人造血干细胞的免疫缺陷小鼠移植模型研究与应用

已有多种免疫缺陷动物被用于人造血干/祖细胞的检测.理想的免疫缺陷动物应具有完整的免疫缺陷,能高效的移植人造血干/祖细胞,又有足够长的寿命能适于观察.通过介绍Nude、SCID、Nod/SCID、NOD/SCID-β-2mnull等一系列免疫缺陷小鼠的遗传及免疫学特点及其在造血干细胞研究中的贡献.本文综述了小鼠移植模型的发展,评价了免疫缺陷移植模型在造血干细胞研究中的重要性及小鼠移植模型的新进展和方向.

单核苷酸多态性及其在异基因造血干细胞移植中的应用

单核苷酸多态性是继限制性片段长度多态性,短串连重复序列多态性之后的第三代遗传标记,是基因组中变异多的一种,被广泛应用于基因定位、克隆和遗传多样性研究以及法医学亲子鉴定等方面.作为一种稳定的遗传多态性,单核苷酸多态性成为异基因造血干细胞移植中嵌合体检测的新方法.本文就单核苷酸多态性的遗传特性,分析技术,在造血干细胞移植和其它方面的应用进行了综述.

Survivin在造血系统肿瘤中的研究进展

Survivin是一种新的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protem,IAP),具有细胞周期调控和凋亡抑制双重功能.在多种造血系统肿瘤组织中高表达,与诊断、预后和耐药密切相关.利用survivin致敏的树突状细胞疫苗、survivin反义核酸及Survivin阴性突变体可有效抑制肿瘤细胞生长,为采用生物学策略治疗造血系统肿瘤开辟了新途径.本综述重点阐述了survivin在造血系统肿瘤中的表达,survivin与造血系统肿瘤预后和耐药的关系及survivin在造血系统肿瘤治疗中的应用.

异基因骨髓移植中巨细胞病毒的临床检测

在异基因骨髓移植中,巨细胞病毒(CMV)感染常可引起致命危险及移植失败,因而探索早期准确检测CMV感染的有效实验手段至关重要.本文介绍了传统的CMV的培养法及近年来发展起来的抗原检测方法和分子生物学方法.

干细胞移植治疗神经遗传疾病中HLA配合的几率分析

为了探讨干细胞移植(Stem Cell Transplantation)对神经系统中预后不良的单基因遗传性疾病之一DMD(假肥大型肌营养不良症)的临床可行性,采用PCR反向序列特异性寡核苷酸杂交技术(polymerase chain reactionreverse sequence specific oligonucleotide,PCR-RSSO)对30例DMD患者进行HLA-ABDR基因分型,并与广东省脐血干细胞库668份和中国造血干细胞捐献者库34 910份分别进行HLA-ABDR基因频率比较和无关供者干细胞的配合性分析.结果表明:DMD疾病组的HLA基因呈正态遗传,DMD患者HLA基因表达与广东健康人群无统计学上显著差异;DMD患者中1/4寻找到合适用于移植的干细胞,其中在广东脐血库寻找到≥5个HLA-ABDR基因配合的几率为50%,在中国造血干细胞库寻找到6个HLA-ABDR基因配合的几率为26%.结论:对DMD患者进行非亲缘异基因脐带血/外周血移植治疗具有HLA配合供者高选择几率的可行性基础;干细胞移植不仅将使致死性神经肌肉疾病患者获得临床症状改善,并且为难治性神经系统疾病受益于干细胞移植治疗打造技术平台.

深低温保存新鲜富含血小板血浆质量分析

为了评价批量制备的深低温保存富含血小板血浆(cryo-FPRP)的效率和效果,在优化建立的无偿献血者血小板的批量分离和制备cryo-FPRP过程中测定了ACD抗凝的200ml全血、FPRP、含5%DMSO的FPRP(DM-SO-PRP)和-80℃冰箱然冰冻保存后复温的FPRP(Cryo-FPRP)的血小板计数(Plt)、血小板平均体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血浆内pH、血浆乳酸(LA)浓度和乳酸脱氢酶(LDH)浓度、细菌培养、血小板CD62p阳性率、PAC-1阳性率及抗GPIb-Ⅸ-Ⅴ荧光强度,也测定了FPRP和cryo-FPRP的促凝血活性.结果表明:①血小板的总平均得率为70%;FPRP中残余的红细胞≤1×109/袋;白细胞≤1×107/袋.②血浆pH、LA浓度和PAC-1阳性率在整个制备和保存过程中没有明显变化.③血浆内LDH、血小板CD62p阳性率和血小板抗GPIb-Ⅸ-Ⅴ荧光强度在血小板冰冻保存后出现明显升高.④与FPRP比较,cryo-FPRP诱导的血浆凝固时间明显缩短.结论:①本研究选择的离心分离制备FPRP条件可高效分离无偿献血者的血小板,同时不会导致血小板激活率增加.②深低温保存无偿献血者的新鲜富含血小板血浆可有效防止代谢产物的积累和pH下降,并且可以高效预防血小板GPⅡb/Ⅲa的激活.③冰冻保存后部分血小板胞膜受到明显损害.④血小板胞膜表面GpIb-Ⅸ-Ⅴ复合物的数量增加,促凝血活性明显增强.

