中国实验血液学杂志
Journal of Experimental Hematology 중국실험혈액학잡지
- 主管单位： 实验血液学杂志
- 主办单位： 中国科学技术协会
- 影响因子： 0.98
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 11-4423/R
- 国内刊号： 陈潮
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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利妥昔单克隆抗体在干细胞移植后淋巴细胞增殖性疾病中的应用
移植后淋巴细胞增殖性疾病(PTLD)是干细胞移植后的主要并发症之一,EB病毒感染是导致PTLD发生的常见原因之一.目前,针对PTLD的治疗措施有减少免疫抑制剂、局部治疗(放疗/手术切除)、抗病毒治疗、干扰素、化疗、抗CD20单克隆抗体(利妥昔单克隆抗体,商品名为美罗华)等,尤其随着美罗华的应用,使得PTLD的预后较前明显改善.本文主要就美罗华在细胞移植后淋巴细胞增殖性疾病中的应用做一综述,其中包括PTLD发生的危险因素,发病机制和美罗华的应用等.
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血友病A FⅧ基因内含子22重组基因型及检测方法
FⅧ基因内含子22重复序列发生染色体内相反方向的同源重组引起内含子22倒位,导致约45％-50％的重型血友病A;而同一染色体内、同源染色体间或染色单体之间的相同方向内含子22重复序列(intron 22 homologous region,int22h)的重组导致两序列中间区域的复制或缺失,可以引起内含子22倒位的检测出现假阳性或假阴性.改良的长距离PCR及反向转变PCR(inverse shifting PCR,IS-PCR)可用于区分上述所有可能的int22h重组基因型.
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大颗粒淋巴细胞白血病
大颗粒淋巴细胞(LGL)白血病是一种少见的克隆性淋巴组织增殖性疾病.WHO分类将其区分为三种不同类型:T细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGL),NK-细胞的慢性淋巴增殖性疾病(CLPD-NK)和侵袭性NK细胞白血病.虽细胞起源不同,但T-LGL与CLPD-NK在临床表现和治疗方面很相似,多数患者无症状不需要治疗,当出现明显的血细胞减少时,首先考虑免疫抑制治疗.相反,侵袭性NK细胞白血病和罕见的CD56+侵袭性T-LGL白血病呈暴发性病程,发病年龄更早,需要较强的联合化疗序贯异基因造血干细胞移植.该类疾病相对稀少,故指导治疗的临床试验亦少.本文对该病的发病机制、诊断、治疗和预后进行了综述.
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IL-17和Th17细胞在移植物抗宿主病中的免疫调控作用
异基因造血干细胞移植是有望治愈血液系统疾病、部分先天性疾病和自身免疫性疾病等的方法,但移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)是异基因造血干细胞移植后的重要并发症,并引发受者死亡,直接影响移植效果.众多免疫细胞和炎症因子参与了GVHD的发生,近年来发现的一类新的CD4+ IL-17+T细胞(Th17细胞),IL-17和Th17细胞成为了感染免疫、自身免疫性疾病、肿瘤免疫和GVHD研究领域的热点.本文就IL-17和Th17细胞在GVHD免疫调控中的作用作一综述.
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miR-155在弥漫性大B细胞淋巴瘤发病中的作用及可能机制
弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma,NHL),占成人NHL的30％-40％,5年生存率在25％左右.虽然现今已经有DLBCL的标准治疗方案,但是仍约有50％的患者不能治愈,因此了解调控DLBCL的发病机制,探索新的有效的治疗方法仍是研究者努力的方向.microRNA是近年来生物学研究的一大焦点,它是由一段非常短的非编码RNA序列组成,对多种生物学过程起调控作用.研究发现,miR-155是著名的致瘤microRNA之一,在很多淋巴瘤中都过表达,在DLBCL中更是异常高表达.miR-155可以通过BMP/TGF-β和RhoA等多种信号通路促进淋巴瘤的发生,有望成为治疗DLBCL的新靶点.本文就miR-155在弥漫性大B细胞淋巴瘤发病中的作用和可能机制做一综述.
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骨髓增生异常综合征向急性髓系白血病转化相关基因的研究进展
骨髓增生异常综合征(MDS)是一组起源于造血干细胞的高度异质性、高风险向急性髓系白血病转化的恶性克隆性疾病.随着分子生物学技术的不断发展,发现了多种基因与MDS向急性髓系白血病转化(转白)密切相关.SRSF2是与RNA剪接相关的基因,该基因突变提示患者可能预后不良,并较未突变者有更高向AML转化的几率;与DNA甲基化密切相关的DNMT3A,其突变多预示较差的总生存率,并可能更快地向AML转化;调节组蛋白合成的ASXL1,其框移突变是预后不良的分子标志,并且较无突变者有更快向AML转化的现象;与三羧酸循环密切相关的IDH又可分为IDH1与IDH2,前者多提示较短的生存时间以及较高的转白率,而有部分报道发现后者在低危组患者中提示不良的预后;另一与DNA甲基化状态密切相关的基因TET2,是目前MDS中常见的基因突变,有学者认为它可能是一种抑癌基因,但目前其对MDS患者预后影响的观点尚未统一,有报道提示其突变与MDS较快向AML转化有明显关联.因为研究对象人种、地域、临床特点等众多因素的不同,各家报道结果仍存在差异.本文就这五个基因进行综述.
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尼洛替尼治疗伴V299L突变的慢性髓性白血病二例
本研究提高对尼洛替尼治疗伊马替尼耐药伴V299L突变的慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者的临床认识.收集我院2例伴V299L突变的CML患者尼洛替尼治疗前后的骨髓标本,采用巢式PCR扩增并测序的方法检测ABL突变,分析临床特征.结果表明,2例伊马替尼耐药的CML患者均发生V299L突变,1例经尼洛替尼治疗6个月后V299L突变转为阴性,并取得完全血液学缓解;另1例经尼洛替尼治疗7个月后V299L突变转为阴性,并取得明显分子学缓解.结论:尼洛替尼治疗伊马替尼耐药伴V299L突变的CML患者安全性和疗效令人满意.
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CIAPIN1基因对K562细胞增殖能力的影响
本研究旨在探讨CIAPIN1基因对慢性髓系白血病(CML)细胞系K562细胞增殖能力的影响.针对CIAPIN1基因构建shRNA真核表达载体并稳定转染K562细胞,用real-time PCR和Western blot技术验证干扰效率,采用MTT法检测K562细胞的增殖活性的改变,利用甲基纤维素集落形成实验观察K562细胞集落形成大小和数量的变化,通过体内实验观察K562细胞在小鼠体内的成瘤能力.结果表明,与对照组相比,K562细胞的CIAPIN1基因表达被有效抑制;干扰CIAPIN1基因后K562细胞的增殖活性明显下降,集落形成数量减少和集落大小显著减小,小鼠体内成瘤能力明显降低.结论:干扰CIAPIN1基因表达能抑制K562细胞在体内及体外的增殖能力.
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BCL-2、Caspase-3、NF-κB在黄芪总苷诱导人白血病NB4细胞凋亡过程中作用
本研究探讨黄芪总苷(astragaloside,AST)对急性早幼粒细胞白血病(APL) NB4细胞株的凋亡诱导作用及其分子机制.采用AST处理人APL细胞株NB4,CCK-8比色法检测细胞增殖抑制率,FITC-Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率;不同浓度AST作用NB4细胞后RT-PCR检测BCL-2 mRNA表达,Western blot检测NF-κB、BCL-2、caspase-3蛋白表达水平.结果表明,AST作用NB4细胞48 h后,浓度依赖性地抑制NB4细胞的增殖,且随着AST的浓度增加,细胞凋亡率也由4.69％上升到40.85％.RT-PCR结果显示,BCL-2 mRNA表达减弱;Western blot结果显示,NF-κB及BCL-2蛋白表达减弱,caspase-3表达增强.结论:降低NF-κB、BCL-2表达并终激活caspase-3的表达可能是AST诱导NB4细胞株凋亡的机制之一.
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熊果酸对t(8；21)白血病细胞kasumi-1的抗肿瘤作用机制的研究
本研究旨在探讨熊果酸对急性髓系白血病t(8;21)阳性细胞株kasumi-1细胞的抑制增殖、诱导凋亡机制.采用CCK-8法检测细胞增殖抑制,瑞氏染色法观察细胞凋亡形态,流式细胞术检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR法及Western blot法检测kasumi-1细胞内相关基因mRNA及蛋白的表达.结果表明,经熊果酸处理后的ka-sumi-1细胞的生长增殖受到抑制,出现凋亡形态学改变;在熊果酸2.5、5、10、20、50 μmol/L浓度梯度以及在12,24,36,48,60,72 h时间梯度下,Annexin V阳性细胞比率随药物浓度的增加及作用时间的延长呈上升趋势;细胞内AMLl-ETO、KIT、MYC、CCND1、BCL2、MDM2 mRNA的表达随作用时间的延长及用药浓度的增加而呈显著的下降趋势,而P53及BAX的mRNA表达逐渐增高;Western blot显示AML1-ETO、C-kit、C-MYC、BCL-2蛋白表达减低,而P53蛋白表达增高.结论:熊果酸呈浓度和时间依赖性抑制kasumi-1细胞的增殖并诱导其凋亡,从而发挥抗白血病的作用.这为t(8;21)白血病靶向治疗方案的选择提供理论依据.
