中国实验血液学杂志
Journal of Experimental Hematology 중국실험혈액학잡지
- 主管单位： 实验血液学杂志
- 主办单位： 中国科学技术协会
- 影响因子： 0.98
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 11-4423/R
- 国内刊号： 陈潮
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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β-catenin在慢性髓系白血病中的作用机制研究进展
目的:β-连蛋白β-catenin是Wnt信号通路的重要成员.随着Wnt通路与肿瘤关系的深入研究,人们发现β-catenin蛋白在细胞内的异常累积不仅是Wnt通路激活的标志事件,还是多种肿瘤中的常见事件之一.已有报道显示,在慢性髓系白血病(CML)中急变期及伊马替尼(IM)耐药期都有β-catenin蛋白的异常表达,而特异性地抑制β-catenin蛋白后,CML对IM的敏感性得到提高并且延缓急变期的发生.本文就β-catenin在CML中的作用机制的经典信号通路及新的基因和通路新研究进展作一综述.
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地中海贫血实验室诊断研究进展
地中海贫血的实验室诊断方法主要包括筛查法和基因检测技术两大类.前者以红细胞形态及理化特性为其诊断依据,包括血常规检测、红细胞形态学检测、红细胞渗透脆性实验、血红蛋白分析技术等;后者主要以PCR为基础而进行的各种基因检测技术,主要包括跨越断裂位点(gap-PCR)法、PCR结合反向点杂交法(PCR-RDB)、实时荧光定量PCR、基于实时PCR的溶解曲线分析技术、基因芯片、DNA序列测定等.本文综述近年来地中海贫血的实验室诊断方法,筛查法和基因诊断技术的联合应用,为地中海贫血的诊断提供参考.
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组蛋白修饰在B细胞淋巴瘤发病机制中的研究进展
近年来人们认识到异常表观遗传修饰与B细胞淋巴瘤的发生发展密切相关.表观遗传学是研究DNA序列不改变的情况下基因表达和功能发生遗传性改变的一门学科,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA等,其中组蛋白修饰是重要的表观遗传修饰.研究表明,组蛋白修饰异常是B细胞淋巴瘤重要的发病机理,尤其是研究较为深入的组蛋白甲基化及乙酰化异常.同时,还可以通过改变表观遗传修饰达到治疗肿瘤的目的,这成为当前一大研究的热点.因此,本文主要从组蛋白修饰控制生发中心B细胞发育和组蛋白修饰酶突变这2个方面对B细胞淋巴瘤发病机制进行研究,并讨论对应表观遗传治疗.
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骨髓增殖性肿瘤相关基因突变及细胞因子的当前认识
骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasm,MPN)是以一系或多系骨髓细胞异常增殖和扩增为特征的克隆性造血干细胞疾病,其中BCR-ABL阴性MPN包括真性红细胞增多症(polycythemia vera,PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia,ET)以及原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis,PMF).因为JAK2、CALR及MPL基因突变的发现,MPN的发病机制得以阐释,并为MPN提供了更为完善的分子学诊断标准.随后,越来越多预后相关的新突变基因得到认识,同时发现细胞因子参与MPN的发生发展过程,这为MPN的诊断、预后分层及新的治疗管理提供了理论依据.本文就MPN相关基因突变与细胞因子在疾病进程中的作用机制及预后特点进行简要的综述.
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CAR-T免疫治疗在血液肿瘤治疗中的研究现状和挑战
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞治疗技术经过近30年的发展,逐渐成为治疗血液肿瘤的新趋势.随着基因工程技术的不断发展,CAR-T技术已经经历了4代革新.CAR-T结构从单一信号分子发展到2个及2个以上共刺激分子,再到编码CAR基因或启动子,CAR-T技术发展不断成熟.CAR-T能特异识别肿瘤抗原,不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)限制性的影响,在治疗血液肿瘤领域取得了突破性的成果.本文就CAR-T的历史、结构和作用机理、以及在急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、多发性骨髓瘤等血液肿瘤临床治疗中的研究现状和面临的挑战作一综述.
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长链非编码RNA与弥漫性大B细胞淋巴瘤关系的研究进展
弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)发病机制未明,治疗效果差,发生率与死亡率仍在不断攀升,因此探究DLBCL的发病机制与发现新的分子诊断标记和治疗靶点尤为重要.长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是真核细胞中一类转录本长度大于200 bp的RNA,可在转录水平及转录后水平调控其靶基因的表达,并参与多种肿瘤的发生、发展、侵袭及转移等过程.近年来长链非编码RNA在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用不断被发现及证实.本文就HULC、PEG10、LincRNA-p21、HOTAIR、LUNAR1、MALAT1和Sub-SigLnc-17等长链非编码RNA与弥漫性大B细胞淋巴瘤的关系做一综述,希望为相关基础研究及临床诊断和治疗提供新思路.
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复发/难治性弥漫大B细胞淋巴瘤的分子诊疗进展
弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是成人非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma,NHL)常见的病理类型,具有侵袭性,约1/3患者为难治型或终复发.根据其基因异质性,可将DLBCL分为3种主要的分子亚型:生发中心B细胞型(germinal center B-cell Like,GCB)、活化B细胞型(activated B-cell like,ABC)和原发性纵隔B细胞淋巴瘤(primary mediastinal B-cell lymphoma,PMBL).这些分子亚型分别起源于B细胞分化的不同阶段,其致病机制各异.因此,以DLBCL不同亚型特异性基因为作用靶点的治疗方法,较传统化疗方案更为精准,这无疑为治疗复发/难治性DLBCL带来了新的希望.本文就DLBCL三种亚型的诊断和治疗进展作一综述.
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来那度胺在复发难治性血液系统疾病中的研究及应用进展
来那度胺是一种新型免疫调节剂,是沙利度胺的衍生物,对于血液系统疾病具有较高的治疗反应率和安全性.本文的目的在于评估来那度胺在复发难治性多发性骨髓瘤、复发难治性慢性淋巴细胞性白血病、复发难治性急性髓系白血病、复发难治性非霍奇金淋巴瘤、复发难治性经典型霍奇金淋巴瘤、复发难治性POEMS综合征疾病的治疗中的疗效及安全性,就来那度胺在复发难治性血液系统疾病中的新临床研究及其应用进展作一综述.
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免疫性血小板减少症指南的解读
自美国医学会2011年发布免疫性血小板减少症指南以来,我国率先依据询证医学对免疫性血小板减少症指南进行更新.近几年有许多突破性的临床研究成果被公布,尤其是中国血液工作者为提高免疫性血小板减少症的治疗做出了突出的贡献,但目前尚缺少文献对于儿童、成人、老年、孕妇免疫性血小板减少症进行系统药物介绍,仍有部分患者对于一、二线药物治疗无反应.故本文结合文献对指南进行解读,探索各个治疗方案的优缺点,探讨临床治疗的瓶颈,方便指南的执行和理解,为及时更新下一版指南探路铺石.
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不同化疗方案治疗成人初治非M3型AML的完全缓解率及不良反应
目的:比较3种不同化疗方案(柔红霉素、国产去甲氧柔红霉素、进口去甲氧柔红霉素分别联合阿糖胞苷)治疗成人初治非M3型急性髓系白血病(AML)的完全缓解率及不良反应.方法:将本院收治的71例成人初治非M3型AML患者按治疗方案分为3组:A组:应用柔红霉素+阿糖胞苷方案(17例);B组:应用国产去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷方案(24例);C组:应用进口去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷方案(30例).比较3组患者治疗后的疗效及不良反应的发生情况.结果:C组完全缓解率(86.67％)显著高于A组(52.94％)和B组(70.83％),B组完全缓解率显著高于A组(P＜0.05).3组患者出现恶心呕吐、感染和骨髓抑制等不良反应发生率无统计学差异(P＞0.05).结论:去甲氧柔红霉素对非M3型AML患者的疗效优于柔红霉素,尤其进口药物的临床疗效更高;柔红霉素与去甲氧柔红霉素治疗后发生不良反应均在可控范围,故二者均可作为治疗AML患者的一线药物,患者可根据自身经济能力选择更为合适的药物.
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他汀类药物通过抑制Akt通路调控急性T淋巴细胞白血病细胞增殖与凋亡
目的:探讨他汀类药物对急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制.方法:Jurkat及CCRF-CEM细胞经不同浓度的氟伐他汀和辛伐他汀药物处理24 h,CCK-8法检测细胞增殖抑制情况;EdU法检测细胞DNA复制情况;AnnexinV/7-AAD双染法分析细胞凋亡情况;流式细胞术分析细胞周期的变化;免疫印迹法检测Cyclin D1、p21、p27、BAX、BCL-2及p-Akt蛋白的表达.结果:氟伐他汀、辛伐他汀均可抑制Jurkat及CCRF-CEM细胞增殖,且抑制效应呈一定的剂量依赖性.氟伐他汀浓度为0.2mmol/L时,Jurkat和CCRF-CEM细胞抑制率分别达41.14％和57.08％;而辛伐他汀浓度为0.2 mmol/L时,Jurkat和CCRF-CEM细胞抑制率分别达68.42％和77.10％,均接近或超过半数抑制,与溶剂对照组比较有显著差异(P＜0.05).不同浓度的氟伐他汀及辛伐他汀分别作用于Jurkat和CCRF-CEM细胞24h,其早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例均升高,且于0.2 mmol/L和0.3 mmol/L药物浓度时,其总凋亡比例显著升高,与溶剂对照组相比有显著差异(P＜0.05).细胞周期检测结果显示,氟伐他汀及辛伐他汀诱导Jurkat和CCRF-CEM细胞G1期阻滞.Western blot检测结果显示,Jurkat和CCRF-CEM细胞经氟伐他汀或辛伐他汀处理后,BAX、p21和p27表达量逐渐升高,Cyclin D1、BCL-2和p-Akt表达量逐渐减低.结论:他汀类药物可通过抑制Akt信号通路抑制T-ALL细胞的增殖,并诱导其凋亡.
