中国实验血液学杂志
Journal of Experimental Hematology 중국실험혈액학잡지
- 主管单位: 实验血液学杂志
- 主办单位: 中国科学技术协会
- 影响因子: 0.98
- 审稿时间: 1-3个月
- 国际刊号: 11-4423/R
- 国内刊号: 陈潮
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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SNP芯片技术在恶性血液病中的应用
单核苷酸多态性(SNP)是由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性,被称为第三代遗传标记.基于该标记的SNP芯片技术可在全基因组水平检测易感基因,在疾病研究领域中的应用方兴未艾.SNP芯片是一种简便可靠、敏感、高效的扫描技术,该方法为多基因位点的关联分析提供了有力的技术支持,具备十分广阔的应用前景.恶性血液病包括多种疾病,其近年来发病率逐年增高,究其根本原因是多基因关联作用的结果.本文就SNP芯片技术对全基因组的扫描方法,以及该技术在部分恶性血液病(白血病、恶性淋巴瘤、青少年单核-粒细胞白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤等)发病机理、临床表现、治疗效果及预后判断中的应用作一综述.
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Mcl-1基因与血液系统肿瘤关系的研究进展
髓样细胞白血病-1(myeloid cell leukelia-1,MCL-1)基因属于Bcl-2家族成员,是高度可调节的分化早期活化基因,在细胞的凋亡调节和肿瘤的发生发展过程中起重要作用.本文就mcl-1基因及产物的特点,基因的表达的调控机制以及它与不同血液肿瘤的关系的研究进展作一综述.
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急性移植物抗宿主病发生过程中供者T细胞迁移和归巢的机制
供者T细胞向次级淋巴器官的迁移以及活化的供者T细胞向急性移植物抗宿主病(aGVHD)靶器官的迁移归巢是aGVHD发生的关键环节之一,深入认识供者T细胞的归巢机制对aGVHD的防治具有重要意义.本文就供者T细胞向次级淋巴器官的迁移,活化的供者T细胞向aGVHD靶器官的归巢,供者调节性T细胞向aGVHD靶器官的归巢和aGVHD过程中T细胞迁移归巢机制及其研究前景等进行了综述.
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ABCG2与恶性血液病耐药相关性的研究进展
ABCG2作为一种跨膜半转运蛋白,参与了内源及外源有害物质的外排,对机体正常组织起到了保护作用,但同时也介导了对多种化疗药物的外排,引起多药耐药,使许多恶性肿瘤患者对化学药物治疗不敏感,直接影响到临床预后.本文将对ABCG2基因的单核苷酸多态性(SNP)、ABCG2与干细胞和酪氨酸激酶抑制剂(TKI)之间的关系的一些研究进展做简要介绍,同时还对ABCG2与恶性血液病耐药相关性的临床研究结果做回顾性分析,从中可以看出目前研究中存在的问题及未来的研究方向.
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急性髓系白血病中MN1基因的研究进展
MN1基因编码转录共激活因子,在某些急性髓系白血病(AML)中高表述.MN1在正常核型AML患者中的高表达与预后差和生存时间短相关;在全部inv(16)AML中高表达,其高表达在非M3的AML中被认为与对维甲酸的耐药有关.本文就MN1基因的结构和作用机制、MN1-TEL与急性髓系白血病,MN1与正常核型AML,MN1与inv(16)AML,MN1与维甲酸耐药等作一综述.
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等位基因频率在鉴别模棱两可HLA基因型中的应用价值分析
本研究探讨采用等位基因频率直接鉴别模棱两可HLA基因型的应用价值.应用聚合酶链式反应(PCR)-测序分型方法(SBT)对658名汉族供者HLA-A、B、DRB1基因进行测序分型,并分别采用PCR-序列特异性引物法(SSP)和杂合性歧义引物分离法(HAPRs)对其中的模棱两可标本进行精确分型,进而利用等位基因频率计算真基因型的相对概率并与真实结果进行比对.结果表明:222个HLA-A,238个HLA-B和107个HLA-DRB1基因的模棱两可标本中,真基因型的相对概率高于95%的比例分别为99.5%(221/222)、95.8%(228/238)和97.7%(104/107);与PCR-SSP和HAPRs分型结果相比,3个基因座的吻合率分别为100%(222/222)、99.6%(237/238)和99.1%(106/107),仅有B*3501/5501和DRB1*1201/1504不同,其相对概率值分别为40.3%和2.1%.结论:在大规模供者HLA基因的PCR-SBT分型中,应用等位基因频率直接鉴别模棱两可基因型的方法不仅具有较高的准确率和可信度,而且更加经济、简便、快捷,但在移植前供、患者HLA基因的确认试验中必须慎重应用.
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新等位基因HLA-DRB1*1462的核苷酸序列分析
本研究验证一个新的HLA等位基因DRB1*1462的核苷酸序列.应用PCR-SSO和PCR-SSP基因分型技术对HLA分型,对怀疑是HLA新等位基因进行DNA测序.结果发现,该序列与已知的所有HLA-DRB1等位基因序列不一致,与HLA-DRB1*140101的序列差异仅表现在第2外显子区域中256位碱基发生了G->A的替换.导致相应的氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸.结论:该基因是HLA-DRB1位点的一个新等位基因,已经被WHOHLA命名委员会于2006年1月30日正式命名为HLA-DRB1*1462.
