胎盘组织及血液中含有丰富的造血干/祖细胞

大量的临床移植表明人脐血(UCB)可以在造血干细胞移植的儿童中得到造血重建,可是在成人中脐血移植(UCBT)效果并不理想,这主要是脐血中所含的细胞数及造血干/祖细胞数有限,而不适宜体重较大的成人.本研究在收集脐血的同时,也分别收集胎盘血(UPB)及胎盘组织(UPT)中的细胞,检测有核细胞数,CD34(造血干/祖细胞的表明标记)阳性细胞,粒单细胞集落(CFU-GM).结果发现:来自于胎盘血和胎盘组织中的有核细胞数是脐血细胞的3-4倍;脐血、胎盘血及胎盘组织细胞的有核细胞数分别为(8.3±1.04)×108,(16.33±5.54)×108和(8.01±2.64)×108;CD34+细胞分别为(0.77±0.01)×106,(1.25±0.55)×106和(4.21±1.90)×106;在细胞的长期培养中,UPB细胞和UPT细胞能生存更长时间,而且这些细胞更易贴壁形成纤维样的细胞;冰冻前后UPT细胞活性及回收率无明显差异,表明胎盘细胞和脐血细胞一样适合于长期储存;而且,在UPB和UPT中含有更高比例的T淋巴细胞抑制细胞群,可能意味着UPB和UPT具有更强的免疫抑制功能.结论指出,有必要建立含有胎盘和脐血细胞的血库,以便为大剂量放疗及化疗后的儿童及成年病人进行造血干细胞移植,为重建造血创造条件.

p73基因在甲氨蝶呤诱导髓性白血病细胞系U937细胞凋亡过程中的表达

为了探讨甲氨蝶呤(MTX)诱导U937细胞凋亡过程中p73 mRNA的表达变化,用MTX诱导U937细胞凋亡,凋亡指标采用细胞形态学、DNA片段电泳、流式细胞术检测DNA含量及细胞周期的变化等方法;采用半定量反转录PCR(RT-PCR)检测p73 mRNA的表达变化.研究结果显示:MTX可诱导U937细胞凋亡.5μmol/L的MTX作用于U937细胞6 小时,可见部分细胞体积缩小,染色质明显浓缩和核碎裂.DNA片段电泳,MTX处理组可见清晰的梯形条带.流式细胞仪检测发现MTX作用于U937细胞6,8,10小时,细胞的凋亡率分别为5.15%,11.43%和14.7%,并使细胞阻滞在G2/M+S期,而对照组细胞不发生凋亡.半定量RT-PCR结果显示在U937细胞凋亡前后,p73mRNA的表达无明显变化.结论提示,在MTX诱导U937细胞凋亡过程中,p73的mRNA水平表达差异无显著性.

两种软件的血细胞分离机采集少白细胞血小板的比较

对两种版本软件血细胞分离机(COBE Spectra LRS System Version 5.1 and Version 7.0)采集的少白细胞血小板中白细胞残留量、采集效率、采集速度等进行了比较.使用两种版本软件血细胞分离机共采集232个单位的浓缩血小板,其中A组用5.1版本软件的血细胞分离机采集163单位血小板,B组用7.0版本加快型软件的机器采集69单位血小板.献血者外周血血细胞计数及采集过程中的有关参数、血小板得率、采集效率及血小板制品中残留白细胞数等进行了统计分析.结果表明,B组的血小板得率为(2.9±1.1)×1011,高于A组的(2.58±1.2)×1011.A组99.4%血小板制品白细胞污染量小于5×106,而B组中97.1%的制品白细胞低于此值.B组的采集效率为(51.4±8.7)%,高于A组的(43.6±6.3)%.血小板得率与采集前献血者外周血血小板计数相关.结论指出,血细胞分离机7.0加快版本在血小板采集效率上优于5.1版本,采集前献血者的血小板计数高,血小板得率也相应高.

