造血恢复、造血嵌合水平和GVHD发生等情况.结果表明:4例猕猴用非清髓性预处理后,移植后8天内造血均能恢复,早期均有供者造血干细胞植入;例3、例4植入成功,在移植后12、14天出现Ⅱ-Ⅲ度GVHD;例1在移植后7天低比例供者植入,后出现移植排斥;例2在移植后7天供者成分占50%,后因肾衰早期死亡.结论:用非清髓性预处理可以跨越单倍相合猕猴的MHC屏障,成功建立了单倍相合造血干细胞移植的模型,为进一步实验研究奠定了基础.
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猕猴造血嵌合体检测方法的建立与应用
在受体内检测到供体细胞嵌合是判断动物移植模型成功建立的关键.为了研究猕猴移植模型中的造血细胞嵌合状态,本研究利用多聚酶链反应(PCR)扩增猕猴Y特异性序列,建立检测性别不同供受者猕猴移植模型嵌合体的方法;用体外雄性、雌性DNA混合稀释实验研究该方法的敏感性;用染色体分析法验证该方法的准确性,并对1例异基因外周血造血干细胞移植的猕猴和1例间充质干细胞(MSC)异体输注的猕猴进行嵌合监测.结果表明:雄性猕猴DNA扩增产物长度为176 bp,雌性无扩增产物,敏感性达0.05%(雄性/雌性DNA比例).对异基因外周血造血干细胞移植的猕猴,用Y特异性序列分析法和性别染色体检测法于移植后7及14天均检测到雄性供者嵌合.输注非亲缘雄性MSC的雌性猕猴,输注后1小时的外周血和30天的骨髓用本方法检出雄性供体嵌合,结果性别染色体检测未发现雄性供体嵌合.结论:采用PCR法扩增猕猴Y特异性序列检测猕猴移植模型嵌合体方法简便,样本需要量少,敏感性高.该法可用于猕猴各种异体器官移植和细胞输注实验的嵌合状态评价.
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建立人/猪造血嵌合体模型的初步探讨
本研究目的是利用免疫系统尚未成熟的胎猪和新生猪作为人脐血造血干细胞(HSC)的移植受者,建立人/猪造血嵌合体模型,初步探讨在猪体内扩增HSC的可行性.在无菌隔离器中,通过肌肉或脐静脉(剖子宫)给胎猪移植人脐血细胞,或在断脐前通过脐静脉给新生猪移植人脐血细胞,应用流式细胞术检测移植组猪外周血中人CD45+细胞.结果表明:移植后,受试猪生长发育与对照猪一致;移植后60天时,用流式细胞术在猪的外周血中检测到一定比例的人源细胞.结论:胎猪或新生猪能耐受一定量的人源抗原的植入,建立人/猪造血嵌合体模型是可行的.
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小鼠H-2单倍相合非清髓骨髓移植后细胞因子表达的动态研究
为了探讨H-2单倍相合小鼠非清髓骨髓移植后细胞因子表达变化在急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生发展中的意义,建立了H-2单倍相合小鼠非清髓骨髓移植模型,环孢菌素A(CsA)联合霉酚酸酯(MMF)预防aGVHD,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测移植后不同时间点上小鼠脾脏中IL-2、INF-γ、IL-4及IL-10的mRNA的表达.结果显示:仅接受非清髓性预处理小鼠的脾脏中各因子的mRNA表达较预处理前略有升高.未做aGVHD预防给药的小鼠(第2组)IL-2、IFN-γ的mRNA表达水平在移植后急剧升高,分别在21天、14天达峰值,之后显著下降,35天时基本恢复至移植前水平.接受GVHD预防给药的小鼠(第3组)IL-2、IFN-γ的mRNA表达的变化趋势与第2组相似,但峰值明显低于第2组.第2组和第3组小鼠IL-4的mRNA表达水平均在移植后14天达峰值,但第3组的峰值较第2组为高,且在此后的下降中较第2组缓和.IL-10的mRNA表达水平在移植后逐渐升高,在14天达到一个高峰,21天时下降,之后再次升高直至35天.结论:H-2单倍相合小鼠非清髓骨髓移植后脾脏内IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10均呈上调表达,应用CsA和MMF则可下调IL-2和IFN-γ的mRNA表达水平,从而降低了aCVHD的发生率和严重程度.
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腺病毒介导的hVEGF165基因转移促进小鼠骨髓移植后造血重建
本研究探讨内皮细胞生长因子对骨髓移植小鼠造血重建的影响.重组腺病毒AdEGFP/hVEGF165经尾静脉注射给同基因骨髓移植BALB/c小鼠;在移植后10、20和30天时检测hVEGF165在小鼠体内的表达,同时测定外周血白细胞、血小板、红细胞计数和骨髓单个核细胞数;对分离移植后30天的骨髓单个核细胞进行脾集落形成试验.结果显示:重组腺病毒成功介导了hVEGF165在骨髓移植小鼠各脏器和血浆中的长期表达;移植后各时间点,接受hVEGF165治疗组小鼠外周血白细胞、血小板、红细胞计数及骨髓单个核细胞数虽然低于正常对照组,但高于其它实验组(P＜0.05);移植后30天时hVEGF165治疗组小鼠骨髓单个核细胞形成的脾集落数(21.4±2.67)恢复正常水平(19.50±2.46)(P＞0.05),较其它实验组显著增加(P＜0.05).结论:腺病毒介导的VEGF基因转移具有促进骨髓移植小鼠造血功能重建的作用.