A型全血加入O型全血后的血液流变学变化

为了研究异型输血时A型受者接受大剂量O型全血的血液流变学(红细胞计数、红细胞聚集指数、红细胞变形指数、红细胞刚性指数、全血还原黏度)的变化,取4℃保存24小时的全血,于A型全血60 ml中分别加入9、12、15、18 ml O型全血,其量相当于50公斤个体输入600、800、1000和1200 ml血液,然后置37℃孵箱,用摇摆器以80次/分钟摇动混匀.分别在30分钟、2、4、8、12和24小时留取标本,使用FASCO-系列3020B型全自动血流仪进行血液流变学检查.结果表明:不同比例混合后不同比例间的红细胞计数、聚集指数、变形指数、刚性指数、全血还原黏度无显著性差异,混合血液不同时间红细胞聚集指数无差异,其它4项指标有显著性差异.结论:A型全血与O型全血大混合达60:18时,对混合后血液流变学指标无影响,推测50公斤体重伤病员,快速输入O型全血1200 ml短期内对红细胞功能无明显的损害.

血小板胞内海藻糖测定方法的建立和评价

本研究的目的是建立一种适用、方便和快速的血小板胞内海藻糖浓度的测定方法,用于海藻糖负载技术的优化和血小板冻干保存.采用三氯乙酸沉淀细胞蛋白,硫酸-蒽酮法测定血小板胞内海藻糖的浓度,同时作高效液相色谱分析.结果表明,负载液中海藻糖浓度为1.7%,硫酸-蒽酮法测定血小板胞内海藻糖浓度为0.22%,高效液相色谱测定为0.20%.硫酸-蒽酮法测定海藻糖的回收率平均为100.7%,稳定性和重复性较好.结论:该方法测定血小板胞内海藻糖较准确,可靠,适用于细胞内海藻糖浓度的测定.

高剂量化疗联合自体外周血造血干细胞移植时骨髓及外周血采集物中CD34+细胞黏附分子的表达

本研究的目的是应用免疫荧光直接三色标记和流式细胞术(FCM),观测高剂量化疗(HDC)联合自体外周血造血干细胞移植(APBSCT)时不同阶段的骨髓及外周血CD34+细胞,表达CD54、CD49d和CD62L的情况,探讨不同来源的CD34+细胞表达黏附分子的差异及其临床意义.将动员前、干细胞采集后和移植结束而骨髓重建后的骨髓样本及每次外周血单个核细胞样本,以CD34-PE和CD45-PerCP标记的同时,分别加CD54-FITC、CD49d-FITC、CD62L-FITC直接三色荧光标记,应用FACS测定CD34+细胞及各黏附分子表达情况,并比较不同时段骨髓中各类黏附分子表达的差异,以及外周血造血干细胞采集物与动员前骨髓中各类黏附分子表达的差异.结果表明,动员前、采集后及移植重建后骨髓中CD34+细胞对CD54、CD49d和CD62L表达的变化无统计学差异;造血干细胞第1和第2次采集物之间CD34+细胞对CD54、CD49d和CD62L的表达变化也无统计学差异;而造血干细胞采集物中CD34+、CD49+细胞较之动员前骨髓中CD34+CD49d+细胞明显减少(P=0.001).结论:化疗联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的动员方法,可使骨髓中CD34+细胞的CD49d表达下调,并使之动员而进入外周血.移植重建后骨髓中CD34+细胞的CD49d表达趋于正常,其进一步的临床意义有待更多的病例积累予以阐明.

同胞异基因外周血干细胞移植治疗白血病研究

本研究观察异基因外周血干细胞移植(PBSCT)治疗白血病的疗效与副作用.所选供者均为HLA-A、B、DR位点与患者完全相同的同胞兄弟姐妹.供者经250μg/kg rhG-CSF动员5天后,单采外周血干细胞1-2次.4例白血病病人经过改良Bu/Cy预处理方案,输入单个核细胞6.78×108/kg±1.96×108/kg(5×108/kg-8.67×108/kg),其中CD34+为15.02×106/kg±8.93×106/kg(5.3×106/kg-24.23×106/kg),用MTX+CsA+MMF预防急性移植物抗宿主病(aGVHD).结果表明:移植前2天到移植后2天白细胞降至低,移植后11-17天中性粒细胞》0.5×109/L,移植后11到55天血小板》50×109/L.4例中2例出现aGVHD,2例出现cGVHD,2例出现感染.移植后28天复查骨髓显示造血恢复,STR位点的DNA检查显示供者细胞生长.结论:采用改良Bu/Cy方案和用MTX+CsA+MMF预防aGVHD方案进行PBSCT治疗白血病是一种安全、可靠的治疗方法.