非霍奇金淋巴瘤病人外周血T细胞TCR Vβ谱系的选择性利用和克隆性增殖分析

为了解B细胞性非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)和T细胞性非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)病人TCRVβ亚家族T细胞的分布及其克隆性的情况,利用RT-PCR分别扩增4例B-NHL和2例T-NHL病人外周血单个核细胞的TCRVβ 24个亚家族基因的CDR3,了解病人各Vβ亚家族的利用情况.阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度,以了解T细胞克隆性.结果显示,6例NHL病人外周血T细胞仅选择性表达6-12个Vβ亚家族,全部病人均选择了表达Vβ1,Vβ8,Vβ13和Vβ19,5例病人表达Vβ2和Vβ16,而全部病人均未能检测到Vβ4-6,Vβ10-12,Vβ15,Vβ17-18,Vβ20,Vβ22-23.基因扫描发现2例B-NHL和1例T-NHL病人的1-3个Vβ亚家族T细胞呈克隆性增殖.结论提示,B-NHL和T-NHL病人外周血T细胞具有相似的Vβ亚家族选择性利用的特点,部分病人存在与肿瘤细胞抗原相关的克隆性增殖的T细胞.

G-CSF对供者淋巴细胞分泌IL-2功能的影响及临床意义

为了研究异基因骨髓移植供者使用粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)对骨髓及外周血淋巴细胞分泌白细胞介素2(IL-2)的影响,进一步探讨G-CSF可能通过改变细胞因子分泌平衡而减轻急性移植物抗宿主病(aGVHD)的发生,以7例健康供者为对象,在其应用G-CSF前后通过胞内细胞因子染色技术及流式细胞术,检测淋巴细胞的IL-2表达,结合临床患者骨髓移植后aGVHD发生情况,与本科室未行G-CSF动员的类同病情、年龄及供、受者有可比性,且在同一时期内连续进行的15例骨髓移植病人aGVHD发生情况进行比较.结果表明,7例供者经G-CSF动员后外周血及骨髓淋巴细胞IL-2表达与未动员前相比明显减少,且接受移植的患者未发生Ⅱ度以上aGVHD,与既往连续进行移植未行G-CSF动员的15例比较,aGVHD有降低趋势.上述结果提示,经G-CSF动员后,供者表达IL-2的淋巴细胞明显减少,可能与异基因骨髓移植后患者aGVHD发生减低有关.

骨髓活检组织印片在贫血诊断中的应用

为了探讨骨髓活检组织印片在贫血诊断中的应用价值,分析了65例贫血患者的骨髓活检组织印片、骨髓活检组织切片和骨髓穿刺涂片的诊断结果.结果显示,骨髓活检组织印片及切片的诊断符合率优于骨髓穿刺涂片,尤其在原发性骨髓纤维化、再生障碍性贫血、骨髓转移癌,其符合率明显高于骨髓穿刺涂片检查(P＜0.01).骨髓活检组织印片及切片两者之间的诊断符合率虽无明显差异,但骨髓活检组织印片观察细胞细微结构较切片好,且操作简单、确诊及时.本研究提示,骨髓活检组织印片检查对贫血的诊断有较重要的价值.

造血干细胞移植供者TNF-α基因多态性在GVHD中的频率分析

探讨供者肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因多态性在重度急性移植物抗宿主病(aGVHD)和广泛型慢性移植物抗宿主病(cGVHD)中的作用.本研究应用变性高效液相色谱结合DNA测序检测了TNF-α-308和TNF-α-238基因在重度aGVHD和广泛型cGVHD的分布.结果表明,21例Ⅲ度/Ⅳ度aGVHD病人中有8例呈现TNF-α-308(G/A)阳性,而28例0度/Ⅰ度aGVHD病人中仅1例呈现TNF-α-308(G/A)阳性,提示TNF-α-308(G/A)在Ⅲ度/Ⅳ度aGVHD中的频率明显高于0度/Ⅰ度aGVHD的病人(P＜0.01).在23例广泛性cGVHD病人中有7例呈现TNF-α-308(G/A)阳性,而17例未发生cGVHD的病人中仅1例呈现TNF-α-308(G/A)阳性,提示TNF-α-308(G/A)在广泛性cGVHD中的频率高于未发生cGVHD的病人(P＜0.05).在21例Ⅲ度/Ⅳ度aGVHD和28例0度/Ⅰ度aGVHD及23例广泛性cGVHD及17例未发生cGVHD的病人中均有1例呈现TNF-α-238(G/A)阳性,提示TNF-α-238(G/A)在上述各组病人间的频率无明显差异.结论:TNF-α-308(G/A)阳性与Ⅲ度/Ⅳ度aGVHD和广泛型cGVHD的发生密切相关.