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伴FLT3-ITD突变的急性髓系白血病的临床特征和预后
目的:探讨伴有FMS样酪氨酸激酶3-内部串联重复突变(FLT3-ITD)急性髓系白血病(AML)的临床特点和对治疗的反应.方法:回顾性分析从2014年1月到2017年7月初诊AML(除M3型)128例,分为FLT3-ITD突变和无FLT3-ITD突变组.FLT3-ITD和NPM1突变采用PCR和基因测序法检测.采用标准3+7方案或CAG作为首次诱导化疗方案.4人接受索拉非尼治疗.总生存期(OS)定义为从确诊到死亡或后随访之间的持续时间.统计采用SPSS 17.0软件,总体生存(overall survival,OS)采用Kaplan Meier方法计算.结果:有临床资料可评价97例,4例FLT3-TKD突变(占4.1％),19例FLT3-ITD突变(占19.59％).中位白细胞计数(WBC)、外周血幼稚细胞比例和乳酸脱氢酶(LDH)值在FLT3-ITD组明显升高,在FLT3-ITD突变组和无突变组分别为64.65(1.07-587.92)×109/L vs 39.68 (0.45-203.81)×109/L(P=0.00)、69.62(16-99)％ vs 36.35(0-92)％(P=0.00)和LDH 526(124-2729) U/L vs 265(20-1977) U/L(P=0.029).同时合并NPMI突变的比率在FLT3-ITD组和无FLT3-ITD组分别为36.8％ (7/19)和6.8％ (5/74) (P =0.002).CR+ PR在FLT3-ITD组低于无突变组[31.6％ (6/19) vs 64.9％ (48/74)] (P=0.028).OS时间在FLT3-ITD组较无突变组明显缩短,分别为5和18个月(P =0.027).OS在FLT3-ITD和NPM1双阳性患者与FLT3-ITD单阳性患者间无差异,均为5个月(P=0.880).接受索拉非尼治疗的患者中位OS时间为13个月.结论:FLT3-ITD是AML中的常见突变,FLT3-ITDAML更易并发NPM1基因突变,表现有更高的白细胞数和外周血原始细胞及LDH水平,其首次治疗后的CR率低,总体生存差.
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伊马替尼治疗尼洛替尼不耐受的慢性髓系白血病
目的:探讨慢性髓系白血病(慢性期)个体化治疗方案的选择.方法:对1例尼洛替尼不耐受的慢性髓系白血病(慢性期)患者的临床资料及治疗过程进行分析.结果:患者在完善相关检查确诊为慢性髓系白血病(慢性期)后给予尼洛替尼治疗.治疗3个月时评估病情,患者虽然获得了主要分子学缓解(MMR)和完全细胞遗传学缓解(CCyR),但在治疗的过程中发生3-4级的肝毒性,经过药物的减量及对症治疗,患者在3次停药后换用伊马替尼治疗,7个月时评估病情达MMR及CCyR.目前患者无任何不良反应,耐受良好.结论:伊马替尼可作为慢性髓系白血病(慢性期)患者对第二代TKI治疗不耐受时的一种治疗方法,其不良事件发生率低且疗效确切.
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急性髓系白血病患者视黄醇结合蛋白检测的临床意义
目的:研究急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者视黄醇结合蛋白(retinol-binding protein,RBP)的表达水平及其相关因素.方法:收集2012年10月至2016年2月入院初治AML患者123例及健康体检者100例的资料.分析RBP与AML患者性别、FAB分型、基因突变、白细胞数及长期预后等的相关性.结果:AML患者RBP表达水平(34.44±14.08 mg/L)明显低于健康对照组(61.02±34.97 mg/L)(P＜ 0.01).M3患者RBP表达水平(40.74±15.79 mg/L)明显高于M4(28.40±13.64 mg/L)(P＜0.01)与M5 (31.97±15.31 mg/L)(P＜0.05)患者,但与M2相比无显著性差异(35.20±11.51 mg/L) (P ＞0.05).AML患者RBP表达水平与患者外周血白细胞数呈负相关(r=-0.352,P＜ 0.01).亚组分析发现,RBP表达水平与白细胞数负相关主要见于M4(r=-0.563,P＜ 0.01)及M5患者(r=-0.423,P＜0.01).获得CR患者的RBP水平为48.64±9.24 mg/L,非常明显高于初始治疗前(P＜0.01),但仍显著低于健康对照组(P＜0.05),其中M3患者缓解后RBP水平为54.91±5.25 mg/L,非M3为41.36±7.33 mg/L,两者比较具有非常显著的差异(P＜0.01).结论:研究AML患者RBP表达水平可能为AML病理生理机制研究及治疗提供一定的参考信息.
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雷公藤内酯醇联合高三尖杉酯碱对KG-1α细胞增殖和凋亡的影响
目的:探讨低浓度雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)联合高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)对KG-1α细胞增殖与凋亡的影响及其可能机制.方法:应用CCK-8法检测不同浓度TPL和HHT单用及联用对KG-1α细胞增殖的影响,并计算其药物联合作用指数(combined index,CI);甲基纤维素集落形成实验检测细胞集落形成能力;流式细胞术检测细胞表面分子、细胞凋亡率及细胞周期变化;Western blot检测Akt信号通路相关蛋白在TPL及HHT作用前后的表达情况.结果:KG-1α细胞高表达CD34CD123而CD38缺失;TPL及HHT单用对KG-1α细胞增殖抑制并具剂量依赖性(r =0.952,r =0.992);低浓度联合用药与单药对比,前者细胞增殖、集落形成率更低,而细胞凋亡率增高;CI值亦提示低浓度TPL联合HHT呈高度协同作用.低浓度TPL联合HHT作用KG-1α细胞后,P-AktSer473、P-AktThr308、BCL-2、PARP及Survivin蛋白表达降低而PARP裂解增加.结论:低浓度TPL联合HHT可通过PI3K/Akt信号通路及下游蛋白协同抑制KG-1α细胞增殖,并诱导其凋亡.
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平均红细胞体积可作为慢性髓系白血病疗效的预测指标
目的:既往研究发现伊马替尼治疗慢性髓系白血病(CML)会诱发大细胞贫血,且贫血的发生率随着伊马替尼血药浓度增加而升高.本研究的目的是评估在启动酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗后平均红细胞体积(MCV)变化是否与CML慢性期(CML-CP)的治疗反应相关.方法:收集119例CML-CP患者接受TKI治疗后的MCV、分子学、细胞遗传学反应等资料,回顾性分析启动治疗后MCV变化与CML的临床特点、治疗效果的关系.结果:患者接受TKI治疗12个月后MCV值比初诊时显著升高(P =0.017).佳疗效达完全细胞遗传学反应(CCyR)组MCV升高的患者比例明显高于未达CCyR组(P =0.033).和MCV减低组相比,升高组患者更容易在接受TKI治疗后6个月和12个月获得CCyR(P=0.042,P=0.021),且更容易维持主要分子学反应(MMR)(P =0.030).结论:MCV作为一个简单易得的参数,可作为预测TKI遗传学反应的新指标.
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硼替佐米与高三尖杉酯碱在K562细胞中的联合作用及机制研究
目的:探讨硼替佐米(bortezomib,BTZ)与高三尖杉酯碱(homoharringonine,HHT)两药联合对K562细胞增殖和凋亡的影响及其联合作用机制与BCL-2、BAX、MCL-1蛋白的关系.方法:通过将K562细胞株按不同处理分为对照、BTZ 20 nmol/L、HHT 40 ng/ml、BTZ 20 nmol/L+ HHT 40 ng/ml共4组.采用MTT方法检测各处理组细胞增殖抑制率.采用Annexin V-FITC/PI双染色法流式细胞术检测各处理组细胞早期凋亡率,采用Western blot 法测定各处理组中BCL-2、BAX、MCL-1蛋白相对表达量.结果:BTZ+ HHT联合组作用于K562细胞24、48和72h后的增殖抑制率(％)高于BTZ及HHT单药组(P＜0.01).联合组K562细胞的早期凋亡率(％)高于BTZ及HHT 2个单药组(P＜0.05).联合组K562细胞的BCL-2蛋白相对表达量明显低于BTZ及HHT单药组(P＜0.05).联合组BAX蛋白相对表达量明显高于BTZ及HHT单药组(P＜0.05).MCL-1蛋白相对表达量高低:BTZ组＞对照组＞BTZ+ HHT联合组＞HHT组(组间比较P＜0.05).结论:BTZ与HHT联合可起协同抑制细胞增殖、诱导凋亡效应,其机制与明显下调BCL-2蛋白、上调BAX蛋白有关.此外,HHT可通过下调MCL-1蛋白表达增加K562细胞对BTZ作用的敏感性.