ABO血型不合的异基因造血干细胞移植后红系恢复多因素分析

本研究目的是探讨ABO血型不合的异基因造血干细胞移植后影响红系恢复时间的多种因素.应用Cox回归模型对157例ABO血型不合的allo-HSCT患者的性别、年龄、移植方式、HLA相合/HLA不合、预处理方案、GVHD预防、Ⅰ-Ⅳ度GVHD发生、CMV感染及血型不合的类型进行多因素综合分析.结果表明:经Cox回归多因素综合分析,次要血型不合、输注的有核细胞数、年龄和非血缘关系的骨髓移植,为影响红系恢复时间的4个主要因素.结论:次要血型不合及输注细胞数多的患者红系恢复较快,而年龄大和非血缘骨髓移植的患者红系恢复慢.

广东地区汉族正常人群HLA-E基因多态性研究

为了检测广东地区汉族正常人群HLA-E基因的多态性,并分析HLA-E与典型HLA-Ⅰ类(Ia)位点之间的连锁关系,采用PCR-SSP方法检测广东地区150个无血缘相关的正常人的HLA-E基因型,同时用NIH标准微量淋巴细胞毒方法检测其中106人HLA-A,-B基因型,对HLA-E与HLA-A,-B位点之间作连锁分析.结果发现,在广东地区汉族正常人群中共检出3个HLA-E等位基因:HLA-E*0101,HLA-E*01031,HLA-E*01032,其基因频率分别为45.33%,32.33%,22.33%.未检出E*0102和E*0104.HLA-E与HLA-A,-B位点之间B15/*E01032及A2/E*01032存在连锁不平衡,除此之外其他任何两位点之间不存在连锁不平衡.结论:HLA-E高度保守的多态性提示其生物学特性可能有别于HLA-Ia分子.

人K562白血病细胞来源的树突状细胞低温冻存方法的研究

本研究的目的是探讨经低温保存的树突状细胞(dendritic cell,DC)的生物学特性,寻找一种较为简便有效的冻存方式,为DC的临床过继回输提供保存方法.将由K562细胞诱导培养产生的DC(K562-DC),用含10%二甲亚砜(DMSO)及20%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640作为冻存剂,利用分步法分别将其冻存于-80℃冰箱及-196℃液氮中,然后于不同时间将K562-DC复苏,复苏后检测两组细胞的存活率、表面分子表达、刺激指数及其介导CTL对K562细胞的杀伤率,比较冻存前后及两组间的差异.结果发现,冻存前后K562-DC(K562-DC于-80℃或液氮冻存1月)细胞形态无明显变化,表面分子表达及刺激T细胞增殖的能力无明显差别(P》0.05).此外,在-80℃冰箱及-196℃液氮中冻存的K562-DC,在冻存后1月以内复苏,细胞的存活率、刺激T细胞增殖的能力及其介导的杀伤效应无差别;但当冻存时间超过1月时,两组间有明显差别.结论,两种冻存方式冻存K562-DC,冻存时间较短时(1月以内),其刺激淋巴细胞及其介导CTL的杀伤能力相同;冻存时间较长时(》1月),-196℃液氮效果明显优于-80℃超低温冰箱.

雄激素联合小剂量全反式维甲酸治疗骨髓增生异常综合征

为了研究骨髓增生异常综合征的治疗效果,应用雄激素康力龙或丹那唑联合小剂量全反式雏甲酸(ATRA)治疗55例骨髓增生异常综合征(MDS),其中RA 41例、RAEB11例、RAEB-t 2例、CMML 1例.给药方法:丹那唑600mg/d或康力龙6 mg/d,ATRA 10 mg/d,疗程至少3月.结果表明:治疗3个月后在53例可评价者中,按照MDS国际工作组疗效标准判定,完全缓解1例(1.9%),部分缓解2例(3.8%);在血液学改善方面显效15例(28.3%),微效4例(7.5%),总有效率36.5%.继续进行追访,中位时间4月(0-48个月),总有效率39.6%.治疗前后骨髓原始细胞无显著变化,病态造血仅3例明显改善.结论:雄激素联合小剂量ATRA对低危险组MDS是一种比较有效、经济的治疗方法.

荧光原位杂交技术在急性粒-单核细胞白血病inv(16)检测中的应用研究

为了探讨荧光原位杂交(FISH)技术检测inv(16)(p13q22),在急性粒-单核细胞白血病临床诊断和预后判断中的意义,采用MYH11探针,包括双重标记序列,对6例形态学诊断为急性粒-单核细胞白血病的骨髓细胞中期染色体进行CBFβ-MYH11融合基因的检测,并与经典细胞遗传学比较.结果表明:G显带核型分析发现4例inv(16)(2例M4Eo和2例M4),其中1例M4同时伴有22三体(+22),1例为M4CR 8个月后复发同时伴亚2倍体核型.FISH检测6例均显示inv(16)异常荧光信号,其中例2除inv(16)外还同时发现16p13缺失的红色荧光信号.结论:FISH检测inv(16)的敏感性高,特异性强,是细胞遗传学检查的重要补充,对M4的临床诊断,预后判断具有重要的临床价值.

bcr-abl基因检测寡核苷酸芯片的制备及分析

为了研究bcr-abl融合基因检测芯片在白血病诊断、分型、治疗方案选择及预后判断中的应用价值,设计了融合基因检测探针,制成寡核苷酸芯片;采用逆转录方法、荧光标记白血病细胞cDNA并进行杂交,以检测白血病细胞中bcr-abl基因.结果表明:通过对不同杂交温度、洗涤条件等的探索获得了较好的反应条件并用制备的芯片检测出了细胞株中的bcr-abl融合基因.结论:应用寡核苷酸芯片检测白血病细胞bcr-abl融合基因有独特的优势,具有一定的临床应用价值,但也存在一定的不足,若对芯片进一步改进,则今后在血液病方面应用前景是非常广阔的.