用基因组DNA制备独特型抗淋巴瘤核酸疫苗的实验研究

本研究观察从人B细胞淋巴瘤细胞系基因组DNA及RNA分别构建的表达载体作为核酸疫苗诱导小鼠产生抗肿瘤免疫反应的情况.分别提取人B淋巴瘤细胞系Namalwa细胞的基因组DNA及RNA,将免疫球蛋白重链可变区(IgHV)基因片段克隆到pcDNA 3.0真核表达载体中作为独特型核酸疫苗,其中DNA来源的核酸疫苗用LfpofectAMINE转染COS细胞,然后用RT-PCR观察转录及剪接的情况.两种不同来源的核酸疫苗分别肌内注射免疫小鼠后,用间接免疫荧光法检测抗独特型抗体的生成.结果发现,基因组DNA来源的核酸疫苗在COS细胞中能成功地转录,转录产物大小为477 bp,其中86 bp的内含子区域被剪接;两种疫苗免疫动物后均可诱导针对Namalwa细胞特异的抗独特型抗体,并于第6周达高峰.结论提示,淋巴瘤基因组DNA和RNA来源的IgHV基因片段均可制备核酸疫苗,能诱发小鼠产生抗淋巴瘤免疫反应.

反转录病毒载体介导可溶性Fas的体外表达

将含全长Fas cDNA的质粒利用PCR技术进行特定片段删除,获得sFas cDNA.通过DNA重组技术,将sFas cDNA插入到反转录病毒载体pLXIN,构建了重组表达载体pLXIN-sFas.经酶切鉴定及测序,表明成功地构建了重组表达载体pLⅪN-sFas.该载体经PA317细胞包装后,感染靶细胞COS-7,分别采用ELISA及凋亡抑制实验检测其蛋白表达量为(2.2±0.7)μg/ml,且具有良好的生物学活性,能明显抑制抗-Fas(CH-11)介导的T淋巴瘤细胞株Jurkat的凋亡.这一结果为探讨Fas和FasL途径在白血病发生中的作用奠定了基础.

胎儿间充质干细胞cDNA扣除文库的构建

为了获得胎儿和成人间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的差异表达基因,尤其是在胎儿MSC中特异表达的基因,应用抑制扣除杂交技术构建了胎儿和成人MSC cDNA扣除文库.首先,分别从胎儿和成人MSC中提取总RNA,按照SMART PCR方法依次合成单链和双链cDNA,经RsaI酶切后,胎儿MSC cDNA分别与两种不同的接头连接,再与成人MSC cDNA经过两次扣除杂交及两轮抑制性PCR扩增后,将产物与T载体连接构建成cDNA扣除文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增.结果:文库扩增后共获得890个克隆,对所获得的克隆进行PCR扩增鉴定,获得768个阳性克隆,阳性率为86.3%.插入片段大小分布在0.2-1kb,平均为400-600bp.结论:抑制扣除杂交技术是一种简便、有效的筛选差异表达基因的方法.胎儿MSC cDNA扣除文库的构建为进一步筛选、克隆胎儿MSC中特异性表达的功能相关基因奠定了基础.