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成人急性髓系白血病患者化疗后发生院内感染影响因素及其防治对策研究
目的:探讨成人急性髓系白血病患者化疗后发生院内感染的影响因素及其防治对策.方法:回顾性分析2014年6月至2017年6月在本院就诊的109例成人急性髓系白血病患者化疗后感染的临床资料,回归分析患者临床因素,探究患者化疗后感染的影响因素.结果:109例患者接受化疗共267例次,发生感染168例次,医院感染率为62.92％,其主要发病部位包括上呼吸道感染和肺部感染等.168例次感染中有155例次采集标本并送实验室培养,获得病原菌32株,阳性率为20.6％(32/155),其中包括革兰氏阴性菌14株、革兰氏阳性菌9株、真菌4株及其他病原菌5株.统计发现,年龄超过40岁、春夏季住院、接受糖皮质激素治疗、高化疗强度、中性粒细胞数目、白细胞数目及血红蛋白含量是急性髓系白血病患者化疗后感染的独立危险因素(P＜0.05).结论:年龄超过40岁、春夏季住院、接受糖皮质激素治疗、高化疗强度、白细胞计数、中性粒细胞计数及血红蛋白含量是急性髓系白血病患者化疗后发生感染的独立危险因素;对有上述特征的患者应严密监视,做好预防工作必要时控制患者化疗强度,积极控制感染的发生,一旦发生感染,需及时强有力的抗感染治疗.
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胚胎干细胞对急性髓系白血病细胞KG-1a的影响
目的:研究人胚胎干细胞H9在体外对人急性髓系白血病细胞KG-1a增殖、凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法:体外将人胚胎干细胞H9和白血病细胞KG-1a进行接触式共培养,用CCK8检测KG-la的增殖情况;用流式细胞术检测共培养后细胞的凋亡以及周期改变;荧光定量PCR检测BAX、BCL-2、caspase-3的mRNA表达;Western blot分析BAX、BCL-2、caspase-3的蛋白表达.结果:H9能明显抑制KG-1a细胞的增殖,将细胞阻滞于G2/M期,共培养后的KG-1a细胞的凋亡率高于对照组.BAX、Caspse-3的mRNA和蛋白表达均上调,BCL-2的mRNA和蛋白表达下调.结论:胚胎干细胞能抑制KG-1a细胞的增殖,促进其凋亡,其机制可能与BCL-2表达下调和BAX、Caspse-3表达上调有关.
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通过基因表达芯片数据库研究PRAM1基因表达特征及其临床意义
目的:研究PRAM1基因在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中的临床表型及其预后价值.方法:以486例急性髓系白血病患者的基因表达芯片为研究平台,结合临床资料总结PRAM1基因在多种AML亚型中的表达特征.利用正常人干细胞表达芯片,研究PRAM1基因在各阶段血细胞分化过程中的表达规律.通过急性髓系白血病细胞系验证临床样本表达芯片结果,并找到可以上调PRAM1基因的药物.结果:首先发现PRAM1基因在inv(16) AML中表达高,在t(15;17)M3中表达低,在其他类型中表达基本一致.依据美国NC-CN指南,利用基因突变分类,PRAM1基因在伴发CEBPAdm突变的AML(cytogenetically normal AML,CN-AML)中高表达,而且PRAM1基因的高低表达可以对CN-AML进一步分层,且无事件生存率(event-free survival,EFS)有统计学意义;其次PRAM1基因在成熟细胞和粒单祖细胞中表达较高.地西他滨和西达本胺可以上调PRAM1基因,其中西达本胺的效果较好.结论:PRAM1基因在急性髓系白血病中有一定表达规律,在t(15;17)M3中表达低,PRAM1基因高表达是CN-AML预后较好的标志.PRAM1基因在成熟粒细胞中表达较高,而且西达本胺可以上调该基因的表达,因而可作为治疗靶点.
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NOPHO-AML 2004方案治疗儿童急性非淋巴细胞白血病的临床研究
目的:探讨儿童急性非淋巴细胞白血病(非M3)采用NOPHO-AML 2004化疗方案的疗效及安全性.方法:2013年1月至2017年6月诊断的1-13岁急性非淋巴细胞白血病(非M3)33例.按FAB分型:M0 1例,M14例,M212例,M4 5例,M5 8例,M6 1例,M7 2例;高危14例,标危19例;均采用NOPHO-AML 2004方案化疗.应用SPSS 22.0软件统计,采用Kaplan-Meier生存分析法和Cox回归模型进行分析.结果:33例患儿诱导第1疗程(AIET)获完全缓解者27例,未缓解者5例,缓解率81.8％.在5例未缓解的患儿中,4例经诱导第2疗程(AM)后获完全缓解,1例未缓解,诱导总缓解率为96.9％.9例(占27.3％)骨髓复发,中位复发时间为完全持续缓解后30个月.单因素分析结果表明,年龄和输注红细胞次数是影响早期治疗反应的显著因素;Cox回归多因素分析显示,年龄＞7岁、MRD阳性、输RBC频率＞4次和早期治疗反应差为患儿复发的独立危险因素.患儿3年无事件生存率为59.9％,3年总体生存率为69.2％.8例高危儿童接受强化疗后行异基因造血干细胞移植,预后优于单纯化疗的患儿.接受化疗的患儿均出现不同程度的感染及骨髓抑制,或药物相关的消化道反应和过敏反应,经积极对症治疗后均可耐受.结论:NOPHO-AML 2004化疗方案诱导缓解率高,患者耐受性好,早期治疗反应是影响预后的重要因素.年龄和多次输注浓缩红细胞会显著影响早期治疗反应,且为患儿骨髓复发的重要因素.对于临床高危型急性非淋巴细胞白血病患儿,在NOPHO-AML 2004化疗方案的基础上联合造血干细胞移植可改善预后.
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K562细胞中DNMT1与SHP-1启动子2甲基化关系的研究
目的:探讨慢性髓系白血病(CML)急变细胞系K562细胞中DNA甲基转移酶1(DNMT1)与造血细胞磷酸酶(SHP-1)基因表达及其启动子2的甲基化状态的关系.方法:分析NCBI数据库中SHP-1基因启动子2启动子区序列.将携带DNMT1 shRNA的psiHIV-mU6-shDNMT1和樱桃色荧光蛋白(mcherryFP) psiHIV-mU6-control 的慢病毒干扰载体感染K562细胞系.应用甲基化特异的聚合酶链反应(MSP)和亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP)检测K562细胞中SHP-1基因启动子2的甲基化状态,Western blot检测SHP-1、DNMT1蛋白的表达水平,SYBRGreen荧光定量PCR检测SHP-1 mRNA的表达.结果:SHP-1基因启动子2在-353 bp-+182 bp区有22个CpG岛,K562细胞中SHP-1基因启动子2异常高甲基化且SHP-1蛋白表达缺失.K562细胞转染psiHIV-mU6-shDN-MT1后DNMT1表达水平为0.48±0.06,较转染psiHIV-mU6-control组明显降低(1.33±0.19) (t=4.18,P=0.014).K562细胞中SHP-1蛋白表达缺失,转染psiHIV-mU6-shDNMT1后K562细胞SHP-1蛋白恢复表达,转染psiHIV-mU6-shDNMT1的K562细胞中SHP-1 mRNA相对表达水平(14.23±3.83)较转染psiHIV-mU6-control组(1.031±0.156)高(P=0.004).DNMT1基因沉默后SHP-1基因启动子2中CpG岛去甲基化.结论:K562细胞中DNMT1与SHP-1启动子2的异常甲基化及沉默相关.
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脂肪血制备的去白细胞悬浮红细胞储存期代谢特性研究
目的:探讨脂肪血制备的去白细胞悬浮红细胞在储存期的主要代谢途径转换,为脂肪血制备的悬浮红细胞储存提供参考.方法:选择脂肪血和正常全血各10 U,制备成去白细胞悬浮红细胞,在制备当天(d0)、d 14、d 35分别取样,采用UPLC-MS/MS检测红细胞内的代谢物.采用Mann-Whitney U检验分析2组标本糖酵解途径和磷酸戊糖途径代谢物的差异,分析脂肪血制备的悬浮红细胞储存期的代谢途径变化.结果:d0实验组红细胞内代谢物葡萄糖、腺嘌呤、丙酮酸、GSH、GSSG和烟碱酰胺水平均高于对照组(P＜0.05).d 14实验组红细胞中葡萄糖、丙酮酸和GSH水平低于对照组(P＜0.05),腺嘌呤、烟碱酰胺和GSSG水平高于对照组.D 35实验组红细胞中葡萄糖水平低于对照组(P＜0.05),腺嘌呤、烟碱酰胺水平高于对照组(P＜0.05),两组之间的丙酮酸、GSSG和GSH水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论:与正常红细胞相比,脂肪血红细胞储存期内能量代谢减弱,磷酸戊糖途径增强.