酪氨酸激酶抑制剂STI571与P21WAF基因克隆治疗慢性粒细胞白血病的实验研究

本研究探讨酪氨酸激酶抑制剂STI571和P21WAF基因克隆对慢性粒细胞白血病急变K562细胞株的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的治疗作用.RT-PCR扩增P21WAF基因,胶纯化回收后连接到T载体测序,序列正确后构建P21-pcDNA3.1载体,将P21-pcDNA3.1与空载体分别以脂质体转染入P21蛋白表达缺如的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株,Western blot证实转染后有P21蛋白表达,MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡.结果表明:表达外源性P21蛋白的P21-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株,流式细胞仪显示G0/G1期细胞增多,MTT法显示P21-pcDNA3.1-K562细胞与STI571联合应用后,与单用STI571作用的K562细胞相比,凋亡细胞比例轻度减少,细胞存活率下降较慢.结论:表达外源P21蛋白能抑制K562细胞增殖,同时对STI571的促凋亡作用有轻度抑制,并降低K562细胞对STI571的敏感性.

骨髓涂片双色荧光原位杂交检测急性早幼粒细胞白血病的PML/RARα基因重排

为了探讨双色荧光原位杂交(D-FISH)技术在骨髓涂片(BMS)上检测PML/RARα基因重排对急性早幼粒细胞白血病(APL)的诊断价值,采用光谱绿(Spectrum Green)和光谱桔红(Spectrum Orange)分别标记PML和RARα两种基因探针对27例临床拟诊为APL的患者进行BMS-D-FISH检测,并与常规细胞遗传学(CCG)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测结果作比较.结果表明:18例初诊患者中,CCG检出t(15;17)者14例,他们的BMS-D-FISH和RT-PCR均证实有PML/RARα基因重排,从而肯定了对APL的诊断;而CCG未检见t(15;17)易位的4例中有1例显示阳性的BMS-D-FISH和RT-PCR结果,证实该例有隐匿易位存在,其余3例的两种检测均是阴性,因而他们被重新诊断为AML而不是APL;9例缓解患者中,CCG查出1例部分缓解患者有t(15;17)易位,其BMS-D-FISH和RT-PCR均为阳性,而8例完全缓解患者(6例伴正常核型,2例未作CCG检测)的BMS-D-FISH和RT-PCR检测显示6例阴性,2例阳性,提示该2例患者有微小残留病(MRD)存在.结论:BMS-D-FISH是检测APLPML/RARa基因重排的敏感可靠方法,有助于APL确诊及其MRD检测,适合于CCG检测失败、伴有隐匿易位、RT-PCR检测缺乏材料以及需作回顾性研究者.

新型bcl-2反义寡核苷酸F951提高白血病细胞对阿糖胞苷的敏感性

为了研究新型bcl-2反义寡核苷酸F951提高白血病细胞对化疗药物的敏感性,用不同浓度的F951及F951联合小剂量Ara-C与HL-60细胞共培养后,采用台盼蓝拒染法、MTT比色法检测HL-60细胞增殖;用流式细胞术和RT-PCR法检测Bcl-2蛋白及其mRNA表达;以DNA片段化分析和TdT酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测凋亡细胞.结果表明,F951与Ara-C联用组细胞生长抑制率高,药物处理96小时后,台盼蓝拒染率明显低于单纯Ara-C处理组:MTT检测A值与未处理组相比,FNS对照组、Ara-C组、F951组、F951+Ara-C组细胞抑制率分别为:2.8%、27.63%、37.66%、57.24%,F951处理后HL-60细胞Bcl-2 mRNA水平下降,Bcl-2蛋白减少,凝胶电泳可见典型的梯形带,F951与Ara-C联用后,诱导DNA ladder的作用更加明显,凋亡细胞多见.结论:F951可下调bcl-2基因表达,促进细胞凋亡而增强Ara-C的抗肿瘤作用.

原发性t(10;11)易位白血病CALM和AF10融合转录检测及其体外化疗敏感性分析

为了研究CALM和AF10融合转录在原发性t(10;11)易位白血病形成和治疗中的作用,采用RT-PCR技术检测了5例原发性t(10;11)易位白血病患者CALM-AF10融合转录,体外MTT法检测了其白血病细胞体外化疗敏感性.结果表明:在5例原发性t(10;11)易位白血病患者中检测到5种分子量的AF10-CALM融合转录和4种分子量的CALM-AF10融合转录;MTT法显示5例原发性t(10;11)易位白血病患者的白血病细胞有2例对体外化疗敏感(60%),36例非t(10;11)易位白血病细胞有31例对体外化疗敏感(86%),统计分析有显著差异(P《0.01),与临床治疗结果一致.化疗药物处理72小时,t(10;11)白血病细胞的凋亡率为(16.37±2.56)%,而非t(10;11)白血病细胞的为(33.75±5.59)%,差异有显著性(P《0.01).结论:CALM-AF10是t(10;11)易位白血病的常见特点之一,可能与该白血病发生密切相关,且t(10;11)易位白血病患者预后较差.