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免疫磁珠选择性清除人异基因反应性T细胞的实验研究
本研究用磁性细胞分离系统清除CD25+和CD69+人同种异体反应性T细胞,为减轻异基因骨髓移植后的移植物抗宿主病探索新的手段.对健康供者外周血单个核细胞与白血病缓解病人的骨髓单个核细胞进行单向混合淋巴细胞培养.3天后,通过磁性细胞分离系统清除CD25+和CD69+的同种异体反应性T细胞;通过3H-TdR掺入实验,观察处理后的供者外周血单个核细胞对同一病人的骨髓单个核细胞及无关者外周血单个核细胞的反应性.结果表明:与未清除组相比,清除后供者细胞对同一病人抗原的反应性降低50%,但保留了大部分对无关者抗原的反应性.结论:在体外反应中清除同种异体反应性T细胞可降低对刺激抗原反应,同时保留大部分对无关者抗原的反应.
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CML28树突状细胞核酸疫苗的构建及其表达研究
为了构建负载CML28的核酸疫苗,并在树突状细胞中进行表达,用分子克隆的方法,从K562细胞中克隆出CML28的cDNA全长,将其亚克隆至pGEM-T载体,经测序后酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3.1HisA,将重组质粒pcDNA3.1HisA-CML28进行酶切分析和测序鉴定;从正常人外周血中分离外周血单个核细胞(PBMC),在IL-4和GM-CSF条件下诱导分化为树突状细胞(DC),并进行鉴定;用电穿孔的方法将重组质粒pcDNA3.1HisA-CML28导入到DC中,Western Blot检测His-CML28融合蛋白的表达.结果表明:经酶切分析和测序鉴定,重组质粒pcDNA3.1HisA-CML28含有正确的CML28全长序列;经电穿孔导入DC后,重组质粒能表达His-CML28蛋白.结论:成功构建了CML28树突状细胞核酸疫苗.
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三氧化二砷诱导MUTZ-1细胞凋亡的端粒酶调控研究
为了研究三氧化二砷(AS2O3)诱导人类骨髓增生异常综合征难治性贫血伴原始细胞过多型(MDS-RAEB)细胞株MUTZ-1细胞凋亡的端粒酶调控机制,采用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)检测端粒酶活性;RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶(hTERT)、TRF1(TTAGGG repeat binding factor 1)、TRF2(TFAGGG repeat binding factor 2)、bcl-2、bax等基因mRNA水平的表达;磷脂酰丝氨酸(PS)转位等方法检测细胞凋亡.结果表明:1-8μmol/L AS2O3诱导MUTZ-1细胞凋亡呈时间、浓度依赖关系.在该浓度范围内,As2O3可下调细胞端粒酶活性,且端粒酶活性下调与凋亡细胞阳性率呈明显负相关(r=-0.938,P=0.018).MUTZ-1细胞经As2O3作用后,hTERT基因mRNA表达下调,并与端粒酶活性变化呈正相关(r=0.783,P=0.022),但As2O3对TRF1及TRF2基因mRNA表达没有明显影响.MUTZ-1细胞端粒酶活性受抑制同时,伴有bcl-2 mRNA表达下调及bcl-2/bax比值下降.结论:AS2O3可能通过抑制细胞端粒酶活性及hTERT表达,诱导MUTZ-1细胞凋亡.As2O3抑制MUTZ-1细胞端粒酶活性可能是诱导该凋亡机制之一.
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IL-15对MDS患者CD34+细胞诱导增殖分化和抗凋亡作用
为了研究IL-15对体外培养的MDS CD34+细胞诱导增殖分化及凋亡的抑制作用,应用MACS免疫磁珠分离系统分离高富集度MDS CD34+细胞,建立以造血生长因子为基础的体外培养体系,用不同浓度的IL-15作用于MDS CD34+细胞,采用流式细胞术检测和免疫细胞化学染色等方法观察培养后的细胞表面抗原表达、细胞周期、凋亡指数及细胞形态的变化情况,并进行了定量分析.结果表明,MDS CD34+细胞经IL-15作用后,MDSCD34+细胞出现明显增殖和分化,细胞周期变异,增殖指数和细胞计数增加,形态学向成熟转化,实验组各表面抗原水平CD71、CD33和CD19均较对照组为高,细胞凋亡率则较对照组下降.结论IL-15对NMDS CD34+细胞有一定的诱导增殖分化和抗凋亡作用,在MDS治疗方面可能有一定的应用前景.