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马钱子碱诱导人单核细胞白血病THP-1细胞凋亡及作用机制
本研究旨在探讨马钱子碱对人单核细胞白血病THP-1细胞的诱导凋亡作用及其可能的作用机制.应用CCK-8法检测马钱子碱对THP-1细胞的生长抑制作用;应用AO/EB荧光染色法、Annexin-V/PI双染法检测马钱子碱对THP-1细胞凋亡的影响;PI单染法检测马钱子碱对THP-1细胞周期的影响;RT-PCR检测BCL-2、BAX基因的表达.结果表明,马钱子碱能有效地抑制THP-1细胞的生长,呈剂量和时间依赖关系;THP-1细胞经浓度为400μg/ml马钱子碱作用48 h后,大部分细胞核染色质被EB染成橘红色并呈固缩状,显示为晚期凋亡的细胞形态;0-400 μg/ml范围内的马钱子碱作用THP-1细胞48 h后,随着药物浓度的增高,细胞凋亡率逐渐上升;与对照组相比细胞周期被阻滞于G0/G1期,并出现亚二倍体凋亡峰;RT-PCR结果显示,BCL-2基因表达明显下降,BA基因表达上调.结论:马钱子碱能抑制THP-1细胞生长,诱导其凋亡,并对细胞周期起阻滞作用,其作用机制可能与BCL-2基因表达抑制及BAX基因表达激活有关.
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ID4基因甲基化定量PCR检测在急性白血病中的临床意义
尽管治疗的进步极大地改善了急性白血病患者的预后和生存,但时至今日多数类型的急性白血病没有特异性的生物标记,因此对于多数白血病患者,影响生存的复发这一重要因素缺少有效的顸警机制.ID4基因启动子区甲基化广泛发生于各类型急性白血病.本研究在前期建立的甲基化定量PCR体系的基础上,用该方法检测患者骨髓样本,探讨ID4甲基化定量指标(percentage of methylated reference,PMR)的临床意义.采集我院门诊及住院确诊的初治、完全缓解、复发3个阶段的急性白血病患者骨髓样本及正常对照者骨髓样本.应用ID4甲基化定量PCR体系对样本进行检测.按初治、完全缓解、复发分组比较PMR值.比较相同病例不同疾病状态的PMR的动态变化.结果表明,初治组PMR高,其次为复发组,而完全缓解组低.初治组PMR与完全缓解组比较存在统计学差异.4例随访病例的PMR值波动与病情变化一致.在1例复发病例中,PMR升高早于骨髓细胞学检查确认复发1.7个月.结论:本研究通过ID4基因启动子区甲基定量检测的方法初步验证:甲基化水平的量化指标PMR值与急性白血病患者肿瘤细胞负荷关系密切.PMR动态监测波动与疾病变化一致,可能具有预测复发的作用,但ID4甲基化定量指标的临床价值还有待进一步研究证据的支持.
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5-杂氮-2'-脱氧胞苷对人HL-60细胞DAPK基因表达的影响
本研究旨在观察甲基化转移酶抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-2dC)对人急性髓系白血病细胞株HL-60凋亡及死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase,DAPK)基因表达的影响,探讨5-aza-2dC治疗AML的作用机制.不同浓度的5-aza-2dC处理HL-60细胞后,采用瑞式染色法观察5-aza-2dC对HL-60细胞形态的影响,流式细胞术检测5-aza-2dC对HL-60细胞凋亡的影响,RT-PCR法检测5-aza-2dC对HL-60细胞DAPK基因表达的影响.结果表明,①5-aza-2dC呈浓度依赖性地促进HL-60细胞凋亡;②经5-aza-2dC处理后,HL-60细胞DAPK基因表达水平较处理前呈剂量依赖性地增加.结论:随着5-aza-2dC作用浓度的增加,HL-60细胞的凋亡率及DAPK基因表达水平均逐渐增加,提示DAPK基因可能是5-aza-2dC诱导HL-60细胞凋亡的调控基因之一.
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汉防己甲素联合伊马替尼对K562/G01细胞诱导凋亡作用及其相关机制
本研究探讨伊马替尼(imatinib,IM)和汉防己甲素(tetrandrine,Tet)单用和联合应用对K562/G01细胞的凋亡诱导作用及其可能机制.应用MTT法检测IM和Tet单用及联合用药对细胞增殖抑制的作用,用流式细胞术(FCM)检测细胞周期和凋亡率,用实时荧光定量PCR检测caspase-3、BCL-2 mRNA的表达,应用Western blot分析caspase-3、BCL-2蛋白的表达情况.结果表明,1.0 μmol/L IM和/或1.5 μmol/L Tet单用及联合作用于K562/G01细胞48 h后,对细胞增殖的抑制率分别是(22.74±0.05)％、(20.34±0.57)％、(44.28±0.60)％,两药联合应用较单药抑制作用明显.流式细胞术检测显示,Tet作用后细胞向G1/S期转化;Tet 1.5 μmol/L、3μmol/L与1.0μmol/L IM联合应用48 h的早期凋亡率分别为(7.81±0.16)％、(14.10±0.28)％,诱导凋亡作用比单药组明显增加.FQ-PCR和Western blot检测均显示单独应用Tet和IM后caspase-3表达上调,BCL-2表达下调,联合用药组作用更显著.结论:单独应用Tet对K562/G01细胞有诱导凋亡的作用,两药联合应用具有明显的协同效应,且具有时间和剂量依赖性,其机制可能与上调caspase-3 mRNA及其蛋白表达和下调BCL-2 mRNA及其蛋白的表达有关.
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高三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡的时间节律性及其机制研究
本研究旨在观察高三尖杉酯碱(HHT)作用于K562细胞后不同时间点凋亡率的变化及其机制.HHT 10ng/ml作用K562细胞后,用MTT法检测不同时间点的细胞增殖活力,Western blot法检测caspase-3凋亡蛋白表达;流式细胞术检测BCL-2蛋白表达;应用透射电子显微镜观测细胞自噬.结果表明,HHT 10 ng/ml处理后的前5d,K562细胞增殖活性逐渐下降,但在第6天以后增殖活性又逐渐上升;同时激活型caspase-3蛋白从第1天至第7天逐渐增高,而在第8天明显降低(P＜0.05);BCL-2蛋白表达水平则呈现先降低后升高(P＜0.05)的特点.细胞自噬体在HHT作用第8天明显增多.结论:HHT作用后,K562细胞凋亡水平变化呈现先升高后下降的特点,其机制与HHT作用后期K562细胞自噬水平升高有关.
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塞来昔布对人白血病细胞株HL-60细胞增殖及凋亡的影响及其作用机制
本研究旨在探讨塞来昔布(celecoxib)对人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制.不同浓度塞来昔布作用于HL-60细胞24h后,CCK-8法测定细胞增殖活性,流式细胞技术分析细胞凋亡及细胞周期分布的变化,定量RT-PCR的方法检测细胞周期蛋白D1、El及COX-2 mRNA的表达.结果表明,不同浓度塞来昔布作用于HL-60细胞24 h后,细胞增殖明显受抑,且呈一定的浓度依赖性(r=0.955),24h的IC50值为63.037 μmol/L.塞来昔布可诱导HL-60细胞的凋亡,也呈剂量依赖性(r=0.988).塞来昔布可使HL-60细胞明显阻滞于G0/G1期,可下调cyclin D1、cyclin El mRNA的表达.塞来昔布可使细胞COX-2 mRNA表达水平降低.结论:塞来昔布呈浓度依赖性抑制 HL-60细胞增殖,并可能通过下调cyclinD1、cyclin E1的表达引起细胞Go/G1期阻滞,下调COX-2的表达诱导细胞凋亡.
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两种菌种来源的左旋门冬酰胺酶抗白血病作用与机制比较
比较大肠杆菌来源的左旋门冬酰胺酶(E coli-L-Asp)与欧文菌来源的左旋门冬酰胺酶(Erwinia-L-Asp)体外抗白血病作用,并探讨其作用机制.以两种来源的L-Asp分别处理急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞株(REH、Jurkat),采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖变化(IC50),Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,高压液相色谱(HPLC)检测用药后培养液中4种氨基酸[门冬酰胺(Asn)、门冬氨酸(Aspa)、谷氨酰胺(G1n)、谷氨酸(G1u)]浓度的变化.结果表明,REH、Jurkat细胞株对两种L-Asp的抑制作用均敏感,且在一定时间内存在明显剂量效应关系,即在较低的药物浓度下,细胞增殖抑制率处于较低水平,而药物浓度增加后,细胞的增殖抑制率明显升高,其中作用后24 h,Erwinia-L-Asp组细胞抑制率、细胞凋亡率均明显高于E coli-L-Asp组(P＜0.05),但至48 h两组比较差异无显著性(P＞0.05).两种药物在低浓度时均能耗竭培养液中的Asn,且作用相当(P＞0.05),高浓度时耗竭Gin作用才凸显,而Erwinia-L-Asp的作用明显强于E.coli-L-Asp(P＜0.05).结论:两种菌种来源的L-Asp抗白血病作用与剂量存在量效关系,除耗竭外环境中的Asn和Gin外,诱导细胞凋亡也是其抗白血病作用之一.Erwinia-L-Asp具有起效快、Gin耗竭作用较强的特点,可作为临床儿童ALL治疗的一线药物选择.