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OCT4A基因对K562细胞生物学活性的影响
目的:探讨OCT4A基因体外对K562细胞生物学行为的影响及与凋亡相关的分子机制.方法:克隆人OCT4A基因,构建靶向上调及下调OCT4A基因与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组慢病毒表达载体pLVX-OCT4A-ZsGreen1、PLB-OCT4A shRNA,三质粒包装系统包装病毒,并测定滴度.实验分为空白对照、pLVX空质粒、pLVX-OCT4A-ZsGreen1、PLB-OCT4A shRNA和非特异shRNA共5组.Western-blot检测各组OCT4A蛋白表达.CCK-8法绘制各组细胞增殖曲线.采用AnnexinV/7-AAD标记流式细胞术检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞分化抗原CD11b和CD15表达;实时定量PCR检测caspase3、BIM、BCL-xL和BAX mRNA表达变化.结果:成功克隆人OCT4A基因,并成功构建重组慢病毒载体pLVX-OCT4A-ZsGreen1和PLB-OCT4A shRNA.Western blot 证实2种病毒感染后可分别有效上调及下调OCT4A蛋白的表达.CCK-8法检测显示,pLVX-OCT4A-ZsGreen1组K562细胞体外增殖活性明显升高,而pLVX-OCT4A shRNA组K562细胞增殖活性显著降低(P＜0.05).感染后pLVX-OCT4A-ZsGreen1和PLB-OCT4A shRNA 2组K562细胞凋亡率分别为(3.48±0.52)％和(7.25±0.57)％(P＜0.05),而OCT4A过表达及抑制后细胞表面分化抗原CD15、CD11b的表达无明显变化.OCT4A上调后Caspase-3、BIM、BAX较对照组均下调,但差异无统计学意义(P＞0.05),而BCL-xL基因表达则明显升高(P＜0.01).结论:成功构建重组慢病毒载体pLVX-OCT4A-ZsGreen1及PLB-OCT4A shRNA,它们可分别有效地上调及下调OCT4A蛋白表达.OCT4A基因可促进K562细胞的增殖、抑制凋亡,其抑制凋亡机制可能与BCL-xL基因上调有关.
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过表达SHIP-1对白血病细胞侵袭、迁移及PI3K/AKT信号通路的影响
目的:探讨含有SH2结构的5'肌醇磷酸酶-1(SHIP-1)对白血病细胞增殖、侵袭和迁移能力以及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路的影响.方法:采用脂质体Lipofectamine 2000将过表达载体pCDNA3.1-SHIP1转染白血病THP-1细胞,实验分为3组:对照组(未做处理的细胞),空载体组(转染空载体pCDNA3.1-NC)和过表达组(转染过表达载体pCDNA3.1-SHIP1);应用CCK-8法检测细胞的增殖情况,Transwell法检测细胞侵袭、迁移能力,免疫印迹实验(Westem blot)检测细胞中SHIP-1、AKT、磷酸化AKT (pAKT)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表达量.结果:细胞转染过表达载体后SHIP-1的表达量显著高于对照组(P＜0.05);与对照组相比,空载体组细胞的吸光值没有明显差异(P＞0.05),过表达组细胞的吸光值显著降低(P＜0.05);空载体组细胞的侵袭、迁移数与对照组无明显差异(P＞0.05),过表达组细胞的侵袭、迁移数显著低于对照组(P＜0.05);与对照组相比,空载体组细胞中AKT、pAKT和MMP-9的表达量没有显著差异(P＞0.05),过表达组细胞中AKT蛋白的表达量无显著差异(P＞0.05),但pAKT、MMP-9的表达量均显著降低(P＜0.05).结论:SHIP-1抑制白血病细胞的增殖,且降低其侵袭、迁移能力,其机理可能与通过影响PI3 K/A KT信号转导通路的活化从而下调MMP-9的表达有关.
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E2F1基因在急性白血病中的表达及其临床意义
目的:研究E2F1基因在急性白血病中的表达变化及其临床预后意义.方法:选取从2015年3月-2016年3月在本院确诊为急性白血病(AL)的72例患者,同时选取24例健康体检者作为对照,采用RT-PCR和Westernblot方法分析2组E2F1基因表达变化,同时采用统计学分析E2F1基因表达与AL患者临床指标的关系及其预后意义.结果:AL患者中E2F1基因mRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组(P＜0.05).E2F1基因高表达患者的WBC、β2-MG、LDH水平均明显高于E2F1基因低表达的患者(P＜0.05),但E2F1基因的表达与患者的性别、发热、疲劳、骨髓原始细胞比例、外周血原始细胞水平无相关性(P＞0.05).E2F1基因的低表达的患者完全缓解率显著高于E2F1基因的表达高的患者(P＜0.05),而E2F1基因的低表达的患者耐药性低于E2F1基因高表达的患者(P＜0.05).治疗后症状缓解患者的E2F1基因的表达水平下降明显(P＜0.05).治疗后M1、M2、M5患者的E2F1基因的表达水平下降明显(P＜0.05).经Kaplan-Meier生存分析发现,E2F1基因低表达的患者组的OS和DFS优于高表达组(P＜0.05).多因素Cox回归分析表明,年龄和E2F1基因是OS独立影响因素(P＜0.05);性别和E2F1基因是DFS独立影响因素(P＜0.05).结论:E2F1基因在AL患者中表达水平较高,其高水平表达与患者的预后不良密切相关.E2F1基因有望作为临床治疗AL患者的生物学靶点.
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LNK基因在急性白血病患者中的表达及临床意义
目的:探讨LNK基因在急性白血病患者中的表达及其与临床特征的相关性.方法:采用实时荧光定量PCR检测80例AL(ALL 42例,AML 38例)患者骨髓中LNK mRNA的表达水平,分析其表达水平与临床特征的相关性,应用Western blot检测患者的LNK蛋白表达量.以正常的志愿者(16例)骨髓作为对照组.结果:ALL和AML组的LNK水平均明显高于正常对照组(P=0.007,P=0.021),ALL组与AML组之间LNK水平无统计学差异;ALL和AML组中的LNK表达水平均与危险程度呈正相关(P=0.000,P=0.004,r=0.5,r=0.386),且ALL和AML组中高危组的LNK水平均明显高于对照组(P=0.035,P=0.032),AML和ALL组的中危组(P =0.239,P=0.609)及标危组(P=0.974,P=1)LNK水平均高于对照组,但无统计学意义,各组之间危险程度无统计学差异.急性白血病患者LNK蛋白表达量较对照组增加.结论:急性白血病患者LNK基因表达高于正常人,与患者危险度呈正相关.
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一种改良的Ph+急性淋巴细胞白血病小鼠模型快速建立方法
目的:改良建立Ph+急性淋巴细胞白血病(ALL)小鼠模型的方法,为Ph+ ALL提供更加便捷的研究工具.方法:使用Mig190逆转录病毒转染BABL/c小鼠前体B细胞,输注同系小鼠,建立Ph+ ALL模型;应用外周血涂片,流式细胞术鉴定免疫表型,RT-PCR和Western blot方法鉴定BCR-ABL转录和蛋白表达,并分离发病小鼠的白血病细胞进行再次输注.结果:Mig190逆转录病毒转染后小鼠发生急性淋巴细胞白血病,在血涂片观察到原始和幼稚淋巴细胞,免疫分型示白血病细胞CD19+;RT-PCR和Western blot均检测到BCR-ABL,符合Ph+ ALL的免疫表型和分子生物学特征;再次输注未经照射的同系小鼠能迅速发生B-ALL.结论:改良建立的Ph+ ALL小鼠模型,能够为研究Ph+ ALL提供更简便而有效的工具.
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异基因外周血造血干细胞移植后PTLD的临床分析
目的:研究异基因外周血造血干细胞移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)的临床特点,提高对PTLD的认识和诊疗水平.方法:回顾分析于2014年5月-2017年4月在中国人民解放军总医院接受异基因外周血造血干细胞移植的244例患者(随访时间截止至2017年11月30日),总结异基因外周血造血干细胞移植后PTLD的发病率、危险因素、治疗疗效以及生存情况.结果:244例移植患者中,发生PTLD 22例,发病率为9.02％,其中病理确诊5例,临床诊断17例.22例PTLD患者均伴有EB病毒感染,均为使用ATG的亲缘单倍体相合造血干细胞移植或非亲缘供者造血干细胞移植患者.20例应用了利妥昔单克隆抗体单药或以利妥昔单克隆抗体为基础的联合治疗方案,17例有效,有效率85％.中位随访时间122 d,中位生存时间5(1-22)个月,总生存率50％.结论:异基因外周血造血干细胞移植后PTLD的发病与EB病毒感染关系密切.预处理方案中应用ATG是PTLD发病的高危因素.在无法取得病理诊断的情况下,应积极结合临床和实验室检查给予临床诊断.临床上越来越多地选用利妥昔单克隆抗体治疗PTLD.