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IgH重排的实时定量PCR检测及反应参数研究
为了探讨以通用引物应用PCR技术扩增克隆性免疫球蛋白重链基因(IgH)重排的佳实验条件及SYBRGreen Ⅰ实时定量PCR检测该基因的可行性,以通用引物对克隆性IgH重排进行扩增,对影响PCR扩增的退火温度、引物浓度、Taq酶用量、dNTP浓度、镁离子浓度、循环次数等实验因素进行了系统研究,找出佳反应参数,并以通用引物进行了SYBR green Ⅰ实时定量PCR对IgH重排基因的检测,测定了该法检测IgH重排基因的敏感性.结果表明:佳退火温度为60℃,佳引物浓度为0.8 μmol/L,0.5 U的Taq酶量效果满意,适dNTP浓度为100μmol/L,适镁离子浓度为3.0 mmoL/L,佳循环次数为40次.SYBR Green Ⅰ实时定量PCR可以实现对克隆性IgH重排的扩增和荧光信号的检测分析,其对IgH重排基因检测的敏感性为10 4/ml.结论:确定了应用PCR技术检测克隆性IgH重排的适反应条件,实现了用通用引物对克隆性IgH重排稳定、特异的扩增,初步实现了以通用引物和应用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR对IgH重排的检测.
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细胞色素C对HL-60细胞凋亡作用及其与相关bcl-2、bax基因的关系
为了探讨细胞色素C在体外作用于HLHL-60细胞时细胞发生的变化及其相关凋亡基因的bcl-2、bax表达变化的机制,用不同浓度的细胞色素C作用于HL-60细胞24小时,然后分别用MTT检测细胞色素C对HL-60细胞的抑制率;应用光学显微镜、荧光显微镜观察HL-60细胞形态的变化;用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期的变化;用DNA凝胶电泳检测HL-60细胞的凋亡;用RT-PCR检测bcl-2、bax基因的表达的变化.结果表明:在细胞色素C浓度为0-150 mg/L时,细胞抑制率随着浓度的增加而增加;当细胞色素C浓度在0-37.5 mg/L时,细胞凋亡率逐渐增加,可见典型的凋亡细胞和明显DNA梯形条带,同时,在该浓度范围内bcl-2表达逐渐减少,而bax表达逐渐增加;当细胞色素C浓度大于37.5 mg/L时,细胞凋亡率增加不明显,但细胞出现坏死.结论:细胞色素C能诱导HL-60细胞发生凋亡,细胞色素C对细胞周期的作用是将细胞阻滞于G1期,并且细胞凋亡率、bcl-2、bax基因的表达的变化与细胞色素C浓度呈一定的量效依赖关系,细胞色素C诱导HL-60凋亡可能与bax的激活和bcl-2的抑制有关.
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荧光定量PCR检测急性白血病患者外周血 WT1基因表达及其临床意义
为研究WT1基因表达与临床疗效和预后的关系,探讨其在白血病微小残留病检测中的作用,用荧光定量RT-PCR方法检测55例初发白血病患者外周血及10例正常人外周血的WT1基因表达,跟踪20例急性白血病患者外周血WT1基因表达.结果显示,白血病初治组(40例ANLL、15例ALL)与正常人外周血WT1基因表达有显著差异(P＜0.001).在急性白血病患者中,WT1≤6.8×10-3组生存期长于WT1＞6.8×10-3组(P=0.027);白血病患者初发时WT1呈高度表达,完全缓解后,迅速或缓慢下降至少1个对数级,复发时再次增高.跟踪检测20例急性白血病患者外周血WT1基因表达,结果7例复发,5例在临床复发前2-3月WT1的水平明显增高,至少上升0.8个对数级.结论:荧光定量RT-PCR方法检测白血病外周血WT1表达具有简便易行、准确性高、特异性好的特点.与正常人外周血比较,WT1在各类白血病外周血中呈高度表达,且表达水平与预后负相关;对外周血WT1基因表达进行定量分析,可用于微小残留病的监测.
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HLA-I类基因与白血病相关性研究
本研究目的是从常见类型白血病群体的HLA多态性分布特征探讨白血病与HLA-I类基因的相关性.采用序列特异性引物扩增方法(SSP-PCR)检测了605例白血病患者(ALL 189例、AML 184例、CML 232例)的HLA-A、B、C基因特异性,以900份脐血库资料作为正常群体对照.结果发现,在急性淋巴细胞性白血病(ALL)患者中HLA-A*26、A*68、B*56的基因频率分别为4.46%、2.65%和1.17%,明显高于对照组(2.31%、0.95%和0.22%);Cw*06基因频率(3.64%)明显低于对照组(11.65%).在急性髓性白血病(AML)患者中HLA-A*01、B*37基因频率(9.41%、3.60%)明显高于正常对照(3.57%、1.75%),A*33、B*51基因频率(3.60%、4.73%)明显降低(对照:7.64%、7.93%);在慢性髓性白血病(CML)患者中HLA-A*32、B*27、B*44、B*54、B*55基因频率分别为2.18%、3.96%、5.06%、4.63%和2.84%,明显高于正常对照(0.84%、2.04%、3.07%、2.44%和1.29%).结论:各类白血病分别与不同的HLA基因有明显的相关性,这对白血病发病机制的研究有重要意义.
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阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡及其机制研究
为了研究阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡及其机制,采用Giemsa染色、光学显微镜下观察HL-60细胞的形态学变化,琼脂糖凝胶电泳检测DNA凋亡带,细胞免疫组织化学方法检测细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax的蛋白表达.结果显示:实验组自培养8小时起,细胞开始变形,Giemsa染色可见核膜裂解,染色质呈紫红色或蓝紫色,出现典型的凋亡小体;DNA凝胶电泳见典型的梯形条带;在细胞凋亡的同时伴有Bcl-2蛋白表达明显下降,而Bax蛋白表达明显升高,Bcl-2/Bax比值下降.结论:阿糖胞苷可明显地诱导HL-60细胞凋亡,同时伴有Bcl-2蛋白表达降低、Bax蛋白升高.Bcl-2/Bax比值下降可能是阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡的主要机制之一.