保存人红细胞的新策略-抗氧化剂保养液保存效果的研究

塑料血袋盛义务献血员的静脉血(合适量保养液)并置4℃冰箱保存.在保存前、后不同时间检查各项指标,旨在研究抗氧化剂保养液延长人血红细胞在4℃条件下的保存时间,以缓解血液保存供应的压力,为输血抢救创造有利条件.实验分3组:ACD组,GMA组和抗氧化剂(SOD)组.研究结果表明,在4℃条件下保存75天后SOD组红细胞血红蛋白回收率为87.2%,血浆血红蛋白(mg/L)为193.2,P50(mmHg)为34.0(正常值为33.1),大变形指数(DImax)为0.2413,即为正常值的74.3%,外观检查无明显溶血、变色、气泡和凝块.结论提示,用抗氧化剂保养液保存红细胞在4℃条件下可延长到75天,其红细胞血红蛋白和血浆血红蛋白回收率附合国家<血站基本标准>规定要求.

人类pax-5基因外显子1B的5＇侧翼区碱基序列分析

pax-5基因是B细胞生成和B细胞发育中的重要转录因子.为了更好的理解pax-5基因表达的调节机制,对pax-5基因外显子1B的5＇侧翼区进行了分离克隆及序列测定.整段碱基序列(6 671 bp)分析表明,无TATA box共同序列存在,近侧启动子包括3 CAT boxs,1 SP1和1 E box,上游进一步推测的调节位点显示6 LMQCOM,5NFAT,2 LPOLYA-B,3 GATA1,2 AP4,10 MZF1,1 ETS1-B,1 GATA3,1 NKX25,2 RORA1,1 LYF1,2Ikaros2,2TCF11,1 GATA-C和1 FREAC7,并确定在序列上.因此,pax-5基因外显子1B的5＇侧翼区与pax-5表达的调节有关,且对保证B细胞谱系和B细胞发育起重要调节作用.

Ph+和Ph-CML病人外周血TCR Vβ T细胞分布特点

为了解Ph+和Ph-慢性粒细胞白血病(CML)病人外周血TCR Vβ亚家族T细胞的分布特点,利用RT-PCR分别扩增13例CML病人(Ph+-b3a2型5例,Ph+-b2a2型5例,Ph-型3例)外周血单个核细胞的TCR Vβ的24个亚家族基因片段,了解病人各Vβ亚家族的利用情况.研究结果:发现与正常人有所不同,病人仅存在部分TCR Vβ亚家族T细胞,Ph+-b3a2型CML表达4-16(平均10.2)个Vβ亚家族,Ph+-b2a2型CML表达8-11(平均8.8)个Vβ亚家族,而Ph-者表达5-6(平均5.7)个Vβ亚家族.各病人表达的Vβ亚家族分布有所不同,在Ph+(b3a2型)全部病人表达Vβ10和Vβ16,其次为Vβ9和Vβ22;Ph+(b2a2型)除与Ph+(b3a2型)相同全部病人表达Vβ10和Vβ16外,还全部表达Vβ24,其次为Vβ8;而Ph-者全部表达Vβ24,其次为Vβ3,Vβ10,Vβ13和Vβ22.结论:提示Ph+和Ph-CML病人外周血的TCR Vβ亚家族T细胞存在倾斜性分布现象,不同类型CML病人T细胞的TCR Vβ选择性利用有所不同,这可能与CML细胞相关抗原的差异以及个体特异性免疫反应的差异有关.

干细胞因子促进造血细胞与纤连蛋白的粘附

造血细胞粘附与细胞外基质在造血细胞的存活、增殖、分化及归巢中起重要作用.本研究以细胞因子依赖细胞系Mo7e细胞为靶细胞,观察了干细胞因子(SCF)对造血细胞粘附于纤连蛋白的促进作用.结果表明,Mo7e细胞表达β1,α4和α5整合素及SCF受体c-kit,SCF可明显刺激Mo7e细胞粘附于纤连蛋白并具有量效关系,PI-3激酶通路抑制剂,抗β1,α4和α5整合素抗体可阻断该作用.结论提示,SCF对造血细胞粘附于纤连蛋白的促进作用是通过整合素介导的,并与PI-3激酶通路有关.