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造血干细胞移植术后抗-CD36抗体介导的血小板输注无效症和相关病例的实验研究
目的:对造血干细胞移植术后由抗-CD36抗体介导血小板输注无效症和相关病例进行实验研究,对患者和造血干细胞供者的CD36表型和CD36基因,以及相关抗体的特征进行分析和鉴定,探讨患者的血小板输注治疗效果.方法:采用流式细胞术检测患者及造血干细胞供者CD36在血小板及单核细胞上的表达;采用本实验室建立的快速血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定检测技术(fast monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigen,F-MAIPA)鉴定患者血清中的血小板抗体;采用测序(polymerase chain reaction sequence-based typing,PCR-SBT)方法分析患者及供者CD36基因序列及HPA序列;应用STR-PCR(short tandem repeat polymerase chain reaction,STR-PCR)技术监测患者植入的证据.从CD36缺失血小板库中挑选CD36表达缺失的供者血小板给予患者输注,并监测其血小板计数.结果:造血干细胞供者为CD36+,而患者为Ⅰ型CD36缺失者.患者移植后血清中存在抗-CD36抗体并排除HLA及HPA相关抗体;患者CD36外显子测序提示为1个新的CD36突变基因,即CD36Exon 6-1G＞C纯合子(突变位于剪切位点)突变基因所致的CD36缺失.移植后18 d患者的STR位点、HPA以及CD36型别已完全转化为供者型别(完全嵌合),移植后96 d患者血小板、单个核细胞上已有CD36表达.给该患者输注CD36缺失血小板后血小板计数明显提高.结论:对造血干细胞移植术后由抗-CD36抗体引起的输血小板无效症,须对CD36在移植中的同种免疫反应给予足够重视.为了确保血小板输注有效,对CD36缺失患者需给予CD36缺失血小板输注.
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非霍奇金淋巴瘤患者HBV病毒检测的临床意义
目的:分析HBV感染与NHL患者临床特点及预后的相关性,探讨HBV病毒检测的临床意义.方法:选取2013年12月-2016年12月期间我院收治的68例非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者作为NHL组,选取136例其他恶性肿瘤患者作为对照组,比较两组的HBV检出率.收集NHL患者的临床资料,分析HBV感染与患者性别、年龄、分期、来源、P53表达、BCL-2表达的相关性,分析影响患者预后的相关因素.结果:NHL组的HBV感染率为51.47％(35/68),对照组为15.44％(21/136),差异具有统计学意义(x2=27.768,P＜0.05).HBV感染与NHL患者的细胞来源及BCL-2表达具有相关性(P＜0.05).性别、年龄、细胞来源及HBV感染与患者预后无显著相关性(P＞0.05);肿瘤分期、P53阳性及BCL-2阳性与患者的不良预后具有显著相关性(P＜0.05).结论:HBV感染与NHL患者BCL-2的表达水平具有一定的相关性,并能影响患者顸后.
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免疫组织化学和骨髓形态学检测在非霍奇金淋巴瘤诊断和临床分期中的应用价值
目的:分析免疫组织化学检测和骨髓形态学分析在非霍奇金淋巴瘤(NHL)诊断及临床分期中的应用价值.方法:选取本院64例非霍奇金淋巴瘤患者,通过单克隆相关抗体对其标本进行免疫组织化学检测,并进行骨髓形态学检查.结果:B细胞淋巴瘤相关抗体CD79a+率为84.62％,CD20+率为91.43％;T细胞淋巴瘤相关抗体CD45 RO+率为87.50％,CD3+率为88.89％.10例(15.63％)发生淋巴瘤骨髓侵犯,8例(12.50％)患者进展为淋巴瘤-白血病期;20例(31.25％)患者淋巴瘤细胞低于5％.结论:免疫组织化学检测有助于明确非霍奇金淋巴瘤患者的T、B细胞淋巴瘤类型,而骨髓形态学分析能够明确非霍奇金淋巴瘤患者是否发生骨髓侵犯及进展为淋巴瘤-白血病期,其应用价值较高.
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“微移植”治疗难治性原发中枢神经系统淋巴瘤的临床分析
目的:观察以大剂量甲氨蝶呤(MTX)为基础的化疗联合亲缘单倍体相合供者G-CSF动员后外周血造血干细胞(G-PBHSC)输注组成的“微移植”,治疗3例难治性原发中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)患者的疗效.方法:2014年3月至2015年9月火箭军总医院血液科收治的3例难治性PCNSL患者.“微移植”治疗时首先给予患者大剂量MTX为基础的化疗,在化疗结束后48 h给予亲缘单倍体相合供者G-PBHSC输注,输注的单个核细胞(MNC)中位数1.34×108/kg,不进行移植物抗宿主病(GVHD)预防.结果:3例患者在确诊后分别接受过化疗或放疗,在“微移植”治疗前病情处于进展状态,“微移植”治疗后1例患者获得完全缓解,并已持续15个月.2例患者获得部分缓解,病情稳定10个月和7个月,此后病情再次进展而死亡.患者对“微移植”治疗的耐受性好,不良反应主要是与大剂量MTX化疗相关的中性粒细胞减少、血小板减少和感染,但在G-PBHSC输注后患者中性粒细胞和血小板恢复的中位时间分别为11d、12.5 d.在治疗期间未观察到GVHD相关临床表现.结论:对于难治性PCNSL患者,“微移植”是一个值得尝试的挽救性治疗方法.
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MiR-296-5p在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及其对肿瘤细胞生物学行为的影响
目的:检测弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)细胞中microRNA-296-5P(miRNA-296-5p)的表达水平,并研究干扰miRNA-296-5p的表达对DLBCL细胞株DB的增殖、迁移及凋亡的影响.方法:应用人淋巴细胞分离液提取健康人外周血单个核细胞,实时荧光定量PCR检测单个核细胞与DLBCL-DB细胞miRNA-296-5p的表达.利用miRNA-296-5p inhibitor干扰DB细胞miRNA-296-5p的表达,实时荧光定量PCR检测转染后miRNA-296-5p的表达,并进一步用CCK-8法、Transwell法和Annexin V-FrTC/PI双染法检测转染后细胞增殖、迁移和凋亡的变化.结果:miRNA-296-5p在DLBCL细胞株DB中明显高表达,转染miRNA-296-5p inhibi-tor后细胞的增殖和迁移能力明显受到抑制,而细胞凋亡没有明显改变.结论:miRNA-296-5p的高表达可能与DLBCL的发生发展有关,可能成为DLBCL的预后评估指标之一.
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介于DLBCL/BL未分类B细胞淋巴瘤的临床病理特点、治疗与预后分析
目的:分析介于DLBCL/BL未分类B细胞淋巴瘤的临床病理特点、治疗与预后.方法:收集本院2014年7月至2016年6月16例DLBCL/BL患者的全部临床资料及病理资料,采用寿命表法进行总生存及无事件生存分析,采用Kaplan-Meier法进行组间生存比较,应用Log-rank检验对年龄、性别、IPI评分、肿瘤分期、B症状、肿瘤细胞来源、KPS评分、DPL、β2微球蛋白水平、治疗前LDH水平、初治化疗方案强度等因素进行单因素分析.结果:16例患者中出现淋巴结外侵犯的患者有15例,中位总生存时间为11个月,1年总生存率为50.0％;中位无事件生存时间为7个月,1年无事件生存率为43.8％.高强度化疗方案与CHOP或CHOP样方案治疗患者间生存差异无统计学意义(P =0.067).IPI评分在3分以上和治疗前LDH异常升高为预后独立危险因素.结论:DLBCL/BL是一种高度恶性的肿瘤,生存期短,高强度化疗方案较CHOP或CHOP样方案更能改善患者生存,其预后独立危险因素是IPI评分在3分以上及治疗前LDH异常升高.
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淋巴瘤细胞白血病骨髓细胞形态学和免疫分型的特点及其在诊断中的价值
目的:探讨淋巴瘤细胞白血病骨髓细胞形态学和免疫分型的特点以及两者在疾病诊断中的价值.方法:回顾性分析本院2012年1月至2017年1月收治的35名淋巴瘤细胞白血病患者的骨髓涂片及骨髓免疫分型资料,观察淋巴瘤细胞白血病患者的骨髓形态和免疫分型特点及两者在淋巴瘤细胞白血病中的诊断价值.结果:所有患者骨髓中均有典型的淋巴瘤细胞的形态,免疫分型中分化抗原表达与原疾病病理类型相吻合,T细胞淋巴瘤细胞白血病患者细胞主要表达CD7、CD3、CD2、CD5、CD11b、CD34及HLA-DR,其中CD7为敏感,其阳性率为69.2％.B细胞淋巴瘤白血病患者细胞主要表达CD19、CD20、CD22、CD79a、skappa及早期抗原HLA-DR等,其中CD19阳性率高为89.5％.35例患者中28例骨髓涂片中淋巴瘤细胞比例与骨髓免疫分型中淋巴瘤细胞比例吻合,7例骨髓涂片的淋巴瘤细胞比例与免疫分型中淋巴瘤细胞比例相差1.5倍以上.结论:淋巴瘤细胞白血病骨髓涂片结合免疫分型在判断淋巴瘤细胞是否骨髓侵犯方面可以相互补充、取长补短,减少漏诊率,有利于淋巴瘤白血病患者的早期诊断.