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哇巴因诱导白血病细胞增殖的信号通路研究
本研究通过检测哇巴因与特异性信号通路抑制剂联用对多种白血病细胞株生长的影响,探讨哇巴因诱导白血病细胞增殖及凋亡的信号传导途径.采用MTT法检测哇巴因与特异性信号通路抑制剂对多种白血病细胞株存活率的影响,用RT-PCR与Western blot检测白血病细胞株钠钾ATP酶α1亚单位表达水平的变化.结果显示:在低浓度的哇巴因(10 nmol/L)作用下,Jhhan和M07e细胞株存活率均呈上升趋势,细胞株中纳钾ATP酶α1亚单位表达升高,PP2、PD98059能不同程度地抑制哇巴因对白血病细胞株的促增殖作用.结论:钠钾ATP酶具有重要的信号传导功能,它能通过特异性结合哇巴因激活多种信号通路调节白血病细胞的生长.哇巴因对白血病细胞的促增殖效应与Src激酶、ERK1/2等信号通路活化有关.
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Bcl-6在K562细胞的表达及其在髓系分化诱导机制中的作用
本研究探讨诱导K562细胞分别向髓系不同细胞系分化时bcl-6表达的变化,并分析其机制.用Westernblot检测以十四烷酸佛波醇-13-乙酯(tetradecanoylphorbol 13-acetate,TPA)、羟基脲(hydooxyurea,Hu)及六甲基双乙酰胺(hexamethylene bisacetamide,HMBA)为诱导剂分别诱导K562细胞向巨核细胞系、红细胞系及巨噬细胞系分化时bcl-6表达变化,用PCR、克隆、直接DNA测序方法分析bcl-6基因5'调控区序列变异情况.结果表明,BCL-6蛋白仅在TA诱导K562细胞向巨核细胞系分化时表达上调,其5'调控区序列未发现有突变发生.结论:bcl-6可能是调控K562细胞向髓系不同细胞系分化的关键基因之一,在TPA诱导的K562细胞向巨核细胞分化过程中发挥重要作用,其表达上调不伴有调控区基因突变.
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双色双融合荧光原位杂交探针检测慢性髓系白血病Bcr/Abl基因重排的研究
本研究探讨双色双融合荧光原位杂交技术(DC-DF-FISH)在慢性髓系白血病(CML)中的应用价值,应用常规R-显带技术、DC-DF-FISH、RT-PCR技术检测41例CML患者的染色体核型及bcr/abl融合基因.结果表明,对于初诊CML的18例患者,R-显带显示Ph染色体阳性检出率为94.4%(17/18),DC-DF-FISH阳性检出率也为94.4%(17/18),对于治疗后CML的18例患者,R-显带显示14例有可分析分裂相,其中有11例存在Ph染色体,阳性检出率为78.6%(11/14);而用DC-DF-FISH检测治疗后患者的阳性率为94.4%(17/18);移植后的5例患者R-显带均未检出Ph染色体,而FISH检测出1例bcr/abl基因阳性,RT-PCR证实了FISH的检测结论,但在移植患者中,RT-PCR无阳性发现.结论:双色双融合荧光原位杂交技术具有高度的准确性、可靠性,是检测CML患者bcr/abl基因重排的可靠方法,适用于CML的诊断、疗效判定及微小残留病灶的检测.
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138例慢性髓系白血病衍生9号染色体缺失的研究
为研究慢性髓系白血病(CML)患者衍生9号染色体[der(9)]部分序列缺失情况,对138例CML患者的骨髓应用R显带技术进行核型分析,并应用bcr-abl1双色双融合DNA探针荧光原位杂交(FISH)检测der(9)部分序列缺失.结果表明,138例核型检查中Ph阳性126例(91.3%),其中典型Ph染色体易位122例;Ph阴性12例(8.7%).FISH检测发现23例(16.7%)der(9)缺失.典型Ph染色体易位122例中加例为典型Ph染色体易位,占典型Ph染色体易位患者的16.4%,变易Ph易位4例中3例为变异易位,占变异易位患者的75%.变异易位患者中的der(9)缺失发生率明显高于典型易位患者;其中慢性期20例,占慢性期的17.2%;急变期3例,占急变期的17.6%,慢性期与急变期患者der(9)缺失的发生率无显著性差异(P>0.05).结论:CML患者der(9)部分缺失的发生率为16.7%,FISH技术可有效检测der(9)缺失,der(9)缺失的发生率与CML的分期无相关性.