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a-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因EXON 7突变形成A311血型基因亚型
本研究对1例产生抗A抗体的血清学正反定型不符的A血型标本进行血型血清学分析及基因分析,以了解其分子基础.采用试管法进行血型血清学的检测,采用PCR-SSP对A基因进行扩增分析,采用Sanger测序法对A血型糖基转移酶基因进行测序分析.结果表明:血清学正反定型不符,初定为A亚型;PCR-SSP扩增检测结果有0、A血型基因的存在;对ABO基因第6外显子测序发现存在c.261delG,显示有0基因;对A、O基因第7外显子进行特异性扩增测序分析显示,在A单倍型基因第7外显子出现c.467 C＞T、c.626 G＞A的突变,在0单倍型基因第7外显子出现c.646T＞A、681G＞A、771C＞T、829G＞A等突变.结论:该献血者在A基因第7外显子的c.626G＞A是新的等位基因突变,c.467 C＞T是SNP;新突变的GenBank序列号是KC690281,被BGMUT命名为1个新的A等位基因亚型A311.
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悬浮红细胞上清中与肿瘤相关非细胞成分蓄积规律研究
本研究探讨悬浮红细胞(pRBC)上清中与肿瘤相关的非细胞成分在整个保存期中的蓄积规律.在采集当日对悬浮红细胞进行五联袋分装,于保存第0、7、14、21、28、和35 d各取30 ml红细胞悬液,以1006×g离心10 min后取上清,采用ELISA方法测定正常T细胞表达和分泌因子(RANTES/CCL5)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)蓄积浓度.结果表明:RAN-TES/CCL5和TNF-α在新鲜pRBC上清中保持有较高的浓度,随着保存期的延长,其蓄积浓度未见有明显增高.VEGF在保存当天的pRBC上清中浓度为229.9 pg/ml,保存7d末浓度迅速上升至749.08 pg/ml,之后较稳定地维持在高水平,保存35 d末其浓度为760.67 pg/ml,其浓度曲线显示了保存7d后的一个明显上升,但配对t检验未见有统计学差异.PDGF的蓄积规律表现为:PDGF在保存当天的pRBC上清中浓度为13.54 ng/L,保存期内稳定上升,28 d末略有下降,保存35 d末其浓度迅速上升为22.13 ng/L(P ＜0.05),显示浓度增长有统计学差异.MCP-1在保存当天的浓度为39.98 ng/L,保存期内缓慢上升,35 d末浓度为49.83 ng/L.结论:随着保存期的延长,pRBC上清中生长因子类物质似乎呈现明显的增长趋势,而RANTES/CCL5和TNF-α在新鲜pRBC上清中即保持有较高的浓度,且随着保存时间的延长蓄积浓度未见有明显增高,看来同保存期的延长无明显相关.
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丙氨酸溶液作为A→O血型转变酶解缓冲液的研究
本研究旨在探讨丙氨酸缓冲液对α-N-乙酰半乳糖胺酶发挥高效酶解A抗原活性的影响.用Western blot检测α-N-乙酰半乳糖胺酶在丙氨酸等不同缓冲液中与红细胞的结合能力.结果表明,丙氨酸溶液也可以作为A→O血型转变的酶解缓冲液,α-N-乙酰半乳糖胺酶在丙氨酸溶液中酶解A型红细胞所用剂量与在甘氨酸溶液中的相当;Western blot证实,在丙氨酸溶液中α-N-乙酰半乳糖胺酶与红细胞结合能力与在甘氨酸中相似,这也进一步证明α-N-乙酰半乳糖胺酶与红细胞的结合是α-N-乙酰半乳糖胺酶发挥酶解A抗原的活性所必需的.结论:丙氨酸溶液可以作为A→O血型转变的酶解缓冲液,在这一缓冲液中α-N-乙酰半乳糖胺酶与红细胞紧密结合,可以发挥高效的酶解A抗原的活性.
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大量输血时血浆与红细胞的比例探讨
本研究通过回顾性分析大量输血对患者凝血功能的影响,探讨新鲜冰冻血浆与红细胞的合适比例.2011年1月-2013年1月,因各种原因需要大量输血的患者151例,按照凝血功能正常与否,分为凝血功能正常组(138例)和凝血功能异常组(13例),以新鲜冰冻血浆与红细胞之比为1∶1作为分界,每组均分为高血浆(2∶1)、中血浆(1∶1)、低血浆(＜1∶1)3个比例组.输血前和大量输血后24 h检测凝血功能.结果表明,大量输血24h后,凝血功能正常组的低血浆组凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)明显延长,纤维蛋白原(FIB)含量明显降低(均P ＜0.05);高、中血浆组凝血功能无明显变化(P＞0.05);凝血功能异常组的中血浆和低血浆组在大量输血后凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间,纤维蛋白原仍在异常水平(P＞0.05),高比例组的凝血功能明显改善(P＜0.05).结论:大量输血时,血浆与红细胞比例应根据患者凝血功能进行调整,凝血功能异常的患者建议新鲜冰冻血浆与红细胞的比例为2∶1,以改善患者的凝血功能,减少不良事件的发生;凝血功能正常的患者建议冰冻血浆与红细胞的比例为1∶1,减少稀释性凝血功能障碍和高血容量的发生.
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一例AML-M2患者初发和缓解期转录组测序SNV结果比较分析
本研究旨在进一步阐明急性髓系白血病的发病机制,筛选新的肿瘤特异性突变.利用高通量测序的方法对1例初诊的部分分化型急性髓系白血病(AML-M2)患者发病期及缓解期外周血样本进行转录组测序,通过对初诊时和缓解后表达基因的比较,筛选可能与白血病发生相关的单核苷酸变异(SNV).结果表明:Reads在基因上分布均匀,覆盖完整,检测到大部分基因的表达.通过对SNV的筛选,共检测到29881个基因突变,包括28113个种系突变和752个体突变,其中编码区获得性突变11个(P＜0.05),包括ZRSR1、MLXIP、TLN1、LAP3、HK3.结论:高通量测序作为一种无偏的检测基因突变的新方法,可以发现肿瘤相关新突变.MLXIP可能是AML M2新的分子标志物.
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DNA甲基化对TIG1基因在急性白血病中表达的影响
本研究探讨急性白血病细胞中抑癌基因TIG1的表达及其甲基化状态.应用实时荧光定量PCR(real-time Quantitative PCR,RT-QT-PCR)的方法,检测53例急性白血病(acute leukemia,AL)患者及20例正常对照者(nomal controls,NC)的TIG1表达情况,并通过甲基化特异性PCR(methylation-sepecific PCR,MS-PCR)检测TIG1基因的甲基化状态.应用去甲基化试剂处理KG-1a、U937和K562细胞株,观察其基因转录水平和甲基化状态之间的关系.结果表明,TIGl mRNA在NC中高表达,而在AL患者中低表达;AL患者中TIG1的异常甲基化率高达75％(40/53例),而在正常标本中不发生甲基化;在初治AL中,发生甲基化的患者TIG1的表达水平明显低于未甲基化的患者;Kg-1a、U937和K562细胞株TIG1基因启动子CpG岛均存在过甲基化,应用去甲基化试剂处理后,TIG1基因启动子CpG岛甲基化程度降低,TIG1的表达都得到了恢复,并且TIG1的表达随着5-Aza-CdR浓度增加而增高.结论:TIG1基因表达的减少与急性白血病的发病有关,而甲基化是导致TIG1基因转录沉默的重要机制之一.