人重组可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导急性髓系白血病细胞凋亡的实验研究

为了研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对急性髓系白血病(AML)细胞的作用,通过MTT比色法测定不同浓度TRAIL对39例AML患者(病例组)和21例健康人(对照组)的骨髓或外周血单个核细胞的杀伤率,用流式细胞术检测细胞凋亡.结果发现,不同浓度TRAIL对AML细胞均有不同程度的杀伤作用,而对正常细胞无此作用.结论:TRAIL能通过诱导细胞凋亡而杀伤AML细胞,是一种有望应用于临床白血病治疗的新型生物制剂.

吲哚美辛对CML细胞增殖抑制效应与STAT信号转导途径抑制相关

本研究的目的是观察v引哚关辛作用下慢性粒细胞白血病(CML)细胞增殖抑制过程中JAK2、STAT1和STAT5蛋白质表达水平的变化及细胞内分布,揭示吲哚关辛抑制CML细胞增殖的分子机制.采用MTT及台盼蓝拒染法检测吲哚美辛对CML细胞的增殖抑制作用,用Western blot分析CML细胞JAK2、STAT1和STAT5蛋白质表达,用间接免疫荧光技术观察STAT1和STAT5在吲哚美辛干预的CML细胞中的定位及变化.结果表明:400 μmol/L浓度的吲哚美辛能明显抑制CML细胞增殖及STAT1、STAT5蛋白质表达,但对JAK2蛋白无影响;STAT1和STAT5主要分布于细胞胞浆中.结论:吲哚美辛可抑制CML细胞增殖,其机制可能与药物下调STAT1、STAT5蛋白质表达或与阻断细胞生长信号传导有关.

血液科病房感染致病菌分布特点及药物敏感性分析

为了了解本院近两年血液科病房致病菌临床分布特点及其对抗生素的药物敏感性,按常规方法从标本中对致病菌进行分离和培养.细菌药敏试验采用Kirby-Bauer法,真菌药敏试验应用ATBFUNGUS药敏条.结果显示,从所有送检标本中分离出致病菌共102株,其中革兰阳性菌(G+菌)占42.2%,革兰阴性菌(G-菌)占34.3%,真菌占3.5%.58.8%致病菌分离自恶性血液病患者,27.5%来自不明原因的发热(FUO)患者.此外,在患者处于粒细胞缺乏或者白细胞减少时分离出的致病菌就占到51.0%.分离出的真菌大多对抗真菌药物敏感,而G+菌对万古霉素(vancomycin)敏感,G-菌对亚胺培南(imipenem)敏感,多数细菌呈多重耐药性.结论:血液科病房感染与患者自身抵抗力低下、白细胞减少或粒细胞缺乏、肿瘤负荷过重等多种因素有关.临床上及时进行微生物学检查和药敏试验,对合理选择抗生素、降低感染发生率和死亡率以及减少耐药菌株产生均有重要价值.

自身免疫溶血性贫血患者抗体筛选观察

为了观察自身免疫溶血性贫血(AIHA)患者的同种抗体,用氯奎放散试验检测自身抗体掩盖的同种抗体,用乙醚放散试验检测自身抗体的特异性.结果表明:38例AIHA病人中,间抗阳性者19例,其中合同种抗体者7例(抗-D 1例,抗-E 4例,抗-CE 2例),自身抗体具有血型特异性者5例(抗-E 3例,抗-C 1例,抗-c1例).结论:采用氯奎放散试验、乙醚放散试验等检测被自身抗体掩盖的同种抗体,对AIHA患者的安全输血很重要.

环孢菌素A联合雄性激素治疗骨髓增生异常综合征初步报告

为了探讨环孢菌素A(CsA)联合雄性激素(Adr)方案治疗骨髓增生异常综合征(MDS)的临床疗效,采用CsA联合Adr综合方案治疗MDS-RA患者4例,观察患者血像、骨髓细胞形态学、染色体等指标变化.结果表明:4例患者均有血液学反应,全部病例未见严重副作用,未发现向白血病转化,治疗后骨髓细胞形态学和染色体未见改变.结论:CsA联合Adr综合方案治疗MDS-RA取得了明确疗效,对改善RA患者血细胞减少是有效的,其作用机制有待进一步研究.