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淋巴瘤荷瘤小鼠凝血状态与血小板活化对肿瘤高凝状态的影响
目的:通过观察淋巴瘤荷瘤小鼠体内凝血指标D-D、vWF、TF和血小板活化指标P选择素及GPⅡbⅢa的变化,探讨淋巴瘤荷瘤小鼠体内的凝血异常与肿瘤高凝状态.方法:选择BALB/c小鼠,皮下注射38B9淋巴瘤细胞构建淋巴瘤小鼠模型,采用MRI和B超等影像学方法评估成瘤情况.于荷瘤1、14和21 d予以眼球内眦静脉采血,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血浆D-D、vWF和TF水平,流式细胞术(FCM)检测小鼠外周血P选择素、GPⅡbⅢa等血小板活化指标的表达水平.结果:成功构建淋巴瘤荷瘤小鼠模型.小鼠荷瘤后血浆D-D、vWF、TF和血小板活化指标P选择素和GPⅡbⅢa水平均明显高于对照组(P＜0.05).结论:淋巴瘤荷瘤小鼠体内存在有凝血和血小板活化异常,与肿瘤相关高凝状态有关.
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利用单个核细胞培养扩增NK细胞体系探索
目的:探寻一种通过单个核细胞使自然杀伤(NK)细胞在体外培养扩增的新方法,为NK细胞免疫治疗奠定实验基础.方法:收集3份健康足月孕妇的脐带血,应用密度梯度法分离单个核细胞(PBMNC),每份单个核细胞样本均分为CD16 mAb、CD3 mAb和CD16 mAb+CD3 mAb处理3组.使用含自体血浆、重组人IL-2、IL-15和IL-21的无血清培养液,在相同条件下培养扩增14 d,计算其扩增倍数.应用流式细胞术测定CD56+ CD3-比例;以K562细胞为靶细胞,应用MTT法测定所培养的NK细胞在不同效靶比条件下的杀伤率.结果:培养14 d后,CD16mAb、CD3 mAb和CD16 mAb+CD3 mAb组细胞总数分别扩增45.71±5.54、87.41±19.77和51.84±4.88倍,在CD3 mAb组显著高于其它2组(P＜0.05).培养前CD56+ CD3-细胞比例为0.1663±0.0201,经培养扩增14 d后CD16 mAb、CD3 mAb和CD16 mAb +CD3 mAb组CD56+ CD3-细胞比例分别为0.8167±0.0500、0.8077±0.0589和0.8077±0.0273,3组之间无显著性差别.培养14 d后,MTT法检测显示,在效靶比为1∶1、5∶1和10∶1时3组杀伤效率均无显著差异(P＞0.05).结论:使用抗CD3 mAb及IL-2,IL-15和IL-21培养单个核细胞,可获得高纯度和高杀伤活性的NK细胞.本研究为NK细胞的治疗提供了一个简单有效的方法.
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以肝素和抗CD16抗体为基础的扩增人脐血NK细胞无血清培养体系的建立
目的:建立一种新方法以用于体外培养扩增人脐血来源的NK细胞,从而为NK细胞的治疗奠定基础.方法:收集人脐血单个核细胞,将细胞按1.5×106/ml悬浮于含5％自体血浆、重组人IL-15 (50 ng/ml)和氢化考的松琥珀酸钠(5×10-8 mol/L)组成的无血清培养液中,接种于含肝素钠或/和重组抗人CD16单克隆抗体铺板(预先铺板)的培养瓶中,其剂量分别为100 U/cm2和1 μg/cm2底面积.培养2周后收集细胞,计细胞总数,应用流式细胞术检测细胞中CD3-/CD56+比例.以K562细胞为靶细胞,应用MTT实验观察不同效靶比条件下的NK的细胞毒作用.结果:与未铺板培养体系比较,抗CD16抗体及肝素钠铺板体系培养的细胞,在培养1周内易见贴壁的集落.培养2周后,预先铺板组细胞扩增倍数明显高于未铺板组,且CD3-/CD56+比例显著升高,尤以抗体和肝素混合铺板组为显著(P＜0.01).MTT实验显示,预先铺板培养组所获得细胞对K562细胞的杀伤活性更强.结论:利用肝素和抗CD16抗体铺板,在培养体系中加入IL-15和氢化考的松,可使NK细胞优势扩增,从而获得纯度较高、细胞毒活性较强的NK细胞.
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多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞在体外对骨髓瘤细胞趋化迁移的影响
目的:探讨体外培养情况下多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞(MSC)对骨髓瘤细胞趋化迁移的影响.方法:采用体外培养方法,将骨髓瘤细胞株U266分成两组:A组与正常人骨髓间充质干细胞(N-MSC)共培养,B组与多发性骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞共培养,在有或无硼替佐米作用条件下比较2组U266细胞株的CCR1表达水平、Transwell迁移率以及N-MSC或MM-MSC培养液上清中U266细胞在Transwell中的迁移情况.结果:U266细胞与N-MSC组和MM-MSC共培养后,B组U266细胞在Transwell中的迁移率较高(P＜0.05);硼替佐米处理U266细胞后不能消除2组的区别;B组U266细胞的CCR1表达水平高于A组(P＜0.05).骨髓MSC培养上清液实验显示,在无硼替佐米作用条件下,MM-MSC和N-MSC培养上清液与SDF-1相比,具有较强的趋化刺激能力,使细胞在Transwell中的迁移率增高,而在有硼替佐米作用下,3组培养上清液使细胞在Transwell 中迁移率降低(P＜0.05),但不管是否在硼替佐米作用下,MM-MSC和N-MSC培养上清液对U266细胞在Transwell中的迁移作用无显著性影响(P＞0.05).结论:骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞本身有部分内在缺陷,通过与骨髓瘤细胞直接相互作用而影响其体外趋化功能.
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多发性骨髓瘤患者骨髓瘤细胞中miRNA-19a的表达水平及其对骨髓瘤细胞相关特性的影响
目的:检测miR-19a在人多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞株LP-1和U266中的表达水平,研究miR-19a对多发性骨髓瘤细胞株LP-1和U266细胞增殖、侵袭、凋亡的影响.方法:应用RT-PCR检测miR-19a在多发性骨髓瘤细胞株LP-1和U266中的表达水平;CCK8检测miR-19a对多发性骨髓瘤细胞株LP-1和U266增殖的影响;Transwell方法检测miR-19a对多发性骨髓瘤细胞株LP-1和U266细胞侵袭影响;流式细胞术检测miR-19a对多发性骨髓瘤细胞株LP-1和U266细胞凋亡的影响.结果:miR-19a在多发性骨髓瘤细胞株LP-1和U266中表达;miR-19a促进多发性骨髓瘤细胞株LP-1和U266的增殖,促进多发性骨髓瘤细胞株LP-1和U266的侵袭,抑制多发性骨髓瘤细胞株LP-1和U266的凋亡.结论:miR-19a在多发性骨髓瘤细胞株LP-1和U266中表达明显增加,且促进骨髓瘤细胞的增殖、侵袭及抑制骨髓瘤细胞的凋亡.
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硼替佐米和沙利度胺治疗对多发性骨髓瘤患者外周血记忆性T细胞亚群和调节性T细胞的影响及临床意义
目的:探讨硼替佐米(BTZ)和免疫调节类药物沙利度胺(TM)对多发性骨髓瘤(MM)患者外周血记忆性T淋巴细胞(Tm)亚群和调节性T细胞(Treg)的影响.方法:应用流式细胞术检测外周血Tm亚群和Tregs细胞.将治疗2个疗程的86例患者按疗效分为2组,其中治疗有效组(达到PR)63例,无效组(未达到PR)17例.根据治疗方案又可分为BTZ治疗组(38例)和TM治疗组(42例);将24例初诊患者作为基线组,30例健康志愿者作为健康对照组.结果:基线组的CD4+中央记忆性T(CD4+TCM)占CD4+ Tm的百分比、CD8+中央记忆性T(CD8+TCM)占CD8+Tm细胞的百分比、CD8+中央记忆性T与CD8+效应记忆性T比值(CD8+ TcM/TEM)均显著低于健康对照组(P值均＜0.05).BTZ或TM治疗后有效组的CD8+TCM占CD8+Tm细胞的百分比均显著升高至健康对照组水平(P＜0.05).BTZ或TM治疗后有效组和无效组的Tregs细胞数均与基线组无显著差异(P＞0.05);但无论BTZ还是TM治疗的有效组Tregs占CD4+细胞百分比均显著高于基线组和无效组(P值均＜0.05).根据受试者工作特征曲线(ROC curve),CD8+ TCM/TEM的临界值为0.27,此时评价患者疗效的敏感性和特异性分别为57.1％和94.1％.结论:MM患者处于免疫耗竭状态,BTZ和TM治疗均能逆转MM患者免疫抑制状态.BTZ或TM治疗均对Tregs细胞数量无影响,而两种药物治疗有效组的Tregs细胞百分比均明显高于基线组和无效组:CD8+TCM/TEM比值有助于评价化疗疗效.