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白血病患者骨髓中CTGF、CYR61、VEGF-C、VEGFR-2 mRNA、蛋白的表达及其临床相关性研究
本研究旨在探讨白血病患者骨髓单个核细胞中结缔组织生长因子(CTGF)、富含半胱氨酸蛋白61(CYR61)、血管内皮生长因子-C(VEGF-C)和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2) mRNA及蛋白的表达水平以及它们在白血病发生、发展、浸润转移中的作用和临床意义.初发白血病100例患者,26例完全缓解后急性白血病患者,30例对照者纳入本研究.收集骨髓单个核细胞,应用real time PCR和Western blot分别检测白血病患者及对照者CTGF、CYR61、VEGF-C、VEGFR-2 mRNA及蛋白的表达水平.结果表明,急性白血病患者骨髓中上述4种因子mRNA、蛋白水平明显高于对照组(P＜0.05).急性白血病缓解后只有CTGF mRNA表达与对照组比较有差异(P＜0.05),且CTGF mRNA表达在急性白血病不同骨髓增生中有统计学意义(P＜0.05).CTGF蛋白表达在白血病不同染色体核型组有差异(P＜0.05),CYR61和VEGF-C蛋白表达在急性白血病不同程度骨髓增生组中比较差异有统计学意义(P＜0.05).CML组CTGF、CYR61、VEGF-C mRNA和蛋白表达高于对照组(P＜0.05),CLL组CTGF和CYR61蛋白表达水平高于对照组.在性别、髓外浸润等因素分组比较中,上述4种因子mRNA和蛋白表达水平比较均无差异有统计学意义(P＞0.05).在相关性分析中,白血病患者上述4种因子mRNA表达水平与骨髓原始细胞计数呈正相关(P＜0.05),CTGF、CYR61、VEGF-C蛋白表达水平与其呈正相关(P＜0.05).除了VEGFR-2与骨髓原始细胞计数无相关性外,这些因子的mRNA及蛋白表达水平与骨髓原始细胞计数呈正相关.结论:CYR61、CTGF、VEGF-C和VEGFR-2 mRNA和蛋白表达在急慢性白血病中都有作用.在急性白血病(AML/ALL)中上述4种因子高表达,在CML中除了VEGFR-2外其他因子也高表达,多数因子的表达与骨髓原始细胞计数呈正相关.联合阻断这些相关的血管性因子可能对白血病靶向治疗有重要作用.
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CD37在恶性B细胞中表达意义的探讨
本研究旨在探讨CD37抗原在急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)及B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)细胞中表达的意义.利用多参数流式细胞仪检测对照骨髓标本、B-ALL标本及B-NHL标本细胞中CD37的表达.结果表明,20例B-ALL细胞[初治5例,伴微小残留病(MRD) 15例]低表达CD37(1.04±0.24;1.50±0.89),正常前体B细胞也低表达CD37(1.64±0.52),3组间CD37表达水平无统计学差异(P＞0.05).正常成熟B细胞和B-NHL细胞均高表达CD37(14.23±7.84和14.53±10.93),它们之间差异无统计学意义(P＞0.05).正常B细胞不同发育阶段的CD37表达水平比较显示,B祖细胞低表达CD37 (0.88±0.17),B前体细胞CD37表达增高(2.44±0.69),成熟B细胞CD37表达高.结论:低表达CD37并非B-ALL细胞所特有.幼稚B细胞低表达CD37,随着B细胞的成熟CD37的表达强度逐渐升高,亦即CD37在B细胞中的表达与细胞的良恶性无关.
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急性早幼粒细胞白血病合并颅咽管瘤
本研究分析急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)合并颅咽管瘤的临床表现及治疗方案,提高对APL合并或继发第二肿瘤的认识.应用骨髓细胞形态学检查对APL进行确诊;应用免疫分型技术对骨髓中白血病细胞进行分析;应用分子生物学检测PML-RARα融合基因以定性及确定治疗前后定量变化;应用常规染色体核型技术及FISH技术以分析该患者细胞遗传特点.结果表明,急性早幼粒细胞白血病合并或继发第二肿瘤的临床表现多样,病情复杂.通过早期发现、及时治疗、多学科合作取得了良好的疗效,避免了误诊、漏诊延误诊治.结论:当急性早幼粒细胞白血病经过治疗缓解后,再出现其它临床症状时需考虑其他肿瘤的可能,临床上需仔细观察临床表现,早期诊断,及时治疗,以提高患者的生存率.
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CD25在急性B淋巴细胞白血病中的表达及其临床意义探讨
本研究旨在通过流式细胞术标记CD25,探讨其与急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的关系及其临床意义.选择88例初发B-ALL患者骨髓,应用流式细胞术检测免疫表型标记,包括白介素2受体α链(CD25)、β链(CD 122)、γ链(CD132),CD19、CD20、CD10、CD34、CDIgM、CD79a、CD22、CDTDT;用定性PCR方法检测BCR/ABL融合基因表达,实时定量PCR检测IL2RA(CD25基因)的表达.结果表明,CD25+和CD25-的B-ALL患者白细胞计数(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(Plt)、骨髓原始细胞比例(marrow blast％)、外周血原始细胞比例(peripheral blast％)、肝脾和淋巴结肿大、CD10、CD20、CD22、CD34、CD79a、CDTDT、CDIgM表达水平差别均无统计学意义(P＞0.05),而CD19在CD25+组中表达水平高于CD25-组(P＜0.05).本组BCR/ABL+患者为21例(23.9％,21/88),CD25+表达率为66.7％(14/21);BCR/ABL-患者为67例,CD25+表达率为4.5％ (3/67),两组间差别有统计学意义(P＜0.05).IL2RA基因mRNA表达水平在CD25+和CD25-两组间无统计学差异(P＞o.05).21例BCR/ABL+ B-ALL患者中,CD25+与CD25-两组间在缓解率和复发率方面差异无统计学意义(P＞o.o5).BCR/ABL+ B-ALL患者中有8例复发,复发率为38.1％ (8/21),BCR/ABL-组有9例复发,复发率为13.4％(9/67),两组间差异有统计学意义(P＜0.05).BCR/ABL+组无复发生存时间(relapse-free survival,RFS)为21个月,BCR/ABL+ CD25+患者RFS时间为15个月,而BCR/ABL+ CD25-患者RFS时间为21个月,BCR/ABL-CD25-患者RFS时间为24个月.结论:CD25在BCR/ABL+ B-ALL患者中呈高水平表达,可以作为B-ALL的BCR/ABL融合基因表达的预测指标,与疾病复发有关,CD25+可以作为判断B-ALL不良预后的辅助标志.
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MMP-2和MMP-9在急性B淋巴细胞白血病中的表达及临床意义
本研究探讨急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患者骨髓细胞中基质金属蛋白酶-2和-9(MMP-2,MMP-9)的表达及临床意义.采用半定量RT-PCR方法检测初治、复发B-ALL患者和正常对照骨髓中单个核细胞MMP-2,MMP-9 mRNA的表达.采用明胶酶谱检测B-ALL患者和正常对照骨髓单个核细胞孵育上清中MMP-2,MMP-9的酶活性.结果表明,初治、复发组B-ALL患者中MMP-2表达率明显高于正常对照组(P＜0.05);MMP-9表达率明显低于正常对照组(P＜0.05).髓外浸润组患者MMP-2和MMP-9表达率均明显高于无髓外浸润组(P＜0.05),而MMP-2/MMP-9(+)组髓外浸润发生率明显高于MMP-2/MMP-9(-)组.高危组B-ALL患者MMP-9表达率明显高于标危组,而两组间MMP-2表达率无显著性差异(P＞0.05).结论:B-ALL患者白血病细胞可以产生MMP-2,MMP-9,可能参与了B-ALL的髓外浸润,MMP-9表达可能提示预后不良.
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P2X家族受体在急性T淋巴细胞白血病小鼠腹腔巨噬细胞中的表达
本研究旨在探讨Notch1诱导的小鼠急性T淋巴细胞白血病模型中,腹腔巨噬细胞P2X家族受体的表达变化规律及其与巨噬细胞活化状态的相关性.建立小鼠急性T淋巴细胞白血病模型后,根据F4/80和CD206两个表面标记,用流式细胞术分别分选腹腔巨噬细胞以及CD206+的M2样和CD206-的M1样腹腔巨噬细胞;用实时定量PCR法研究各亚群细胞中P2X家族受体的表达变化规律.结果表明:腹腔巨噬细胞、M2样和M1样腹腔巨噬细胞均表达除P2X5受体外的其他P2X家族受体,且表达强度中等.各受体的表达随白血病发展变化而有所不同,其中腹腔巨噬细胞中P2X1和P2X7受体的表达逐渐提高,P2X2和P2X3受体表达在白血病晚期显著降低,P2X4受体表达仅在中期有所降低,P2X6受体表达无显著变化.在白血病发展中期M2样和M1样腹腔巨噬细胞间P2X家族受体表达亦存在差异,其中M2样巨噬细胞P2X1受体的表达水平显著低于M1样巨噬细胞,而M2样巨噬细胞P2X7受体表达水平显著高于M1样巨噬细胞,提示P2X家族受体表达与腹腔巨噬细胞活化状态相关.结论:白血病小鼠腹腔巨噬细胞P2X家族受体表达与白血病进程和巨噬细胞活化状态相关.本研究为深入探究巨噬细胞在白血病发展中的作用机制奠定基础.