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可移植性人髓系白血病BALB/c小鼠模型建立
造血干/祖细胞移植已成为迄今为止治疗恶性血液病等有效措施,而建立骨髓型可移植性白血病小鼠模型将为造血干细胞移植治疗白血病提供实验用动物模型.本实验用K562细胞接种BALB/c裸鼠产生红白血病的小鼠模型.将4-5周龄雌性BALB/c裸鼠,腹腔连续两天注射环磷酰胺(CTX)2 mg,第3天腹腔或尾静脉直接接种K562白血病细胞2×10 5-2×10 6/只.定时取小鼠尾静脉外周血、骨髓细胞用流式细胞术和RT-PCR分别检测CD45,CD13,CD33抗原及bcr/abl融合基因.结果显示,4-5周龄BALB/c裸鼠无论通过腹部或尾静脉接种,无论有无CTX预处理,当接种K562细胞数大于2×10 5/只时,均可在BALB/c裸鼠身上产生可移植性人髓系白血病,荷瘤小鼠可存活30-60天.结论:腹腔或尾静脉接种大于2×10 5细胞/只均可产生人髓系白血病荷瘤小鼠模型,有无CTX 2毫克/只的预处理不影响4-5周龄BALB/c裸鼠产生人白血病模型.
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稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系的建立
为了建立稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞系,从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进逆转录病毒载体pLXSN中.脂质体介导重组逆转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,采用G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞.收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行逆转录病毒滴度的测定,计算病毒效价为2×10 7CFU/ml.结果表明,收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得了稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株.经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系.结论:成功建立了表达bcr-abl融合基因的鼠SP2/0细胞系,这一肿瘤细胞模型可作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcrabl基因疫苗激发小鼠CTL应答的研究奠定物质基础.
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TGF-β1、TβRⅡ、c-myc在急性白血病中的表达及其意义
为了探讨转化生长因子β(transforming growth factor-beta,TGF-β)信号转导途径失活与急性白血病的关系,用S-P免疫细胞化学法检测急性白血病患者骨髓单个核细胞中TGF-β1及其Ⅱ型受体(TβRⅡ)和信号下游靶基因蛋白c-myc的表达.结果发现,白血病患者骨髓单个核细胞中TGF-β1的表达水平与正常对照无显著性差异(P＞0.05),TβRⅡ的表达水平明显低于正常对照(P＜0.05),c-myc的表达水平明显高于正常对照(P＜0.05),但以上各指标在急性淋巴细胞白血病与急性非淋巴细胞白血病之间无显著性差异(P＞0.05),TβRⅡ和c-myc表达率有负相关关系(r=-0.474,P＜0.01).结论:TGF-β信号转导途径失活使细胞逃逸了TGF-β的生长抑制,TGF-β信号转导途径失活的一个重要机制就是通过TGF-βⅡ型受体的下调使c-myc失去抑制而高表达,促进白血病发生.
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基于细胞表型异常的流式细胞术检测急性前体B细胞白血病微小残留病
为了建立一种基于细胞表型异常的流式细胞术以检测急性前体B细胞白血病微小残留病,对35份precursor-B-ALL病人骨髓和19例正常对照骨髓应用BIOMED-1推荐的5种3色抗体组合(TdT/CD10/CD19,CD10/CD20/CD19,CD34/CD38/CD19,CD34/CD22/CD19和CD19/CD34/CD45)进行了流式免疫分型,以确定前体B细胞正常和异常抗原表型流式图形特征.在35例患者中初诊病人13例,完成诱导缓解后的病人15例,完成巩固治疗的患者7例.应用不同比例的正常骨髓单个核细胞和带有CD34/CD38/CD19阳性白血病细胞进行了系列稀释试验.结果显示:在正常对照组中流式细胞术分析显示了3群CD19阳性细胞,代表了B细胞的3个连续成熟阶段.在precursor-B-ALL患者中这3群细胞消失,代之以大量的白血病细胞,而这些白血病细胞的表型特征与正常B细胞不同.当病人获得完全缓解时,这3群细胞会重新出现,而且具有与正常CD19阳性细胞几乎相同的表型特征.用5组3色抗体组合检测病人时,初诊患者12/13(92.3%)可检出抗原表型异常,也即在0.01%的敏感性水平每个患者至少有1种抗体组合的异常.在本研究初诊病人中这些抗体组合的异常频率:CD10/CD20/CD19为8/13(61.5%);CD34/CD38/CD19为5/13(38.5%);CD10/TdT/CD19为4/13(30.8%);CD34/CD22/CD19为3/13(23.1%);CD34/CD45/CD19为2/13(15.4%).刚获得完全缓解的患者抗原表型异常的检出率为5/15(33.3%),其中初诊和缓解时同时检出异常者3/8(37.5%).稀释试验表明,从1:1至1:400 000的范围,流式细胞术检出与已知加入的CD34/CD38/CD19阳性白血病细胞数有良好的线性相关(r=0.80,P＜0.05).结论:BIOMED-1协作组建议的基于细胞表型异常的流式细胞术用于precursor-B-ALL微小残留病的检测在本研究中能较好地实现.在10 4个正常骨髓细胞中可以有效检出1个precursor-B-ALL白血病细胞.