白血病细胞内谷胱甘肽硫转移酶的表达与化疗耐药的关系

为了探讨白血病细胞内谷胱甘肽硫转移酶(GST)的表达与化疗耐药的关系,本研究采用1-氯-2,4-二甲基为底物的比色分析法和原位杂交法对56例白血病患者白血病细胞内GST的表达进行检测,并结合临床化疗药物敏感度和治疗效果进行临床分析.结果显示:①同类型白血病患者的白血病细胞内GST表达,无显著性差异;②初治和复发白血病患者白血病细胞内GST活性分别为(4.5±1.0)U和(7.9±1.5)U,GSTmRNA表达率分别为33.3%和66.3%;③56例白血病患者在临床完全缓解(CR,19例)、部分缓解(PR,20例)和未缓解(NR,17例)组的GST活性分别为(1.7±0.7)U,(5.9±2.0)U和(9.3±1.7)U,GST mRNA表达率分别为13.3%,29.7%和76.6%.结论提示:白血病细胞内GST异常表达与白血病化疗耐药明显相关,高表达GST的患者易复发,检测白血病细胞内GST活性可作为白血病治疗评价和预后判断的有用指标.

应用反向斑点杂交技术进行脐血HLA-DRB基因分型方法的建立

HLA分子的多态性对于移植有十分重要的意义.常用的HLA基因分型方法中SSOP基因分型方法有较高分辨率,但操作过程复杂,仅适于大样本的HLA分型.PCR-SSP基因分型方法分辨率较低,但操作过程简单,适于临床要求.有必要建立一种简便、快速、价廉、高分辨率的基因分型方法.本研究取63份已知HLA-DRB型的脐血标本,经盐酸胍方法提取DNA用于反向斑点杂交(RDB)基因分型,同时采用SSOP和PCR-SSP方法进行比较.结果表明,所有样本用RDB方法基因分型均获得成功,可准确地分辨60个HLA-DRB等位基因,且结果与用SSOP和PCR-SSP方法的结果完全一致.结论提示,RDB方法可准确地分辨HLA-DRB等位基因,分辨率高,操作简单,适用于各种情况的HLA分型.

荧光原位杂交和常规核型分析检测骨髓增生异常综合征8号染色体三体的比较

8号染色体三体(8三体)是骨髓增生异常综合征(MDS)常见的染色体异常.本研究比较间期荧光原位杂交(FISH)技术和常规染色体核型分析法检测8三体.应用光谱绿荧光标记的8号染色体着丝粒探针,建立间期FISH技术并联合应用常规细胞遗传学分析(CCA)对8三体的MDS进行综合研究.结果发现,染色体核型为全+8,部分+8和只有1个中期+8组MDS-RA和MDS-RAEB的构成比例无显著性差别.FISH检测8三体克隆在核型全+8组仅有66.1%的检出率,部分+8组检出率显著高于1个+8组,孤立+8组显著高于复合+8组.MDS-RA组与MDS-RAEB组8三体检出率近似.部分+8组的FISH检测与CCA检测值呈线性相关.2例病人中,8三体百分率随病情发展而增加.1/15的核型无+8患者,而FISH检测有8三体克隆存在.克隆的增长预示疾病进展.结论表明FISH技术可灵敏而又精确地检测MDS患者体内的+8克隆,可应用于MDS辅助诊断、疗效评价及预示疾病转归;8三体MDS患者+8克隆的大小与其分型无相关性,孤立型+8似多见于MDS-RA患者.