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血浆Reg3α蛋白水平与肠道aGVHD的相关性研究
本研究探讨血浆Reg3α蛋白水平与异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后肠道急性移植物抗宿主病(GI-aGVHD)的临床诊断及预后的相关性.以我院2011年12月至2012年12月行allo-HSCT的103例患者为研究对象.采集移植前9d、0d、移植后14 d、移植后28 d、腹泻时多个时间点抗凝外周血,对发生aGVHD的患者进一步采集治疗1周及4周后抗凝外周血,采用ELISA方法检测血浆Reg3α蛋白浓度.结果表明,103例患者中无aGVHD17例,非aGVHD腹泻27例,单纯皮肤aGVHD 10例,Ⅰ-Ⅱ度肠道aGVHD (GI-aGVHD) 17例,Ⅲ-Ⅳ度GI-aGVHD32例.GI-aGVHD患者和非aGVHD腹泻患者腹泻时血浆Reg3α蛋白水平分别为111.5(54.7-180.2) ng/ml和23.9(14.5-89.5)ng/ml (P ＜0.001).Ⅲ-Ⅳ度GI-aGVHD患者治疗4周后,治疗有效组17例与治疗无效组7例血浆Reg3α蛋白水平分别为137.2(51.7-205.4) ng/ml和679.4(122.3-896.8)ng/ml(P=0.028).治疗无效组7例全部死于aGVHD相关的多器官功能衰竭.血浆Reg3α蛋白浓度≥87.73 ng/ml时预测Ⅲ-Ⅳ度GI-aGVHD的鉴别效度即曲线下面积大(AUC=0.902),其诊断Ⅲ-Ⅳ度GI-aGVHD敏感度为81.48％,特异性为82.86％.移植后Reg3α蛋白高水平组(≥87.73 ng/ml)患者Ⅲ-Ⅳ度GI-aGVHD发生率明显高于低水平组(＜87.73 ng/ml)(P＜0.001).结论:移植后血浆Reg3α蛋白水平升高提示Ⅲ-Ⅳ度GI-aGVHD的发生,Ⅲ-Ⅳ度GI-aGVHD患者免疫抑制治疗后血浆Reg3α蛋白水平不降低与预后不良相关,血浆Reg3α蛋白水平可作为提示GI-aGVHD的生物学标志物.
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单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植治疗重型再生障碍性贫血-Ⅱ型的临床观察
本研究探讨单倍体相合造血干细胞移植联合脐带血间充质干细胞(hUC-MSC)治疗重型再生障碍性贫血-Ⅱ型(SAA-Ⅱ)的安全性、有效性及相关并发症的发生情况.对8例重型再生障碍性贫血-Ⅱ型均进行单倍体造血干细胞移植,移植物选用G-CSF动员的外周血干细胞加骨髓干细胞混合移植方案,并加入脐带间充质干细胞作为第3方细胞;预处理方案采用兔抗人T淋巴细胞球蛋白(ATG)+环磷酰胺(CTX)方案+福达拉滨(Flu)方案,其中2例患者加用马法兰(Bu);移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的预防方案采用环孢菌素A+ ATG+霉酚酸酯(MMF)+短程甲氨喋呤(MTX)+CD25单克隆抗体.结果表明,8例患者全部获得造血重建,血象好转:中性粒细胞＞0.5×109/L平均时间11.9 d;血小板＞20×109/L平均时间14.6 d.Ⅰ-Ⅱ度急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生率25％,Ⅲ-Ⅳ度aGVHD发生率12.5％,移植相关死亡率为25％.结论:联合脐带MSC的单倍体异基因造血干细胞移植治疗SAA-Ⅱ安全可行,疗效显著,临床可以对其进一步尝试.
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白血病小鼠H-2全不相合微移植模型的建立及鉴定
本研究旨在建立白血病小鼠H-2全不相合微移植模型并进行鉴定.受、供鼠分别为雌性BALB/c和雄性C57BL/6J,H-2为全不相合.受鼠微移植前5d静脉接种WEHI-3细胞约1×l06个,微移植前3d开始给予MA化疗(米托蒽醌+阿糖胞苷),0d末次化疗后8h之内回输经G-CSF动员的供体脾单个核细胞,回输细胞数分别为(3、6、12)×10 7个.化疗对照组用等量生理盐水.所有受鼠不予GVHD预防.比较各组早期死亡率、白细胞恢复及白血病负荷情况.RT-PCR法检测微移植后供体嵌合率.从临床表现和病理情况综合评价微移植组小鼠GVHD情况.结果表明,化疗对照组早期死亡率为25％,(3、6、12)×107组分别为16.67％、8.33％、8.33％.(3、6)×107组白细胞恢复明显优于化疗对照和12×10 7组(P＜0.05).白血病负荷(3、6、12)×10 7组明显低于化疗对照组(P＜0.01),而(6、12)×107组明显低于3×10 7组(P＜0.05).微移植后供体成分在2周之内以微嵌合形式存在.微移植组小鼠均未发生明显GVHD证据.结论:成功建立了白血病小鼠H-2全不相合微移植模型,为后续研究及临床微移植相关研究提供了基础.
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非亲缘关系脐带血移植治疗25例血液系统疾病患者的临床研究
本研究观察非亲缘脐带血造血干细胞移植(UCBT)在血液系统疾病患者的植入率、移植物抗宿主病(GVHD)、移植相关死亡(TRM)、复发和生存情况.25例接受UCBT的血液系统疾病患者(儿童8例、成人17例)中.3例接受单份脐带血(CB),22例接受双份脐带血.供/受体低分辨人类白细胞抗原(HLA)配型结果为9例6/6位点相合、16例4-5/6位点相合.在预处理方案中21例采用TBI/Cy±Flu±ATG或BuCy±Flu±ATG,4例采用FC+ ATG方案.移植物抗宿主病(GVHD)的预防采用以环孢素(CsA)为主的方案.结果表明,存活超过42 d的20例患者中16例(80.0％)获得植入;粒系植入至移植后42 d的累积发生率为64.0％,中位时间17.0 d;巨核系植入至移植后100 d的累积发生率为60.0％,中位时间35.0 d;Ⅱ-Ⅳ度、Ⅲ-Ⅳ度急性GVHD (aGVHD)至移植后100 d的累积发生率分别为44.0％和30.7％;截止至随访结束日期,移植相关死亡率(TRM)的累积发生率为54.3％;25例患者的总生存率为42.7％;17例可评估恶性血液病患者中7例(41.2％)存活,且仅有1例复发,无事件生存率(EFS)为35.3％;5例可评估的非恶性血液病患者中4例存活,2例处于持续脐血植入状态,2例自身造血恢复;处于疾病进展期的3例患者中仅1例患者存活.结论:低分辨HLA-4-6/6位点相合的UCBT治疗血液系统疾病是可行的,双份脐血移植(dUCBT)可以克服单份脐血细胞数量不足的缺点,可用于治疗大体重儿童及成人患者.
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皮下软组织肌肉间隙淋巴瘤样肉芽肿病1例PET-CT特点及临床表现病例分析
本研究通过皮下软组织肌肉间隙淋巴瘤样肉芽肿病(lymphomatoid granulomatosis,LYG)的病例分析探讨LYG的病理、MICM(骨髓形态、免疫分型、分子生物学、细胞遗传学)、PET/CT和临床特点及治疗经验.应用病理免疫组织化学方法观察了LYG的病理改变,骨髓细胞涂片法观察骨髓细胞形态改变,流式细胞术检测免疫分型多重巢式PCR检测异常基因表达和突变,实时荧光定量PCR (FQ-PCR)检测血清EBV-DNA含量,18氟-脱氧葡萄糖正电子发射断层显像/计算机断层成像(18F-FDG PET/CT)术明确临床分期.结果表明,患者发病时右大腿内侧有肿物和右颌下淋巴结肿大,但PET/CT检查发现患者全身多处软组织内有异常软组织影伴高代谢改变,且累及肺、甲状腺、淋巴结和胃;右大腿内侧肿物活检证实为淋巴瘤样肉芽肿病Ⅱ级,但骨髓细胞涂片显示无异常肿瘤细胞浸润;白血病免疫分型为NK细胞比例增高伴表型异常;染色体核型为46,XY[24];多重巢式PCR未检出异常基因表达和突变;FQ-PCR检测显示EBV-DNA＜ 102 copies/ml;2个周期R-CHOP方案(利妥昔单抗0.7gd0、环磷酰胺1.4gd1、表柔比星90 mgd 1、长春地辛4mgd1、泼尼松90mgd 1-5)化疗后,PET-CT显示原双腿皮下软组织肌肉间隙高代谢结节样影基本消失,但左侧腘窝区域软组织内仍可见部分高代谢病灶,影像评估为PR.结论:淋巴瘤样肉芽肿病是一种罕见疾病,发病率极低;皮下软组织肌肉间隙淋巴瘤样肉芽肿病在国内外文献均未见报道;该病发病机制未明确,无标准治疗;PET/CT能发现临床体检不能发现的病变,能够再进行更准确的分期;PET/CT检查对淋巴瘤样肉芽肿病的辅助诊断、分期、疗效评价方面有重要价值.