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反应性氧代谢物清除剂逆转ROM对NK细胞抗K562细胞系体外抑制作用
为了探讨新型反应性氧代谢物(reactive oxygen metabolites,ROM)清除剂在NK细胞抑制K562细胞时作为免疫佐剂的作用,采用IL-2及PHA活化单核(MO)细胞,使MO细胞的ROM产量增加,观察NK细胞活性和K562细胞抑制率(KIR)的相应变化,然后在不同比例的MO+NK+K562细胞培养体系中加入不同浓度的ROM清除剂(硫普罗宁),定期检测ROM产量及KIR(每种检测均做3个复孔),同时应用不同浓度的二氢氯组胺(DHT)作为阳性对照.结果表明:在K562细胞、NK细胞混合培养体系中,当E/T=10/1时,加入IL-2/PHA后ROM的产量从33.17±25.02 U/ml增至223.59±59.41 U/ml(P＜0.05),KIR从65.56%升至85.89%(P＜0.05);当按E/MO=10/2、10/5、10/10三种比例加入MO细胞后,ROM产量随着MO细胞数量的增加而增加(ROM产量分别为389.79±43.83 U/ml,456.74±42.77 U/ml,601.42±21.92 U/ml),而KIR则相反(KIR分别为82.36%,81.36%,48.09%);而在K562+NK+MO+IL-2/PHA混合培养体系中加入硫普罗宁、DHT后,当E/MO=10/2时,ROM产量从389.79±43.83 U/ml分别降至-1.20±60.70 U/ml和50.21±22.4 U/ml(P＜0.05),KIR则从82.53%分别升至96.09%和94.64%(P＜0.05).随着硫普罗宁、DHT浓度的增加,ROM产量逐渐减少.ROM产量与KIR呈负相关(r=-0.518).当E/MO为10/5或10/10时,各浓度硫普罗宁及高浓度的DHT可使ROM产量减少(P＜0.05),但KIR提高不明显(P＞0.05).硫普罗宁在提高KIR的效应方面与DHT相似(P＞0.05),而在清除ROM方面,硫普罗宁较DHT为优(P＜0.05).结论:①MO细胞是ROM产生的主要来源,其产生的ROM可使NK细胞的抗瘤(抗K562)活性下降;②新型ROM清除剂(硫普罗宁)可有效清除ROM,在一定程度上逆转ROM对NK细胞抗K562细胞的抑制作用,且在逆转ROM方面优于DHT,在提高NK细胞对K562细胞的抑制率方面效应强度与DHT相似,但毒副作用较低,有望替代DHT作为免疫佐剂用于白血病的过继性免疫治疗中.
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一氧化氮供体诱导HL-60细胞凋亡过程中活性氧自由基和抗氧化能力的变化
为了研究外源性一氧化氮(N0)供体硝普钠(SNP)诱导HL-60细胞凋亡过程中活性氧自由基和抗氧化能力的变化,将HL-60细胞与SNP在体外培养,用MTT法观察NO对细胞的抑制作用;用透射电子显微镜和光学显微镜观察细胞结构的变化;用DNA凝胶电泳、细胞DNA含量、Annexin-V/PI法等分析细胞凋亡;用双氢罗丹明123(DHR)标记、流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS),并同时测定细胞内谷胱甘肽(GSH)和3种抗氧化酶的活性.结果表明:SNP能抑制HL-60细胞生长,典型的细胞形态改变、DNA片段化、亚二倍体峰比例增加、DNA末端标记和Annexin-V+/PIˉ表达增加等证实NO能诱导白血病细胞凋亡,且两者之间有明显的量效和时效关系.在此过程中,细胞内ROS水平增加,细胞内谷胱甘肽和过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性降低.ROS含量和CAT、GST、GPX活性与SNP之间也有明显的量效关系.结论:细胞内活性氧自由基增加和抗氧化能力下降在外源性一氧化氮供体诱导HL-60细胞凋亡中发挥了重要作用.