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组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺他抗小鼠骨髓瘤效应的实验研究
目的:观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺他(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对小鼠骨髓瘤细胞SP2/0增殖的影响并探讨其作用机制.方法:用不同浓度SAHA处理SP2/0细胞24及48 h,CCK-8法检测细胞增殖抑制率;流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡的变化;Westem blot法检测不同浓度SAHA处理SP2/0细胞48 h后Caspase-3和p53蛋白表达水平变化.分别以尾静脉途径和皮下途径注射SP2/0细胞,建立非侵袭性和侵袭性荷瘤模型.建模后d3开始,治疗组经腹腔注射SAHA,剂量为60 mg/(kg·d)(每周5次,连续3周),对照组腹腔注射SAHA溶剂.通过外周血涂片观察有无骨髓瘤细胞存在;每2d观察皮下荷瘤小鼠局部肿瘤体积变化;计算抑瘤率,记录小鼠生存期.结果:不同浓度的SAHA处理SP2/0细胞24或48 h后的结果显示,SAHA对SP2/0细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性关系(r24h =0.959;r48h =0.985).在SAHA体外作用下,SP2/0细胞周期分布结果显示G2期细胞比例明显升高,S期细胞比例明显降低.浓度分别为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μmol/L的SAHA作用48 h后,SP2/0细胞早期凋亡率分别为8.14％±0.50％、21.08％±0.94％、27.30％±0.63％、55.58％±0.65％、72.22％±0.88％.Western blot检测显示,SP2/0细胞Caspase-3、p53蛋白表达水平随SAHA浓度增加而升高(rCaspase-3=0.968;rp53=0.984).经尾静脉注射SP2/0细胞(1x106)的荷瘤方式,仅诱导出非侵袭性荷瘤小鼠模型;而同样数量的SP2/0细胞皮下注射则诱导出了侵袭性荷瘤小鼠模型.与对照组相比,SAHA治疗后,非侵袭性荷瘤小鼠外周血循环中的骨髓瘤细胞消失,侵袭性荷瘤小鼠瘤体生长速度缓慢,小鼠生存期延长.结论:SAHA显著抑制了小鼠骨髓瘤细胞增殖,其抑制效应与诱导骨髓瘤细胞周期阻滞及凋亡相关联,而其机制与SAHA能够上调Caspase-3和p53蛋白表达水平有关.
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二甲双胍通过线粒体途径诱导人骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡
目的:二甲双胍具有体外抑制肿瘤细胞生长的作用,但是对于多发性骨髓瘤细胞生长的影响和作用机制尚未可知.本研究探讨二甲双胍对人骨髓瘤细胞株U266的生长抑制作用及其可能的机制.方法:将不同浓度的二甲双胍作用于骨髓瘤细胞,采用MTT法检测细胞增殖抑制率、PI单染检测细胞周期.Western blot检测BCL-2蛋白家族蛋白表达水平的变化以及细胞色素C的释放.结果:二甲双胍可抑制U266细胞增殖,且抑制率呈时间和浓度依赖性变化;与对照组相比,二甲双胍作用48 h,细胞阻滞于G1/G0期;BCL-2、BCL-XL的蛋白表达水平降低、而BAX的蛋白表达水平明显升高;细胞色素C从线粒体释放到细胞质中的量增加,PARP的蛋白质剪切明显增强.结论:二甲双胍能够抑制U266细胞增殖及诱导细胞凋亡,线粒体凋亡途径可能是二甲双胍诱导细胞凋亡的机制之一.
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miR-99a-5p对人骨髓间充质干细胞分化能力的影响
目的:探讨microRNA-99a-5p (miR-99a-5p)对人骨髓间充质干细胞(BM-MSC)分化能力的影响.方法:贴壁培养BM-MSC,用miR-99a-5p类似物或抑制物转染细胞,实时定量PCR检测转染效率.通过分化实验检测miR-99a-5p对BM-MSC成脂和成骨分化能力的影响.结果:与对照组相比,转染miR-99a-5p类似物能显著上调miR-99a-5p表达水平(P＜0.001),反之转染miR-99a-5p抑制物则下调其表达水平(P ＜0.001).在成骨分化实验中,茜素红染色后镜下观察显示:过表达miR-99a-5p能促进成骨分化,下调miR-99a-5p的表达则抑制其成骨分化.分光光度计半定量检测也得到相同的结果.在成脂分化试验中,转染miR-99a-5p类似物或抑制物对BM-MSC成脂分化无明显影响.结论:过表达miR-99a-5p可促进BM-MSC成骨分化,但对其成脂分化无明显影响.
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mTOR信号调控PPARγ对再生障碍性贫血BM-MSC成脂分化的作用
目的:研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通过调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达对再生障碍性贫血(AA)患者骨髓间充质干细胞(BM-MSC)成脂分化的影响.方法:采用激光共聚焦、Western blot和油红O染色等,观察AA组和对照组BM-MSC中mTOR信号、PPARγ蛋白表达和体外诱导成脂分化能力;通过雷帕霉素体外干预,分析mTOR信号和PPARγ在AA患者BM-MSC体外诱导成脂分化中的作用.结果:随着成脂诱导时间的延长,2组脂肪细胞转化率和FABP4表达均增高,在同一时间点,在AA组均高于对照组(P＜0.01).2组BM-MSC的胞质及胞核均有p-mTOR和PPARγ的分布,而且AA组p-mTOR和PPARγ蛋白的荧光强度均显著高于对照组(P＜0.01).随诱导时间的延长,2组PPARγ表达均呈逐渐增高的趋势;在同一时间点,AA组PPARγ表达明显高于对照组(P＜0.01).雷帕霉素早、中和晚期干预组脂肪转化率和FABP4表达均较未干预组明显下降(P＜0.001).雷帕霉素早、中和晚期干预组的PPARγ蛋白和mRNA表达均较未干预组均明显下降(P ＜0.001).结论:mTOR信号可能通过调控PPARγ表达在AA患者BM-MSC体外成脂分化中发挥重要的作用.
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免疫性血小板减少症患者促炎因子与抑炎因子分泌失衡
目的:分析免疫性血小板减少症(ITp)患者促炎因子与抑炎因子的分泌状态.方法:纳入研究的ITP患者35例,健康对照组28例.应用AimPlex流式高通量多细胞因子检测技术检测IL-8、IL-17A、IL-22、TNF-α、IFN-γ、IL-4、CD40、CD40L、TGF-β和IL-10的表达水平.结果:与健康对照组相比,促炎因子IL-8、IL-17A、IL-22、TNF-α和IFN-γ在ITP组表达均显著升高(P＜0.05);而抑炎因子IL-4、CD40L、TGF-β和IL-10在ITP组的表达均显著降低(P＜0.05);ITP组CD40水平与对照组比较无显著差异(P＞0.05).ITP组和对照组细胞因子TNF-α表达水平均与血小板计数显著相关(ITP组r=0.64,P=0.04;对照组r=-0.41,P=0.02),两组CD40、TGF-β、CD40L、IL-8、IL-17A、1L-22、IL-10、IL-1β、IFN-γ和IL-4的表达水平均与血小板计数无明显相关性.结论:ITP患者存在有促炎因子和抑炎因子的失衡现象.血小板计数减少可能受到细胞因子TNF-α表达的调控.
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移植前血清细胞因子水平对重型再生障碍性贫血患者异基因造血干细胞移植疗效的影响研究
目的:探讨重型再生障碍性贫血(SAA)患者异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)前细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α水平对预后的影响.方法:本研究共纳入117例SAA接受allo-HSCT的患者,回顾性分析患者总体生存率(OS)、移植物抗宿主病(GVHD)发生率、细胞因子水平与OS及主要移植并发症的关系.结果:本研究纳入的SAA患者包含同胞HLA全相合allo-HSCT 78例(66.7％),非亲缘供者allo-HSCT 12例(10.2％),单倍体相合供者allo-HSCT 27例(23.1％).所有患者5年OS率为76.0％(95％ CI:64.4％-87.5％).aGVHD累积发生率为49.6％(95％ CI:40.4％-58.8％);cGVHD累积发生率为31.6％(95％ CI:23.1％-40.2％).接受同胞HLA全相合allo-HSCT的患者,其5年OS率明显优于替代供者(82.3％±6.6％ vs 61.3％±11.7％)(P＜0.05).HLA匹配程度、供者年龄、移植后巨细胞病毒/EB病毒(CMV/EBV)血症是影响aGVHD发生的重要因素.移植前血清IL-6增高的患者,移植后血小板植入较快(14.6±1.8 vs 18.3 ±2.6 d) (P =0.05);血清TNF-α增高的患者,移植后CMV/EBV血症发生率较低(37.8％±11.1％ vs 58.8％±16.8％) (P =0.029).结论:HLA匹配同胞供者allo-HSCT是SAA患者有效治疗手段;供者选择仍然是影响预后的重要因素.移植前血清IL-6和TNF-α水平增高可能预示allo-HSCT后患者血小板植入加快,CMV/EBV血症发生率减低.