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雄黄诱导人弥漫性大B淋巴瘤SU-DHL-4细胞凋亡及其机制的初步研究
本研究旨在探讨雄黄(Realgar,As4S4)诱导人弥漫性大B淋巴瘤SU-DHL-4细胞凋亡及其可能的机制.采用MTT法观测雄黄对SU-DHL-4细胞的增殖抑制作用,应用流式细胞术检测药物对SU-DHL-4细胞周期的影响及其诱导凋亡情况,利用琼脂糖凝胶电泳方法观察凋亡细胞的DNA降解情况,通过透射电子显微镜技术观察药物作用前后细胞超微结构的变化,采用Western blot方法检测药物诱导SU-DHL-4细胞48 h后Caspase-3、Bcl-2以及Bax蛋白表达情况.结果表明:20、40、80 μmol/L的雄黄均可抑制SU-DHL-4细胞增殖,抑制率呈时间-剂量依赖性(r=0.982;P＜0.05);AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率显示雄黄作用SU-DHL-4细胞48 h后,随着药物浓度的增加,早期凋亡细胞所占比率增高(P ＜0.05);PI单染流式细胞术检测细胞周期发现,雄黄作用SU-DHL-4细胞48 h后处于细胞周期S期的细胞显著减少(P＜0.05);透射电子显微镜下观察雄黄作用SU-DHL-4细胞48 h后各浓度组细胞,均呈典型凋亡的改变,偶见坏死细胞;琼脂糖凝胶电泳结果显示,各浓度实验组雄黄干预SU-DHL-4细胞48 h后,细胞核DNA降解呈梯状;Western blot结果显示,雄黄作用SU-DHL-4细胞48 h后,Bcl-2蛋白表达降低,Bax和Caspase-3蛋白表达增加.结论:雄黄可以诱导人弥漫性大B淋巴瘤细胞凋亡,其作用机制可能是通过抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、上调Caspase-3和Bax蛋白,下调Bcl-2蛋白而诱导细胞凋亡.
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阻断B7/CD28及CD40/CD154共刺激信号对致敏小鼠免疫功能的影响
本研究旨在通过阻断致敏小鼠的B7/CD28及CD40/CD154共刺激信号途径,探讨其免疫功能的变化,为应用于异基因骨髓移植的免疫耐受提供实验依据.将致敏的BALB/c小鼠分成4组:①CTLA4Ig+ anti-CD154鼠源性同型对照抗体;②anti-CD154单克隆抗体+CTLA4Ig鼠源性同型对照抗体;③CTLA4Ig+ anti-CD154单克隆抗体;④CTLA4Ig及anti-CD154单克隆抗体的鼠源性同型对照抗体.正常BALB/c小鼠应用CTLA4Ig及anti-CD154单克隆抗体的鼠源性同型对照抗体.给予每只小鼠CTLA4 Ig和anti-CD154单克隆抗体或相对应的同型对照抗体各500 μg,于移植前7天尾静脉输注,每组小鼠各5只.移植当天处死各组小鼠,应用流式细胞仪检测脾细胞中CD19+ CD69+B细胞数量、CD44high/CD62Lhigh及CD44high/CD62Llow/-T细胞数量.用流式细胞仪或ELISA法检测血清中抗体及细胞因子的变化.结果表明:小鼠致敏后CD19+ CD69+B细胞数量与正常小鼠相比明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01),阻断B7/CD28或/和CD40/CD154共刺激信号通路后可见抑制效应(P＜0.01),两者同时阻断具有协同作用(P＜0.01).小鼠致敏后记忆性T细胞CD44high/CD62Lhigh及效应性T细胞CD44high/CD62Llow/-与正常相比亦明显增多(P＜0.01).阻断共刺激信号通路后可使其明显抑制,CTLA4 Ig和anti-CD154单克隆抗体联合应用具有协同效应(P＜0.01).各组小鼠细胞因子及IgG、IgM抗体均无明显差异(P＞0.05),但血清中致敏抗体检测显示致敏后特异性抗体升高,阻断共刺激信号通路后其明显被抑制(P＜0.01).结论:阻断B7/CD28或CD40/CD154共刺激信号途径均能抑制致敏小鼠的细胞免疫功能及体液免疫功能;同时阻断有协同作用.
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中电导钙激活性钾通道在多发性骨髓瘤细胞增殖、迁移、侵袭和IgE分泌中的作用
本研究旨在探讨中电导钙激活性钾通道(IKCa1)在多发性骨髓瘤细胞增殖、迁移、侵袭及单克隆免疫球蛋白分泌中的作用.应用台盼蓝拒染法检测IKCa1阻滞剂克霉唑(clotrimazole,CLO)对MM细胞株U266生存能力的影响;应用Transwell迁移及Matrigel侵袭实验检测CLO对U266细胞迁移及侵袭能力影响;应用双抗夹心法(ELISA法)检测CLO对U266细胞单克隆免疫球蛋白IgE分泌的影响.结果表明,小剂量CLO(≤1.0 μmol/L)对U266细胞活力无明显影响.Transwell迁移实验及Matrigel侵袭实验显示,小剂量CLO(≤1.0 μmol/L)作用后,U266迁移及侵袭能力明显降低(P＜0.05).1.00μmol/L CLO作用24 h与48 h后,细胞上清液IgE浓度分别为(4.98±0.39)、(4.38±0.32) ng/ml,24 h与48 h对照组IgE浓度分别为(15.41±1.88)、(21.73 ±2.01) ng/ml,提示1.00μmol/L组与对照组比较具有显著差异(P＜0.05).结论:CLO通过阻滞IKCa1而抑制MM细胞迁移和侵袭及M蛋白分泌,这为MM靶向治疗提供新思路.
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多发性骨髓瘤侧群细胞分选及其生物学特征分析
本研究旨在从人多发性骨髓瘤细胞株中分选出侧群(SP)细胞并对其生物学特性进行分析.细胞经Hoechst33342染色后,应用荧光显微镜观察细胞内Hoechst荧光染色情况,采用流式细胞荧光激活分选(FACS)技术,将细胞分选为SP细胞与主群(main population,MP)细胞,用细胞生长曲线法比较两群细胞的体外增殖能力、集落形成试验比较细胞集落形成能力、流式细胞术分析两群细胞CD138的表达情况,应用RT-PCR法检测ABCG2mRNA在两群细胞中的表达不平、硼替佐米对CCK-8法和集落形成试验检测对两群细胞增殖、活力和细胞集落形成能力的影响.结果表明,骨髓瘤细胞株中存在小部分比例的SP细胞,RPMI 8226细胞株中SP细胞高达(7.10±2.69)％,在荧光显微镜下也检测到SP细胞;SP细胞增殖活力、细胞集落形成能力明显高于MP细胞(P＜0.05);该基因SP和MP细胞的CD138表达率无明显差异(P＞0.05);SP细胞表达耐药基因ABCG2,而MP细胞几乎不表达该基因;SP细胞的硼替佐米抑制率明显低于MP细胞(P＜0.05),但在40 nmol/L作用下,两者抑制率未显示差异有显著统计学意义(P＞0.05);硼替佐米均能降低两群细胞的集落形成能力,但MP细胞降低更为明显.结论:骨髓瘤细胞系中存在少量SP细胞,具有肿瘤干细胞的相关生物学特性.
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中性粒细胞CD64指数在血液病合并细菌感染诊断中的价值
本研究探讨中性粒细胞表面CD64指数(nCD64 ID)在血液病患者细菌感染中的诊断价值.采用回顾性分析方法,对入选的232例血液病患者通过流式细胞术检测骨髓nCD64 ID、血沉(ESR)、血清C反应蛋白(CRP)、纤维蛋白原(Fib)共4个炎性指标检测结果进行比较.结果表明,临床感染组nCD64 ID明显高于非感染组和自身免疫性疾病组(P均＜0.0001),血培养阳性感染组nCD64 ID明显高于血培养阴性感染组(P＜0.0001).ROC曲线分析结果显示nCD64 ID、ESR、CRP、Fib 4个炎性指标的佳临界值分别为4.96,21.5 mm/h,8.56 mg/dl及4.42mg/dl,敏感性分别为0.928、0.725、0.754及0.594,特异性分别为0.933、0.625、0.837及0.77.结论:nCD64 ID与ESR、CRP、Fib 3个炎性指标相比在诊断血液病细菌感染中具有更高的敏感性和特异性,可作为血液病常规的细菌感染检测指标.
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融合蛋白TRX-hJagged1原核表达载体的构建及其在BL21中的表达
本研究旨在构建原核表达载体并原核表达Notch配体Jagged1.构建不同长度但均包含DSL区的原核表达载体pET-hJagged1,将构建重组原核表达载体pET-hJagged1转化大肠杆菌BL21后,予以IPTG诱导,优化诱导条件,使目的蛋白TRX-hJagged1在上清中有较大量表达.诱导工程菌并以镍柱纯化对可溶性的目的蛋白进行纯化.结果表明,成功构建了原核表达载体pET-hJagged1(BglⅡ)、pET-hJagged1 (Hind Ⅰ)及pET-hJagged1(Stu Ⅰ),但仅pET-hJagged1(Stu Ⅰ)表达可溶性的TRX-hJagged1.通过镍柱纯化获得了较单一的TRX-Jagged1蛋白,Western Blot证实了其为目的蛋白.结论:成功地构建了原核表达载体pET-hJagged1,并在原核表达系统表达了TRX-Jagged1融合蛋白,为进一步研究Jagged1在淋巴造血系统中的作用奠定了基础.