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HL-60细胞IRP2 mRNA、TfR mRNA、Fn mRNA的表达关系研究
为了探讨白血病细胞铁代谢及其调节机制,以及铁调节蛋白2(IRP2)在HL-60细胞铁代谢中的作用,将FeCl3或去铁胺(desferrioxamine,DFO)加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中,使HL-60细胞处于缺铁或富铁的不同状态下进行培养.分别于细胞培养后第12、24和48小时收集细胞,提取总RNA,采用RT-PCR半定量法测定IRP2 mRNA、铁蛋白(Fn)mRNA和转铁蛋白受体(TfR)mRNA等指标的相对表达量.结果表明:①各实验组之间IRP2mRNA的表达量变化不大,组间差异无统计学意义(F组间=1.199,P＞0.05);而细胞培养时间对IRP2mRNA的表达有影响,组内差异有统计学意义(F组内=43.418,P＜0.01),表现为随时间的延长,IRP2 mRNA的表达降低.②各实验组之间TfR mRNA的表达差异有统计学意义(F组内=7.184,F组间=113.926,P＜0.01).在加入DFO的两个实验组中,TfR mRNA的表达升高.在加铁的两个实验组中,与对照组相比较,于12小时时TfR mRNA的表达量上升,24时时达到高峰,之后迅速下降.③在加铁的两个实验组中,Fn mRNA的表达量较高,大约是对照组的2倍,它们与对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05);而在加入DFO的两个实验组中Fn mRNA的表达与对照组相比较,无明显的差异(P＞0.05).④IRP2 mRNA与TfR mRNA及Fn mRNA的表达均不相关(r=-0.005,r=0.074,P＞0.05).结论:①IRP2在转录水平上可能是通过自身不同片段的量的变化,而在转录后水平上是以氧化修饰的方式通过自身降解,对HL-60细胞的铁代谢进行调节.②Fn mRNA和TfR mRNA不同程度地参与了对HL-60细胞内铁的调控过程.
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人类ERMAP基因在诱导K562细胞向红系和巨噬系细胞分化过程中表达的研究
为了探讨人类ERMAP基因在红细胞分化发育过程中的作用,以Ara-C诱导K562细胞向红系方向分化,以十二氟波酯钠盐(TPA)诱导K562细胞向巨噬系方向分化,用荧光定量PCR检测上述过程中人类ERMAP基因表达量的变化.结果发现:终浓度为2.5×10-6mmol/L/L及1.0×10-6mmnol/L/L的Ara-C可诱导K562细胞向红系方向分化,在此过程中人类ERMAP基因的表达量逐渐增加;终浓度为2.0×10-6mmol/L/L及1.0×10-6mmol/L/L的TPA可诱导K562细胞向巨噬系方向分化,在此过程中人类ERMAP基因的表达量无变化.结论:人类ERMAP基因与红系分化增殖密切相关.
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c-myc反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性影响及诱导凋亡作用
为了研究c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞端粒酶活性的影响及其诱导凋亡作用,探讨HL-60细胞端粒酶活性与c-myc基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞c-myc基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,采用流式细胞术进行细胞凋亡检测及细胞周期分析,琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA断裂情况,应用TRAP-ELISA法测定HL-60细胞端粒酶的活性.结果表明:反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,c-myc基因表达明显受抑;S期细胞百分数由55.6%降至30%,并出现早期凋亡峰(凋亡细胞比例占25.2%);琼脂糖凝胶电泳显示DNA凋亡梯形带;端粒酶活性检测发现反义寡核苷酸3,4,5 μmol/L作用组OD450-690分别为1.952±0.14,1.805±0.40,1.616±0.41,与未作用组(OD450-690为2.648±0.42)比较,差异有显著性(P＜0.05);反义寡核苷酸1和2μmol/L作用组及正义寡核苷酸5μmol/L作用组OD450-690分别为2.324±0.36,2.162±0.38,2.466±0.29,与未作用组比较,差异无显著性(P＞0.05).结论:c-myc基因反义寡核苷酸能够通过封闭c-myc基因的表达而诱导HL-60细胞凋亡,阻止细胞由G1期进入S期,并具有下调端粒酶活性作用.
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人骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用
为了探讨人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)体外对T淋巴细胞的免疫调节作用,从人骨髓液中分离培养MSC,通过细胞形态、免疫组织化学及流式细胞术检测其表面标记进行鉴定;将植物血凝素(PHA)及从人脐血中分离培养的树突状细胞(dendritic cell,DC)作为刺激因素,经磁珠分选的人CD2+T淋巴细胞作为反应细胞,用3H-TdR标记β液体闪烁计数仪检测与MSC共培养前后T淋巴细胞增殖能力的变化;用流式细胞术检测与MSC共培养10天后的CD2+T细胞内各亚群Th1、Th2、Tc1、Tc2比例的变化.结果表明:MSC能明显抑制由DC诱导的T淋巴细胞增殖(P=0.004),同时MSC抑制由PHA引起的T细胞增殖,但不具有显著性差异(P=0.26),MSC培养上清液单独并不具备抑制T细胞增殖的作用,与MSC共培养后的T细胞亚群中,Th2及Tc2亚群含量较共培养前明显增加(P＜0.05).结论:MSC对由DC和PHA诱导的淋巴细胞增殖反应均具有抑制作用,并且这种作用可能与细胞间相互作用及诱导T细胞亚群的改变有关.
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人骨髓间充质干细胞的鉴定:抗SH2和SH3单克隆抗体的制备与应用
间充质干细胞(MSC)是能够自我更新和分化成一种或多种间叶组织的骨髓或其它组织中的一种干细胞,至今还没有类似于CD34识别造血干细胞一样的公认的抗原用于确认间充质干细胞.为了分离和鉴定MSC,本研究选取抗SH2和SH3这两种应用较广泛的抗体.从SH2和SH3杂交瘤细胞接种小鼠获得的腹水中提纯SH2和SH3两种抗体,并用流式细胞术和免疫组织化学的方法鉴定贴壁培养的骨髓间充质干细胞;用免疫磁珠分选方法从骨髓单个核细胞中分选SH2和SH3阳性的细胞;用流式细胞仪双标的方法检测SH2和CD105抗体在间充质干细胞上的阳性率.结果表明:SH2和SH3在间充质干细胞上的阳性率均在80%,分选阳性细胞中80%的细胞为间充质干细胞,阴性细胞中间充质干细胞的比例不足1%.标记了SH2后的间充质干细胞CD105的阳性率不足1%.结论:SH2和SH3是骨髓间充质干细胞的特异性的标记物,可用于间充质干细胞的分离和鉴定.抗CD105抗体和抗SH2抗体在分离和鉴定MSCs上具有同等效力.