急性髓性白血病完全缓解患者残留白血病细胞检测研究

本研究的目的是观察急性髓性白血病患者完全缓解后血液和骨髓中微小残留病变变化情况,并探讨微小残留病变在监测急性髓性白血病复发中的应用价值.用流式细胞术检测33例化疗达完全缓解的急性髓性白血病患者血液和骨髓中残留白血病细胞(residual leukemic cells,RLC).结果显示:急性髓性白血病完全缓解组和正常对照组外周血RLC分别为(4.7518±4.1537)%和(0.4835±0.2005)%,二者比较有统计学差异(P《0.001);完全缓解组骨髓和正常对照组骨髓RLC分别为(17.9082±20.4819)%和(0.7285±0.2209)%,二者比较有统计学差异(P《0.001);持续缓解组与复发组外周血RLC分别为(2.233±1.5923)%和(10.2369±9.4714)%;持续缓解组与复发组骨髓RLC分别为(4.779±3.0336)%和(38.0685±19.4295)%.二组比较有统计学差异(P《0.001).结论:应用流式细胞术检测残留白血病细胞对及时预测复发有重要意义,有利于在复发早期进行治疗.

血液疾患骨髓微血管密度的研究

为了探讨血液系统疾病骨髓血管新生的状态及意义,采用改良的乙二醇-甲基丙烯酸酯(GMA)塑料包埋骨髓病理切片和免疫组织化学染色检测贫血、急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓细胞白血病(CML)患者的骨髓微血管密度(MVD).结果显示,初诊的恶性血液病患者在治疗前骨髓MVD明显增加;急性白血病化疗完全缓解后骨髓MVD降至正常水平,未缓解者下降程度小,复发者再次升高至化疗前水平;贫血患者骨髓MVD也比对照组明显增高,但远不如急性白血病骨髓MVD增高的幅度大.结论:骨髓血管新生在急性白血病发生过程中有着重要的作用,抗血管新生治疗可能成为治疗白血病的新策略.

人脐血单个核细胞体外分化为内皮细胞的初步研究

为了探讨细胞因子组合在体外定向诱导人脐血单个核细胞(mononuclear cell,MNC)分化为内皮细胞的可行性,以及脐血干细胞在缺血性疾病中应用的可能性,利用源自人脐静脉血的MNC及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor-basic,bFGF)及胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-iike growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)的细胞因子组合的培养条件,体外进行向内皮细胞的诱导分化.结果表明:在该体系条件下可诱导分化出典型梭形内皮细胞,流式细胞术检测vWF(+)细胞率可达80%以上,电镜观察发现在胞浆中含有内皮细胞的Weibel-Palade小体.结论:脐血单个核细胞在VEGF等细胞因子的诱导下有可能定向分化为内皮细胞,脐血有望成为治疗缺血性疾病成体干细胞的一个供源.

von Willebrand因子裂解酶活性水平的检测及其临床应用

血管性血友病因子裂解酶(vWF-cp)是新近发现的一个金属蛋白酶,其活性在多种生理病理状态下发生改变.为了研究von Willebrand因子裂解酶活性检测及其临床应用,用ELISA法检测了vWF-cp酶解前及裂解后血清(浆)中血管性血友病因子(vWF)的胶原结合能力,两者之比作为该待测血清(浆)的相对vWF-cp活性水平.同时观察血栓性血小板减少性紫癜(TTP)患者与肿瘤患者体内vWF-cp活性的改变.结果表明,该方法准确测出了87名健康成人和79例患者血样的残余胶原结合力(R-CBA),批内变异和批间变异分别为3 60%(n=9)和8.35%(n=5).53名健康成人血清vWF-cp活性水平为(79.47±10.78)%,30名健康成人血浆vWF-cp活性水平为(78.79±9.17)%.6例TTP患者中5例血浆vWF-cp活性水平显著降低,25例良性肿瘤患者血清vWF-cp水平轻度降低,49例恶性肿瘤患者则明显下降(P值分别小于0.001,0.03和0.001).结论:以R-CBA检测vWF-cp活性水平简单易行,可应用于临床检验.恶性肿瘤患者,尤其是TTP患者血浆(清)vWF-cp活性水平显著降低.

非病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠32D细胞系中的表达

为了观察非病毒载体pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠32D细胞系中的表达,将B结构域缺失(△760aa-1639aa)的人FⅧcDNA(hFⅧBDcDNA)亚克隆至质粒载体pRC/RSV,构建重组质粒载体pRC/RSV-hFⅧBDcDNA.经SuperFeot Transfection Reagent转染小鼠32D细胞系,分别采用一期法、ELISA法和RT-PCR检测细胞培养上清液中人FⅧ的促凝活性(hFⅧ:C)和抗原含量(hFⅧ:Ag)以及细胞中hFⅧBDcDNA的转录.结果表明:小鼠32D细胞系培养上清液中的人FⅧ:Ag高达到了450.08毫微克/(106细胞·24小时),hFⅧ:C高达到了2.01单位/(106细胞·24小时),RT-PCR可检测到32D细胞中hFⅧBDcDNA转录的mRNA.结论:非病毒质粒载体pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因能够在小鼠32D细胞系中表达人FⅧ蛋白,所表达的FⅧ与正常人血浆中的野生型FⅧ具有相似的凝血活性.