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IFN-γ增强人脐带间充质干细胞的免疫抑制能力
本研究旨在探讨IFN-γ对脐带间充质干细胞免疫抑制能力的影响.利用细胞因子刺激细胞表面受体的方法改变MSC的免疫抑制能力.用MSC与淋巴细胞共培养实验检测激活后MSC对淋巴细胞增殖抑制的变化.用荧光定量PCR实验和ELISA实验检测激活后MSC基因和蛋白的表达变化情况.结果表明:IFN-γ可以增强脐带MSC的免疫抑制能力,IFN-γ激活后的MSC能更有效的抑制淋巴细胞的增殖,上调MSC细胞内免疫抑制基因IDO1,COX2和HLA-G等的表达和可溶性免疫抑制蛋白HLA-G、KYN、IL-10、PGE2等的分泌,并在细胞共培养实验中将间充质干细胞的免疫抑制功能提高2-7倍.结论:IFN-γ可有效提高MSC的免疫抑制能力.
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非基因整合建立人诱导多能性干细胞方法的优化研究
诱导多能性干细胞(iPSC)技术具有临床应用前景,但iPSC的遗传稳定性和成瘤性阻碍了其可能的临床应用.非整合质粒(Episomal)方法无外源基因整合到宿主基因组上并且方法简单,适宜推广,是目前保证iPSC遗传安全性的佳方案之一,但其诱导效率偏低,严重阻碍了其应用.本研究旨在优化Episomal方法,将脐血单个核细胞(CB MNC)重编程为诱导多能性干细胞(iPSC),建立无基因整合的iPSC的高效生成技术体系,为以后建立疾病iPSC奠定基础.利用CB MNC,通过比较不同氧含量,诱导质粒,MNC培养方法和预刺激时间等条件对Episomal方法进行优化.结果表明:CB MNC采用红系培养液,培养8d,使用启动子为SFFV (spleen focus forming virus)的Episomal载体,在低氧(3％)条件下诱导,CB MNC重编程效率高,可达到0.12％.通过分析佳条件下供体细胞成分发现,表型为CD36+ CD71+ CD235alow的有核红细胞是重编程主要的供体细胞来源.结论:本研究成功建立并优化出一种可推广的高效安全的,可以用于临床应用研究的iPSC诱导技术.
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骨髓、脐带及脂肪来源间充质干细胞的成脂能力存在差异
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的来源非常广泛.由于不同组织来源的影响,MSC之间都会存在一定的差异.本研究分析比较脐带、脂肪及骨髓组织来源的MSC的基本生物学特性.从脐带、脂肪和骨髓分离培养MSC,在显微镜下观察这3种来源的MSC的形态(UC-MSC,AD-MSC和BM-MSC),用流式细胞术诱导分化试验及定量荧光PCR分别检测UC-MSC,AD-MSC和BM-MSC的免疫表型、分化能力和过氧化物酶增殖激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ)mRNA的表达水平.结果表明,UC-MSC、AD-MSC和BM-MSC的形态都是成纤维细胞样;经罗丹明和DAPI染色后,用共聚焦显微镜观察发现它们的细胞形态类似;这三种来源MSC的免疫表型符合MSC的鉴定标准,而且表达水平一致;这三种来源MSC的成骨分化潜能相似,而成脂分化潜能存在较明显的差异,其中AD-MSC成脂能力强,BM-MSC次之,UC-MSC差.检测脂肪形成早期起重要作用的过氧化物酶增殖激活受体-γ(PPAR-γ) mRNA表达水平在三种来源MSC中的基础表达水平,发现PPAR-γmRNA在AD-MSC中高,在BM-MSC次之,而在UC-MSC中低,与成脂能力的表现相一致.这表明三种来源MSC成脂能力存在差异可能与它们PPAR-γ的基础表达水平有关.结论:UC-MSC,AD-MSC和BM-MSC的形态类似;免疫表型符合MSC鉴定标准,表达水平一致;成骨分化能力相似,而成脂分化能力不同;PPAR-γmRNA表达水平不一.关于差异的相关机制有待进一步研究.
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CD48表达可作为区分造血干细胞分裂方式的活性标志
造血干细胞在细胞分裂时具有维持自我更新和产生定向分化的能力,其依赖于三种细胞分裂方式,一个干细胞产生两个新的干细胞(对称的更新分裂)、两个分化细胞(对称的分化分裂)或者一个干细胞和一个分化细胞(不对称分裂).本研究旨在探索一种高效、稳定的区分造血干细胞分裂方式的方法.前期研究表明,Numb蛋白的分布情况可以作为许多细胞辨别分裂方式的标志,本研究利用免疫荧光技术检测Numb蛋白在小鼠分裂期CD48-CD150+ LSK细胞中的分布情况,探索Numb蛋白与中心体的关系.由于CD48表达阳性标志着细胞失去了骨髓重建能力,因此本研究把CD48的表达作为区分造血干细胞自我更新或定向分化的一个活性标志.从小鼠全骨髓细胞中分选出CD48-CD150+ LSK细胞,培养体系中加入自行制备的AF 488-conjugated anti-CD48抗体,培养3d后共聚焦荧光显微镜观察及流式细胞分析是否存在AF488+细胞及其所占比例,然后二次分选AF488+和AF488-细胞进行细胞集落形成实验(colony forming cell assay,CFC)与细胞增殖能力比较.结果表明:Numb蛋白在处于分裂期的CD48-CD150+ LSK细胞中对称或不对称分布在细胞分裂平面两侧,这提示Numb蛋白染色可以作为一种区分造血干细胞分裂方式的方法.此外,CD48-CD150+ LSK细胞在含有自行制备的AF488-conjugatedanti-CD48抗体的培养体系中培养3d后产生约40％ AF488+细胞,共聚焦荧光显微镜统计的阳性细胞比例与流式细胞分析检测结果一致.二次分选AF488+和AF488-细胞,AF488+细胞群的集落形成能力显著高于AF488-细胞群(P＜0.05),AF488-细胞群的增殖能力显著高于AF488+细胞群(P＜0.05).结论:CD48表达作为细胞干性丢失的活性标志,可区分造血干细胞的分裂方式.该方法与Numb蛋白染色方法相比,具有用于活细胞的优势,它为后续的细胞培养与细胞移植等研究工作提供了更大的便利.
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树突状细胞外泌体诱导间充质干细胞向成骨细胞分化
本研究观察人树突状细胞(dendritic cells,DC)来源的外泌体(DC-derived exosome,DCex)对人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)成骨分化的影响.采用超速离心法从树突状细胞培养上清中获取DCex,应用电子显微镜观察DCex形态并通过流式细胞术检测和鉴定其细胞来源.取第3代MSC,设3组培养诱导体系:①对照组:α-MEM基础培养液组;②实验组:α-MEM基础培养液+DCex(10 μg/ml)组;③α-MEM基础培养液+标准诱导剂组.采用荧光实时定量PCR、琼脂糖凝胶电泳检测各组成骨分化转录因子Runx2 mRNA的表达情况,并进行碱性磷酸酶(ALP)活性检测.另外,荧光染料DiI标记DCex,应用共聚焦显微镜观察DCex进入MSC的过程.结果显示,在电子显微镜下DCex呈典型的圆形或椭圆形膜层结构,直径为40-100 nm,并表达DC细胞的标志物CD83,CD86,CD80和HLA-DR.在DCex处理MSC后6h时,可在共聚焦显微镜下观察到进入到MSC胞质内的DCex,随着作用时间延长,细胞荧光强度增加.按组培养第7天,DCex实验组Runx2表达较对照组增高,差异有统计学显著性(P ＜0.05);MSC培养第14天,DCex组ALP含量OD值与对应蛋白比为2.22 ±0.27,显著高于阴性对照组(1.20±0.21) (P＜0.01),但低于标准诱导组(3.22±0.24) (P ＜0.05).结论:DCex可以促进MSC向成骨细胞分化,其具体机制仍需进一步研究证实.
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人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体特性研究
本研究旨在探讨正常人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSC)分泌的外泌体(exosome)免疫调节功能及支持血管形成能力.收集第4-6代BMMSC上清液提取外泌体,应用透射电镜观察其形态,蛋白印迹法检测其表面特异标志CD9,bicinchoninic acid(BCA)方法定量检测外泌体分泌量;与正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNC)作用72 h后用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测PBMNC 分泌的γ-干扰素(IFN-γ);实时定量PCR检测外泌体内免疫相关microRNA表达;共聚焦显微镜观察外泌体与人脐带静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的作用方式,与HUVEC共培养后观察其网状结构形成;应用裸鼠体内试验检测外泌体对血管形成能力的作用.结果表明,正常人骨髓间充质干细胞分泌的外泌体近似圆形,直径在40-160 nm之间,表达表面标志CD9,其分泌量与接种细胞数呈线性关系,可抑制PBMNC分泌IFN-γ(P ＜0.01),内含有免疫相关microRNA如miR301、miR22和miR-let-7a等,能促进HUVEC网状结构形成和血管形成(P＜0.01).结论:BMMSC分泌外泌体具有免疫调节功能与支持血管形成作用.