PML-RARα及RARα融合蛋白在三硫化二砷诱导的NB4细胞凋亡中的作用研究

为研究PML-RARα及RARα融合蛋白在三硫化二砷(As2S3)诱导的人早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞凋亡中的作用,本研究应用细胞形态观察、流式细胞术测定及DNA电泳等方法观察三硫化二砷对NB4细胞的诱导凋亡作用,用染色体G显带技术、反转录PCR及Western印迹测定这一过程中PML-RARα融合基因及其表达产物、野生型RARα蛋白的变化.结果表明,三硫化二砷在0.5-2μmol/L之间能诱导NB4细胞凋亡,在此过程中PML-RARα融合基因无明显变化,但PML-RARα融合蛋白和野生型RARα蛋白明显减少.结论提示PML-RARα融合蛋白和野生型RARα蛋白的降解在三硫化二砷诱导的NB4细胞凋亡过程中可能起了重要作用.

异基因骨髓移植后嵌合状态的研究进展

骨髓移植是许多血液系统疾病和免疫缺陷性疾病的有效治疗措施,移植成功与否与供者细胞在受者体内的植入状况即嵌合状态的形成有关.由于造血干细胞输入量、供者和受者T细胞量、预处理方案以及移植时患者病情等因素的影响,可以形成不同形式的嵌合状态.如果受者的骨髓或外周血中完全是供者的细胞,则形成完全的供者嵌合状态(CC);当检测到供者和受者两种细胞成分时,则为混合嵌合状态(MC).不同形式的嵌合状态,以及嵌合状态形式的不同演变趋势,其临床意义各不相同.检测嵌合状态的方法有多种,包括微卫星检测、染色体核型分析、血型转换、红细胞抗原、限制性片段长度多态性、可变数目串联重复序列以及现在常用的PCR法.本文从上述几个方面对嵌合状态研究的进展进行了综述.

组织干细胞的研究进展

干细胞是个体生命过程中产生和存在的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞群体.目前,在干细胞工程领域主要以胚胎干细胞和组织干细胞为研究对象,同时随着组织工程的发展,细胞的替代治疗已成为治疗一些疾病的新途径.组织干细胞在体外被扩增和定向诱导为一些所需细胞,然后植入患者体内,用以修复损伤,替代退行性组织,以及改善遗传性缺陷组织的功能.本文结合近几年国内外干细胞的研究进展,主要就组织干细胞的生物学特性及其临床应用前景作一综述.

自由基与白血病关系的研究进展

自由基是一类带电荷的原子、分子或离子,具有很强的生物活性,在肿瘤和其它许多疾病的发生过程中起重要作用.自由基在人体内通过一系列级联反应产生或消亡,它可以激活癌基因,在细胞内参与肿瘤细胞凋亡、生存、增殖相关的信号传导,修饰关键酶或蛋白并改变其功能,从而导致肿瘤的发生,同时对组织、器官造成损伤,产生多种病理变化.自由基还是许多抗白血病药物发挥药理作用的中间产物或功能物质.

原发性中枢神经系统淋巴瘤一例报道

本文报道原发性中枢神经系统淋巴瘤1例.对该病人采用以手术为主的综合治疗,生存期1年,治疗失败的原因为局部复发.作者结合文献对原发性中枢神经系统淋巴瘤的病理、影像学表现、诊断和治疗等进行讨论.

骨髓增生异常综合征患者骨髓细胞免疫表型研究及意义

为探讨骨髓增生异常综合征(MDS)各亚型的骨髓细胞免疫表型变化及临床意义,采用免疫酶标法检测30例MDS患者各亚型36例次骨髓细胞抗原的表达,并进行临床追踪观察及检测.研究结果表明,髓系细胞抗原表达明显异常,早期髓系细胞抗原CD13,CD33阳性表达率明显增加,较成熟细胞抗原CD15阳性表达率减少;单核细胞抗原CD14及淋巴细胞抗原CD7,CD10无显著异常,干/祖细胞抗原CD34在MDS的RAEB/RAEB-t组显著增加,RA和RAS组则增加不明显;早期红系细胞及各增殖期细胞抗原CD71在MDS各亚型均明显高于对照组.结论说明MDS患者骨髓细胞免疫表型存在多系异常,且对协助诊断及判断预后有一定意义.

第七届全军血液及输血专业学术会议