静脉血栓的抗磷脂蛋白抗体与抗凝血、纤维蛋白溶解关系

为了探讨静脉血栓的病因病理及其与抗凝血、纤维蛋白溶解的关系,对47例静脉血栓(VT)患者用酶联免疫法检测抗心肌磷脂抗体(ACA),用凝血法测定狼疮抗凝物(LA)和抗活化蛋白C抗性(APCR),用多聚酶链反应内切酶法鉴定因子V Leiden,用发色底物法测定抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)、蛋白C(PC)、纤溶酶原(Plg)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、组织纤溶酶原激活物抑制物(tPAI)等抗凝血、纤维蛋白溶解活性.结果表明:VT患者中34%有ACA和(或)LA阳性,其中以ACA IgG和LA为主;9.5%的Plg缺乏,8.3%的tPAI升高(明显高于对照,P《0.005);ATⅢ、PC、tPA缺乏者依次为4.5%、4.5%、2.8%(与对照无差异性,P》0.05);ATⅢ、PC、Plg联合缺乏者1例;APCR未发现相应的factor V Leiden;抗磷脂蛋白抗体(APA)阳性和阴性组之间的各抗凝血和纤维蛋白溶解活性没有明显差异性;4例APCR阳性,3例ACA和(或)LA阳性,这3例血浆和正常血浆混合后2例APCR并没有完全得到纠正.结论:抗磷脂蛋白抗体和纤维蛋白溶解异常是VT较多见的相关病理因素;LA和(或)ACA干扰蛋白C抗凝血途径,使之形成获得性APCR,而此APCR可能是体内导致易栓的病因之一.

尿毒症患者凝血因子Ⅶ水平及其影响因素

本研究检测慢性肾功能衰竭尿毒症期患者血浆凝血因子Ⅶ(FⅦ)水平并初步探讨其影响因素.选取30例慢性肾功能衰竭尿毒症期患者,采用一期凝血法分别检测血液透析前及血液透析1月后血浆凝血因子Ⅶ水平:因子Ⅶ活性(FⅦ:C);采用重组可溶性组织因子一期凝血法检测活化因子Ⅶ(FⅦa);采用酶联免疫吸附法检测因子Ⅶ抗原(FⅦAg).结果显示:①尿毒症患者血液透析前FⅦa、FⅦ:C和FⅦAg水平分别为4.00±0.86 μg/L、(148.5±40.4)%和(99.8±21.1)%,健康对照则分别为2.77±1.02μg/L、(113.1±33.0)%和(73.7±18.3)%,尿毒症患者的FⅦa,FⅦ:C,FⅦAg水平与健康对照比较显著增高(P值均《0.05);②尿毒症患者血液透析后FⅦa,FⅦ:C和FⅦAg水平分别为5.56±1.45μg/L、(200.8±68.7)%和(124.1±19.3)%,与血液透析前相比较,FⅦa,FⅦ:C和FⅦAg水平均显著增高(P值均《0.05);③尿毒症患者血液透析前FⅦAg,FⅦ:C及FⅦa水平与血尿素氮水平呈正相关(相关系数分别为r=0.37,P《0.05;r=0.40,P《0.05;r=0.28,P《0.05);与血肌酐水平亦呈正相关(相关系数分别为r=0.14,P《0.05;r=0.23,P《0.05;r=0.18,P《0.05);血液透析后FⅦ水平与血尿素氮及肌酐水平无相关.结论:中国人尿毒症患者血浆凝血因子Ⅶ活性增高,激活增多,生成亦增多,其FⅦ异常与肾功能损伤呈正相关,血液透析可能进一步加重凝血因子Ⅶ的异常.尿毒症患者FⅦ异常可能是导致此类患者心血管性并发症及心血管源性死亡的重要原因.

免疫磁性分选系统大量分选CD34+细胞的实验研究

CD34+细胞的分离纯化在自体外周血干细胞、异基因骨髓移植/外周血干细胞移植及干细胞研究中具有重要的应用价值.为了摸索大量分选CD34+细胞的方法,本研究应用Isolex300i磁性分选系统富集CD34+细胞,采用流式细胞术监测分选前后细胞表面标志,经CD34+细胞体外增殖实验及克隆形成实验验证分选获得的CD34+细胞生物学活性.结果显示,所完成的5例次自体外周血富集CD34+细胞时,先收获单个核细胞约(3.5-6.0)×1010,CD34+细胞占单个核细胞百分率为(0.55-1.2)%;收获的CD34+阳性细胞总数为(2-3)×108,纯度为(75-85)%,回收率为(40-65)%.体外实验表明,在SCF+IL-3+FL+TPO+EPO存在下,经过3-4天培养,可扩增2-3倍;经CFU-GM、BFU-E集落形成实验显示具有形成集落的能力,证实分选后细胞具有造血祖细胞生物活性.结论:应用Isolex300iCD34+细胞分选仪可以高效大量富集CD34+细胞,适于临床应用.