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雷帕霉素对再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞生物学功能的影响
本研究探讨雷帕霉素对再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)患者的骨髓间充质干细胞的生物学功能和自噬现象的影响,为研究雷帕霉素应用于临床再生障碍性贫血的治疗提供资料.不同浓度雷帕霉素(0、10、50、100 nmol/L)处理AA患者BM-MSC 48 h,然后用Western blot检测自噬相关蛋白LC3B的表达,应用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期的变化,CCK-8法测定细胞增殖情况,以BM-MSC成脂分化诱导2周后油红染色方法检测成脂分化能力,并且用real-time PCR检测成脂相关基因(LPL、CFD和PPARγ)的表达.结果显示:雷帕霉素引起AA患者的BM-MSC自噬增加,促进其凋亡(P＜0.05),且呈剂量依赖性地将细胞阻滞于G0/G1期,阻止其进入S期(P＜0.05);BM-MSC增殖率随雷帕霉素浓度增加而降低,并且雷帕霉素抑制AA患者BM-MSC的成脂分化,且呈剂量依赖性.结论:雷帕霉素诱导AA患者BM-MSC发生自噬和凋亡,明显促进G1期细胞周期阻滞,抑制细胞增殖和降低成脂分化,以上现象的机制可能与雷帕霉素通过抑制mTOR信号通路而激活自噬有关.
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免疫性血小板减少症患者骨髓滤泡辅助性T细胞数量及功能的研究
本研究检测免疫性血小板减少症(ITP)患者骨髓滤泡辅助性T细胞(Tfh细胞)数量及功能,探讨Tfh细胞在ITP发病机制中的作用.选取2013年1月至10月在天津医科大学总医院血液科就诊的21例初治ITP患者、20例恢复期ITP患者及18名正常对照者,采用流式细胞术检测骨髓Tfh细胞数量、Tfh细胞功能相关分子CD40L、ICOS、IL-21的表达,采用RT-PCR技术检测BMMNC转录因子BCL-6 mRNA相对表达水平;并将各项指标与疾病严重程度进行相关性分析.结果表明,ITP初治组骨髓CD4+ CXCR5+/CD4+细胞比例[(5.532±2.599)％]高于恢复期组[(4.064±2.026)％]和对照组[(4.048±1.413)％] (P ＜0.05);ITP初治组骨髓CD4+ CXCR5+ ICOS+/CD4+ CXCR5+细胞比例[(14.586±8.561)％]高于恢复期组[(12.884±10.161)％]和对照组[(7.487±5.176)％],初治组与对照组相比差异有统计学意义(P＜ 0.05);ITP初治组和恢复期组骨髓CD4+ CXCR5+CD40L+/CD4+ CXCR5+细胞比例[(15.309±10.756)％]及[(18.242±12.243)％],高于对照组[(8.618±5.719)％] (P ＜0.05);ITP初治组和恢复组骨髓CD4+ CXCR5+ IL-21+/CD4+ CXCR5+细胞比例[(58.560±26.285)％]及[(57.035±30.936)％]高于对照组[(36.289±24.868)％](P＜0.05);初治组、恢复组、对照组BCL-6 mRNA的表达水平分别为(1.407±0.264)、(1.149±0.217)和(0.846±0.157),差异均有统计学意义(P值均＜0.05).结论:Tfh细胞在ITP患者的骨髓中数量增加,功能分子表达增多,功能亢进,在ITP发病机制中可能有重要作用.
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熟蒜黄汁抗血小板聚集功能机制研究
本研究探讨熟蒜黄汁抗血小板聚集功能的机制.将熟蒜黄汁与正常人富血小板血浆(PRP)进行孵育,加入二磷酸腺苷(ADP)和胶原,观察熟蒜黄汁对人血小板聚集功能的影响.ADP和胶原激活血小板后用流式细胞仪分析熟蒜黄汁对活化血小板纤维蛋白原受体(Fib-R)和P-选择素(CD62P)表达水平及血小板纤维蛋白原结合量的影响.10只普通白兔随机分为2组,除正常饮食外,分别定量饲以生理盐水、熟蒜黄汁,观察饲养1、3、5以及8周后血小板聚集功能情况.结果表明,与对照组相比,熟蒜黄汁能显著抑制ADP和胶原诱导的人血小板聚集(P＜0.05),它们的聚集抑制率分别为87.37％(ADP诱导下)和86.24％(胶原诱导下);熟蒜黄汁不能抑制ADP和胶原诱导的活化血小板Fib-R和CD62P表达水平(P＞0.05),但能够明显抑制血小板纤维蛋白原结合量(P＜0.05).体内试验发现,熟蒜黄汁能够明显抑制ADP和胶原诱导下兔血小板聚集.结论:熟蒜黄汁能够在体内、外明显抑制血小板聚集,其机制主要是抑制了聚集通路的后环节,即血小板与纤维蛋白原的结合,因此经常食用熟蒜黄汁能够有效预防心脑血管血栓性疾病的发生.
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氨磷汀对急性放射病小鼠早期骨髓造血功能的防护作用
本研究旨在探究氨磷汀(WR2721,Amifostine)对60Coγ射线6.5 Gy单次全身照射(TBI)所致急性放射病小鼠早期骨髓造血的防护作用.60只C57/BL6J小鼠随机分成正常对照(normal)、照射对照(IR)和WR2721预防给药(WR2721)3组.观察WR-2721照射前30 min给药对6.5 Gy 60Coγ射线照射小鼠照射后60 d内小鼠外周血白细胞(WBC)、中性粒细胞(Neut)、血小板(Plt)和红细胞(RBC)数的影响;照射后2h和24h计数骨髓有核细胞数(BMNC)、流式细胞术分析造血干/祖细胞(LSK/LK)数量和观察多系骨髓细胞集落形成能力.结果显示,WR2721组的WBC和Neut在照射后4-18d、Plt数7-18 d、RBC数10-30 d均明显高于IR组(P＜0.05);照射后24 h BMNC、LSK和LK数均明显增加(P ＜0.05);2 h和24 h髓系祖细胞集落形成单位(CFU-GEMM)、粒系-巨噬系集落形成单位(CFU-GM)、巨核系集落形成单位(CFU-MK)、红系暴式集落形成单位(BFU-E)和红系集落形成单位(CFU-E)集落数均明显增加(P＜0.01).结论:WR2721能有效减轻急性放射病小鼠造血系统早期损伤,促进外周血细胞更早更快恢复.
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去卵巢大鼠骨密度变化与骨髓造血功能改变的关系
本研究探讨去卵巢大鼠不同时段骨密度的改变与骨髓造血功能改变的关系.探讨骨质疏松的发生与造血功能的关联.50只3月龄SD雌性大鼠随机分为去卵巢(OVX)组和假手术(Sham)组,分别在4周、8周、12周、16周和20周处死.取左侧股骨测量骨密度.右侧远端股骨干骺端松质骨甲醛固定,常规制片观察骨髓组织病理改变,集落形成实验观察造血干细胞集落形成能力,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清造血生成因子粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的浓度.结果表明,大鼠去卵巢4周还未出现明显的骨量丢失时,其骨髓组织即出现明显的脂肪组织容量增加,大鼠去卵巢8周、12周、16周和20周,与同时段假手术组比较股骨骨密度显著减低(P＜0.05),同时伴有骨髓造血组织容量减少,脂肪组织容量增高,巨核细胞数目减少,破骨细胞数目和肥大细胞数目显著增加,与假手术组比较均有显著性差异(P＜0.05).大鼠去卵巢16周后,造血干细胞形成粒-巨噬细胞集落能力明显低于假手术组.大鼠去卵巢12周后,GM-CSF水平明显低于假手术各组(P＜0.05).结论:去卵巢大鼠骨密度减低的同时存在骨髓造血功能的减低,3月龄SD雌性大鼠去卵巢可以作为造血功能减低的动物模型,有助于临床上诸多造血功能减低的研究.
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IFN-γ在小鼠造血调节中的作用
本研究旨在探讨IFN-γ在小鼠骨髓造血调节中的作用及其作用机制.通过RT-PCR方法扩增小鼠IFN-γ(mIFN-γ)片段,构建mIFN-γ慢病毒表达载体pCDH1-mIFN-γ-EF1-copGFP(pCDH-mIFN-γ-GFP).将pCDH-mIFN-γ-GFP和pCDH1-EF1-copGFP (pCDH-GFP)分别与辅助质粒pPACK-A、pPACK-B、pPACK-C组合,通过磷酸钙沉淀法转染293T细胞,制备慢病毒.通过慢病毒将mIFN-γ和GFP转导至C57BL/6J雄性小鼠的骨髓单个核细胞,接种于M3434甲基纤维素完全培养基进行集落形成试验,同时将其通过尾静脉注射给致死剂量照射的受体C57BL/6J小鼠体内,定期进行血常规检查.结果显示,成功构建pCDH-mIFN-γ-GFP慢病毒载体;转导mIFN-γ的293T细胞分泌mIFN-γ蛋白;转导mIFN-γ的小鼠骨髓单个核细胞集落生成数量较对照组显著减少,集落形成能力下降;mIFN-γ组的骨髓移植小鼠血象恢复较GFP对照组延迟,移植后8周流式细胞术检测外周血仍可见GFP阳性细胞.结论:mIFN-γ降低了造血干/祖细胞的增殖能力,延缓骨髓移植小鼠的造血恢复时间.
| 年 | 期数 |
| 2019 | 01 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 |
| 2000 | 01 02 03 04 |