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血小板生成素通过PI3K/AKT通路防止CoCl2诱导内皮细胞凋亡
目的:研究血小板生成素(TPO)对化学性缺氧模拟剂氯化钴(CoCl2)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的作用及其机制.方法:实验分为4组,体外培养的未经处理的HUVEC为对照组,CoCl2与HUVEC共培养的为CoCl2组,在加入CoCl2前用TPO预处理HUVEC为TPO+ CoCl2组,TPO单独处理HUVEC为TPO组.使用CCK-8法检测各组细胞的细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率、凋亡蛋白酶Caspase-3的表达以及线粒体膜电位的变化.Western blot检测TPO对AKT通路磷酸化水平表达的影响.结果:CoCl2可以明显抑制HUVEC的生长,细胞存活率随着CoCl2的浓度的升高逐渐下降(r=-0.997);与对照组相比较,CoCl2组的细胞凋亡率明显升高(P＜0.001),而TPO+CoCl2组的细胞凋亡率较前者明显下降(P＜0.001),提示TPO对HUVEC有保护作用.TPO还能减少细胞凋亡蛋白酶Caspase-3的表达和抑制细胞线粒体膜电位的降低,以及刺激HUVEC PI3K/AKT通路的活化.结论:TPO具有防止化学性缺氧所致的细胞凋亡作用,其机制可能是通过活化PI3 K/AKT通路,从而减少细胞凋亡蛋白酶Caspase-3的活化表达和稳定线粒体膜电位来发挥细胞保护作用.
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成人慢性难治性ITP患者脾脏HMGB1的表达及意义
目的:探讨HMGB1在成人慢性难治性免疫性血小板减少症(ITP)患者脾脏中的表达及其临床意义.方法:选择2000年1月至2016年12月在我院以“脾切除术”作为治疗手段的成人慢性难治ITP患者20例作为ITP组,创伤性脾破裂的成人患者20例作为对照组.回顾性分析ITP患者脾切除的疗效,应用免疫组织化学方法检测脾脏组织中HMGB1的表达水平,并分析二者间的关系.进一步用ELISA和Western blot检测25例慢性难治ITP患者外周血血清及单个核细胞(PBMNC)中HMGB1蛋白的表达水平.结果:ITP患者脾切除术前中位血小板(Plt)计数为7.5(0-20)×109/L,术后1个月内血小板初始反应率为100％,中位反应时间为1(1-6)d,血小板峰值为448.5(161-1272)×109/L;8例患者在中位时间为10(3-30)个月出现血小板计数不同程度降低.中位随访69.5(22-195)个月,完全反应为12例,有效为4例,无效为4例.ITP脾脏组织中HMGB1表达阳性率为85.0％(17/20),较对照组(15.0％)明显增高(P ＜0.001).脾切除术后血小板恢复不佳的患者显示脾脏HMGB1表达水平增高(r=-0.791,P=0.003).此外,慢性难治ITP患者血清及PBMNC的HMGB1表达水平也明显高于健康对照组(P＜0.01).结论:脾切除是治疗ITP的有效方法,HMGB1在慢性难治性ITP患者的脾脏中高表达,且与脾切除术的疗效呈负相关.
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一个遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系F7基因信号肽区L12R和3'非翻译区c11814-insAA复合性突变与表型分析
目的:通过对一个遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症患者家系成员表型与基因型分析,研究其基因突变与临床表型的关系,探讨其分子发病机制.方法:对先证者及其父母进行活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原和FⅦ活性(FⅦ∶C)、FⅦ抗原(FⅦ∶Ag)检测,对其F7基因的全部外显子及侧翼、启动子区进行测序,以寻找致病基因突变.根据信号肽预测数据库构建包含所发现突变的FⅦ蛋白分子模型,进行功能预测,推断其对蛋白合成和功能的影响.结果:先证者APTT正常,PT明显延长(58.3 s),FⅦ:C显著下降(1.1％),FⅦ∶Ag重度降低(0.9％),其父母的APTT、PT、FⅦ:C和FⅦ∶Ag均在正常范围内.先证者和其父亲的F7基因第1a外显子第556位核苷酸发生杂合性T/G突变,导致相应氨基酸由亮氨酸(L)变成精氨酸(R),即L12R.功能预测分析提示,L12R突变影响到信号肽区不同区域的分割及其相应功能,进而导致成熟蛋白质的合成减少和因子活性明显降低.同时,先证者F7基因还存在自发性3'非翻译区c11814-insAA杂合性突变,而其父母均无此突变.结论:发现1例F7基因L12R突变,位于信号肽区的该杂合突变是导致此例遗传性FⅦ缺乏症发生的主要分子基础,而位于3'非翻译区的自发性c11814-insAA突变则进一步造成了FⅦ合成的减低.
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Notch配体的原核表达与纯化及其对四氯化碳损伤后造血的影响
目的:通过原核表达并纯化靶向内皮细胞的小鼠Notch重组配体mD1R蛋白,观察其对四氯化碳损伤后造血的影响.方法:PCR克隆并构建pET22b(+)-mD1R表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导,镍珠亲合层析纯化,SDS-PAGE确认目的蛋白表达.应用流式细胞术、细胞粘附实验、免疫荧光染色及实时定量RT-PCR检测蛋白的内皮靶向性和Notch激活程度.建立四氯化碳损伤小鼠模型,应用流式细胞术观察mD1R蛋白对造血干细胞(HSC)、髓系和淋系细胞的影响,应用磁珠分选Lin-Scal-1+ c-Kit+细胞并分析细胞周期的变化,RT-PCR检测IL-10的表达.结果:成功克隆并构建原核表达载体,获得高纯度且有生物学活性的mD1R重组蛋白.mD1R能激活四氯化碳损伤小鼠造血干/祖细胞的Notch信号途径,内源性扩增HSC和长期HSC达2.96倍和6.18倍,促进了髓系祖细胞及髓源性抑制细胞的自体扩增,尤其有利于粒/单核细胞进入血液循环,其具体机制可能与Notch信号促进应激损伤后造血干细胞增殖和上调IL-10表达有关.结论:成功构建了连接造血干细胞和造血微环境的新型Notch配体活性蛋白,证实Notch信号途径可能通过促抗炎因子表达,实现应激损伤后自体造血动员.
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阻断CD4+T细胞活化的双信号可预防小鼠慢性GVHD
目的:探讨联合应用TJU103和CTLA4-Ig阻断T细胞活化的TCR-CD3及B7-CD28通路对小鼠慢性GVHD的影响.方法:参照前期构建的慢性GVHD动物模型,受鼠经输注6×107个供鼠脾细胞后按干预方式的不同分5组:空白对照、cGVHD、TJU103干预、CTLA4-Ig干预和TJU103+ CTLA4-Ig干预组.观察各干预因素对嵌合体形成及慢性GVHD大体表现评分和病理评分的影响.结果:TJU103和CTLA4-Ig不影响小鼠嵌合体的形成,分析慢性GVHD小鼠的Kaplan生存曲线显示,CTLA4-Ig和TJU103+ CTLA4-Ig干预降低了慢性GVHD的发病率,TJU103可推迟慢性GVHD的发生时间,但均不能改变慢性GVHD的严重程度.结论:TJU103可推迟小鼠慢性GVHD的发病时间,CTLA4-Ig可减少小鼠慢性GVHD的发生率;二者联合应用可明显减少小鼠慢性GVHD的发病率,但不能改变慢性GVHD的严重程度.
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芦可替尼治疗骨髓增殖性肿瘤安全性和有效性的Meta分析
目的:评价芦可替尼在治疗骨髓增殖型肿瘤(MPD)中的有效性和安全性.方法:检索数据库PubMed、Embase、Cochrane Library、Clinical Trials、中国生物医学文献数据库CBM、中国期刊全文数据库(～ 2017/9/30),对纳入文献的参考文献进一步扩大检索;将纳入的随机对照临床实验(randomised clinical trials,RCT)研究通过Cochrane风险偏倚进行文献质量评价;采用Revman 5.3进行统计学分析,评价芦可替尼的安全性和有效性.结果:芦可替尼具有明显缩脾作用(RR 49.12,95％ CI[15.81-152.59],P＜0.001);芦可替尼治疗后,贫血发生率较对照组明显增多(RR 1.71,95％ CI[1.05-2.77],P=0.03),粒细胞数减少(RR 2.46,95％ CI[0.91-6.61],P =0.07)及血小板数减少(RR 1.04,95％ CI[0.50-2.16],P=0.92),与对照组比较无统计学差异,出血事件发生率明显高于对照组(RR 1.45,95％ CI[0.84-2.49],P=0.18),血栓事件的发生率与对照组比较无统计学差异(RR 0.77,95％ CI [0.33-1.80],P=0.55),感染事件发生率在芦可替尼治疗组与对照组之间无统计学差异(RR 1.02,95％ CI[0.72-1.43],P=0.93).结论:芦可替尼治疗MPD能有效的缩脾,但由于其贫血和出血事件增多,其使用的安全性仍需要更多高质量RCT研究提供数据分析.
| 年 | 期数 |
| 2019 | 01 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 |
| 2000 | 01 02 03 04 |