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双次自体外周血干细胞移植联合序贯大剂量CHOEP方案治疗中高度恶性淋巴瘤
为了评价CHOEP方案对外周血干细胞的动员效果、序贯化疗联合双次移植的远期疗效和患者的耐受性,对5例复发、难治中高度恶性淋巴瘤在双次自体外周血干细胞(PBSC)移植联合序贯大剂量CHOEP方案的临床结果进行了回顾性分析.5例恶性淋巴瘤患者的动员方案为CHOEP联合G-CSF 5μg/(kg·d),两次移植预处理均为大剂量CHOEP,第二次移植与第一次移植的中位间隔时间为9(5～31)周,两次移植回输单个核细胞数(MNC)分别为3.05(1.91～4.14)×10 8/kg和3.55(2.23～6.0)×10 8/kg;CD34+细胞分别为4.11(2.59～4.94)×10 6/kg和5.70(2.77～-10.6)×10 6/kg;CFU-GM分别为2.97(2.01～4.54)×10 5/kg和2.44(1.78～2.9)×10 5/kg.研究结果表明,回输外周血造血干细胞后,所有患者的造血均快速重建,中性粒细胞(ANC)≥0.5×10 9 /L时间为10(8～12)天和10.5(9～12)天,血小板≥20×10 9/L分别为11(10～14)天和12.5(10～15)天.双次移植后5例次并发Ⅲ-Ⅳ度口腔粘膜炎,无肝肾功能损害,无移植相关死亡.随访时间46(9～88)月,4例存活,其中3例无病生存,总体生存率80%,无病生存率60%.结论:双次自体外周血干细胞移植联合序贯大剂量CHOEP化疗方案是治疗复发、难治中高度恶性淋巴瘤的有效手段,动员方法简便安全,预处理方案耐受性好,值得临床进一步研究探索.
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姜黄素影响Caspase 8和Caspase 9诱导淋巴瘤Raji细胞凋亡的研究
姜黄素(curcumin)是中药姜黄的主要成分,能选择性地抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡,本研究旨在探讨姜黄素抗癌作用的分子机制.选择淋巴瘤细胞系Raji为研究对象,用正常健康人静脉血作为对照,应用淋巴细胞分层法分离获得外周血单个核细胞(PBMNC)并进行培养.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测姜黄素不同浓度、不同时间作用于Raji细胞、PBMNC后细胞的抑制率,并进行比较.用Westem blot检测25 μmol/L(IC50)姜黄素作用24小时Raj细胞胱冬蛋白酶Caspase 8和9的表达.结果表明:姜黄素可呈时间及剂量依赖性抑制Raji细胞增殖,可显著促进Raji细胞凋亡(P＜0.01),且呈浓度依赖性及时间选择性;一定浓度范围内的姜黄素对PBMNC无显著抑制作用,提示姜黄素抑制增殖具有选择性作用.Raji细胞胱冬蛋白酶8和9的表达明显增高(P＜0.05).结论:胱冬蛋白酶8和9在Raj细胞增殖和凋亡中起重要的作用,姜黄素在不同浓度、不同时间条件下抑制Raji细胞增殖并促进其凋亡.
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血管性血友病因子裂解酶活性域的表达及其单克隆抗体的制备
血管性血友病因子裂解酶(vWF-cp)是一种新发现的金属蛋白酶,与血栓性微血管病的发生密切相关.本研究应用IPTG从pET28a(+)-vWF-cp/MD质粒中诱导表达了vWF-cp的金属蛋白酶域,重组蛋白经Ni-NTA柱纯化,复性后免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得了稳定分泌抗vWF-cp金属蛋白酶域抗体的细胞株,进一步对其单克隆后,收集细胞接种于小鼠腹腔产生腹水,鉴定所获得的单克隆抗体,同时,利用单克隆抗体确定vWF-cp在组织细胞中的位置及其在各种正常组织中的表达情况.结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的28%.利用杂交瘤技术制备出3株抗vWF-cp单克隆抗体,对其中2株单克隆抗体作了进一步的鉴定.免疫双扩散和竞争ELISA结果显示,它们均属IgG1亚类,腹水中的含量约为4 mg/ml,效价达1×10-5,而且识别vWF-cp金属蛋白酶域不同的表位.Western blot和免疫沉淀结果表明,2株单克隆抗体能够识别重组蛋白和正常血小板中200 kD的蛋白.在组织细胞中,2株单克隆抗体识别的蛋白位于细胞胞质内,而且在多种正常组织如肝、前列腺和卵巢等组织中表达,但脑组织中无该蛋白的表达.结论:本研究为了解vWF-cp在组织中的分布以及进一步研究该蛋白酶的结构和功能奠定了基础,并且可用所制备的单克隆抗体建立vWF-cp抗原的检测方法.