氨磷汀对化疗中造血干/祖细胞的保护作用

为了评估氨磷汀(amifostine,AMF)在保护正常造血干/祖细胞免受化疗药物依托泊甙(etoposide,VP-16)损伤方面的作用,将脐血单个核细胞(CBMNC)、新鲜和冻存的外周血造血干细胞(PBSC)和HL-60细胞,分别分为AMF+VP-16组、VP-16组、AMF组和空白对照组,用台盼蓝拒染法检测细胞活性,CFU-GM集落培养计数,流式细胞术(FCM)测定细胞的凋亡率.结果显示:在CBMNC、新鲜和冻存的PBSC样本中,AMF+VP-16组的存活率和集落形成能力较VP-16组显著提高(P《0.05);在CBMNC样本中,3种浓度的AMF组的集落形成能力与对照组的差异无统计学意义(P》0.05);在HL-60细胞的样本中,AMF+VP-16组与VP 16组凋亡率的差异无统计学意义(P》0.05).结论:AMF能保护正常造血干/祖细胞免受化疗药物VP-16的损伤,并且不影响VP-16对HL-60细胞的杀伤效果,但是AMF不能直接促进脐血造血干/祖细胞的生长和分化.

胚胎成纤维细胞与含LIF的培养体系支持鼠造血祖细胞体外扩增

为了探讨胚胎成纤维细胞与含白血病抑制因子(LIF)的培养体系对鼠骨髓造血祖细胞体外扩增效应,并观察其对造血表面归巢相关黏附分子VLA-4(CD49d)、VLA-5(CD49e)、LFA-1(CD11a)、HCAM(CD44)、L-selectin(CD62L)的表达影响,将丝裂霉素C灭活的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和含LIF的培养体系与鼠骨髓单个核细胞(BMMNC)体外共同培养7天,检测BMMNC细胞总数、CFC、Sca-1+细胞百分率、细胞凋亡率和Sca-1+细胞表面黏附分子CD49d、CD49e、CD11a、CD44、CD62L的表达率.结果表明:MEF和含LIF的培养体系明显扩增了BMMNC细胞总数、CFC和Sca-1+细胞,抑制细胞凋亡(P《0.05),而去掉MEF和LIF后的对照组培养体系BMMNC细胞总数明显下降,CFC和Sca-1+细胞完全死亡,细胞大部分凋亡(P《0.01).扩增后Sca-1+细胞表面各黏附分子CD49d、CD44和CD61L表达与扩增前相当(P《0.05),而CD49e和CD11a表达明显高于扩增前(P《0.05).结论:胚胎成纤维细胞和含LIF的培养体系体不仅可以体外显著扩增鼠骨髓造血祖细胞,而且扩增后的造血祖细胞(HPC)总体上保持其表面归巢相关黏附分子的表达,扩增后HPC归巢功能不受影响.

原子力显微镜对骨髓CD34+细胞的膜表面超微结构研究

本研究目的是利用原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)观察骨髓CD34+造血细胞的膜表面超微结构,对比正常人与白血病患者CD34+造血细胞膜表面超微结构的形态学差异.将免疫磁珠分离仪富集的CD34+细胞滴至新鲜剥离的云母片上,在空气中干燥后用AFM进行观察.结果表明:利用AFM附带软件IP2.1的线分析及面分析功能,得到正常人与白血病患者CD34+造血细胞膜表面结构的几何参数,经比较,白血病患者CD34+造血细胞的高低差Rp-v、均方根粗糙度Rrms、平均粗糙度Ra、平均高度Z 4个几何参数值均明显大于正常人.结论:AFM能准确直观地观察到CD34+造血细胞的膜表面超微结构,并同时获得其膜表面特征几何参数,可为临床白血病的快速诊断、HSPCT移植物筛选和预后提供重要参考.

新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的理化分析

为了对构建成功的新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的部分物化表征进行分析鉴定,采用Edman法、SDS-PAGE法、胰蛋白酶消化的MALDI-TOF-MS质谱法、蛋白印迹法和MTT法分别测定该融合蛋白的N-末端6个氨基酸、相对分子量、肽谱、抗原特异性以及靶向杀伤生物学活性.结果表明:所构建表达纯化的新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白N末端6个氨基酸序列为Met-Ile-Asp-Lys-Gln-Ile-,而IL-6缺失24个氨基酸后的原序列为Ile-Asp-Lys-Gln-Ile-,由于采用了大肠杆菌表达系统,因此在N末端第1位多出了1个Met,经12%SDS-PAGE蛋白电泳和凝胶成像系统分析计算,其相对分子量为58.75 kD,与理论值56.9 kD相比误差在5%之内.MALTI-TOF-MS质谱测定共获得10个与理论预测值相符的肽段,经瑞士生物信息研究所的EXPASY分子生物服务网站的Peptident数据库搜索证明,在分子量为57 kD左右的范围内未检索到与上述条件相符的已知蛋白,证明本融合蛋白为全新蛋白,与预测的目的蛋白相符.WB实验显示II6D24-PE40KDEI外毒素融合蛋白能与IL-6及PEA抗体特异性结合.MTT生物活性测定表明,该融合蛋白对表达IL-6R的多发性骨髓瘤细胞系U266产生特异性杀伤,而对不表达IL6R的CEM淋巴细胞系无任何杀伤.结论:所研制成功的重组IL6D24-PE40KDL外毒素融合蛋白的确为一全新的具有靶向杀伤生物活性的蛋白质,与设计的完全一致,同时也证实了构建策略的可行性.

2004年12卷英文关键词索引

2004年12卷中文关键词索引

2004年12卷作者索引