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尖吻蝮蛇类凝血酶基因的克隆及生物信息学分析
为了获得蛇毒类凝血酶基因,本研究根据不同蛇毒类凝血酶cDNA 5′和3′保守性序列设计了引物;通过RT-PCR从尖吻蝮蛇毒腺总RNA中扩增到1个808bp特异性片段,将该cDNA重组到pMD18-T载体中,利用生物信息学的方法对测序结果进行了分析.结果表明:该特异性片段中有一个783 bp的开放阅读框架,其编码蛋白质序列与蛇的类凝血酶序列有98.5%的同源性,也具有蛇毒类凝血酶的典型特征.结论:本实验获得了一个新的尖吻蝮蛇类凝血酶基因.
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血管内皮生长因子基因表达定量分析方法的建立及其应用
血管内皮生长因子(VEGF)是血管新生的中枢介质,在白血病的病理机制中具有重要作用,也是血液肿瘤患者一种独立的预后因素,但VEGF在白血病细胞分化或凋亡中的重要性尚待阐明.为了查明VEGF在白血病细胞分化或凋亡中的作用,构建了VEGF基因竞争模板(T-VEGFΔ)并建立竞争性定量逆转录聚合酶链反应(cQRT-PCR),以监测全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞分化过程中VEGF基因表达的改变;通过将系列稀释的靶分子与恒量的竞争模板共扩增,获得标准曲线,用于计算待测样本中靶基因的分子数;在不同时间点分别检测NB4细胞的CD11b抗原表达和NBT还原率.结果显示:cQRT-PCR可作为定量分析VEGF基因表达的有效工具,其测定范围约为1×10 4-2×10 5分子.NB4细胞经ATRA处理0、12、24和48小时后,其VEGF基因转录本的数量分别为42.3×10 5、12.6×10 5、3.6×10 5,低于1.0×10 5/μg总RNA,并伴有CD11b表达上调和NBT还原率增加.结论:成功地建立了cQRT-PCR方法,证明ATRA显著抑制VEGF表达并可能通过抑制血管新生发挥抗白血病的功效.
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抗TGF-β抗体对人脐血CD34+细胞体外扩增及黏附分子表达的影响
本研究的目的是证实抗TGF-β抗体在人脐血CD34+细胞体外扩增过程中可以增加CD34+细胞的扩增效率,并观察其对脐血CD34+细胞粘附分子表达的影响.从6份新鲜脐血标本中富集CD34+细胞,将其接种于含抗TGF-β抗体+SCF+Flt-3L+TPO+IL-3因子组合的SFEM无血清培养体系中,培养6天后,细胞计数,并用FACS检测CD34、c-kit(CD117)、CD11a、CD49d、CD33表达情况,同时进行集落分析.结果表明:①实验组有核细胞数、CD34+细胞数、CD34+c-kit+细胞数及CFU-GEMM分别扩增了41.82±13.49,15.62±6.95,13.36±6.12,11.07±4.05倍,明显高于对照组(P分别=0.001,0.002,0.003,0.002),其中实验组中更为早期的CD34+c-kitˉ亚群的扩增倍数更多(69.10±41.06),多于有核细胞、CD34+细胞、CD34+c-kit+细胞的扩增倍数(P=0.024).②TGF-β抗体对CD11a和CD49d的表达无明显影响(P值均大于0.05).结论:抗TGF-β抗体可协同早期干细胞生长因子有效扩增脐血CD34+细胞,同时不降低CD34+细胞黏附分子的表达.
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人脐血巨核系祖细胞体外扩增的实验研究
本研究旨在探讨各种细胞因子对人脐血CD34+细胞体外扩增生成巨核细胞的作用,以建立人脐血巨核系祖细胞体外扩增的佳体系.采用Ficoll分离液分离脐血单个核细胞,免疫磁珠法分离纯化CD34+细胞,进行体外半固体集落培养和液体培养,观察各种细胞因子组合对CD41+细胞和巨核细胞集落形成单位(CFU-MK)的影响.结果显示:TPO+IL-6+IL3+FLT-3L 4因子组合体外培养14天效果好,在第7、14天CD41+细胞分别扩增了154.67±32.21倍、193.23±25.24倍.结论:本实验建立的巨核系祖细胞体外扩增体系,为促进脐血移植后血小板恢复奠定了实验基础.
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抗CD20单克隆抗体和化疗预处理及自体外周血造血干细胞移植治疗非霍奇金淋巴瘤一例
自体造血干细胞(auto-HSC)移植治疗淋巴瘤的疗效已得到肯定,但仍有较高的复发率.为了减少复发,许多临床学家进行了较多的有益探索.我们在进行自体HSC前进行了7次包含CD20单克隆抗体方案的常规剂量化疗,大限度地降低体内肿瘤细胞负荷,达到体内净化的目的.现将我们完成的自体外周血HSC移植治疗1例4期高度恶性的非霍奇金淋巴瘤(弥漫性大B细胞型)结果报道如下.
| 年 | 期数 |
| 2019 | 01 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 |
| 2000 | 01 02 03 04 |