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急性髓系白血病NPM1基因突变的研究
本研究旨在探讨急性髓系白血病(AML)患者NPM1基因突变情况及临床特征.采用PCR扩增产物直接测序法检测33例AML患者NPM1基因第12外显子的突变情况,了解NPM1基因突变阳性患者的临床特征.结果显示:33例AML患者中共检出8例(24.2%)具有NPM1基因突变,其中M1 1例、M23例、M4 1例、MM5 3例.19例正常核型AML患者中7例(36.8%)发生NPM1基因突变,明显高于异常核型组(14例中1例,7.1%)(p<0.05).NPM1基因突变型患者骨髓原始细胞比例及外周血白细胞计数均高于野生型组(P值均<0.05).结论:NPM1基因第12外显子的突变多见于正常核型AML患者,突变患者骨髓原始细胞比例及外周血白细胞数量增多.
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Bmi-1沉默对K562细胞功能的影响
Bmi-1是一种转录抑制子,属于Polycomb家族成员之一.Bmi-1基因在调控正常或白血病干细胞的自我更新中起着至关重要的作用.缺乏Bmi-1表达的急性髓系白血病细胞遭遇了增殖阻止和表现了分化和凋亡的征兆,这些发现导致有人提议和认为Bmi-1在白血病治疗中可作为潜在靶点.本研究探讨靶向针对Bmi-1的短发夹RNA(shRNA)对人慢性髓系白血病K562细胞功能的影响.采用RNA干扰技术,构建靶向针对Bmi-1的shRNA真核表达载体,利用脂质体lipofactamine 2000将shRNA真核表达载体转染入K562细胞中,经G418(400 μg/ml)筛选得到抗性克隆.用PCR和Western blot分别检测转染shRNA后K562细胞中Bmi-1的mRNA和蛋白水平的变化;以MTT法检测干扰组、对照组和未转染组细胞间的增殖情况;以集落形成实验测定3组间集落形成能力.结果表明:在设计的4个shRNA片段中,有1个片段显示显著的抑制效果.该shRNA转染K562细胞后,在mRNA水平上Bmi-1的表达明显下调,Western blot在蛋白水平上也证实了Bmi-1表达显著下调.MTT法和集落形成实验显示了干扰组、时照组和未转染组细胞3者间的增殖能力没有显著差异.结论:抑制Bmi-1的表达并不能减少K562细胞的增殖,这提示了可能存在其它一些平行的信号通路在细胞转化中起重要作用,而且可能独立于Bmi-1的过表达.Bmi-1在慢性髓系白血病的转化中起着次要的作用.
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急性髓系白血病初诊患者β-连环蛋白和周期蛋白D1 mRNA的表达及其意义
本研究旨在检测急性髓系白血病(AML)患者β-连环蛋白(beta-catenin)及周期蛋白D1(cyclin D1)mR-NA的表达变化,分析其相关性,为探讨Wnt/β联蛋白(Wnt/beta-catenin)通路在AML发病机制中的作用提供理论依据.采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测beta-catenin及cyclin D1 mRNA的相对表达水平,分析两者在AML不同亚型及良性血液病患者中的表达变化及相关性.结果表明,AML骨髓单个核细胞(BMMNC)中beta-cateninmRNA的表达水平明显高于良性血液病患者(p<0.05),但在AML各亚型之间其表达量无统计学差异(p>0.05,在AML中存在cyclin D1 mRNA的过度表达,其表达水平明显高于良性血液病组(p<0.05),在各亚型间其表达量无统计学差异(p>0.05).Beta-catenin与cycHn D1的表达水平在AML-M1、M2、M4中存在显著正相关性(r值分别为0.822,0.627,0.712,P值分别为0.001,0.020,0.002).结论:在AML患者中存在beta-catenin及cyclin D1的过度表达,且在部分亚型中存在显著相关性;Wnt/beta-catenin通路在AML中被异常激活,很可能是通过该通路下游靶基因cyclin D1的激活,参与白血病细胞的周期紊乱和异常增殖的调节.
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221例急性早幼粒细胞白血病免疫表型特点与微小残留病检测及基因标志的关系
本研究探讨急性早幼粒细胞白血病(APL)患者的免疫表型特点与微小残留病(MRD)检测及基因标志之间的关系.采用四色流式细胞术(FCM)分析了221例初诊APL患者的免疫表型,其中87例加做CD123抗体,196例同时运用PCR检测特异融合基因pml-rerα.结果发现:初诊APL患者中CD123、CD33和CD9的阳性表达率分别为100%、99.1%和96.0%,阳性患者中平均阳性细胞比例均在90%左右:虽然CD117、CD13、CD38及CD64的阳性表达率均高于96%,但阳性患者中阳性细胞比例分布不一致,平均阳性细胞比例在70%左右;部分患者表达CD15、CD56和CD11b,多数患者不表达CD34和HLA-DR,阳性患者中阳性细胞的平均比例均较低.196例初诊APL患者中,pml-rarα基因的不同转录本bcr1、bcr2和bcr3所占比例分别为63.3%、4.6%和32.1%.bcr3型基因与CD34的阳性表达相关,以20%为界时bcr3和bcr1型中CD34+患者的比例分别为15.4%(10/65)和3.3%(4/121)(P<0.05);以10%为阳性界限,bcr3和bcr1型中CD34+患者的比例分别为47.7%(31/65)和5.8%(7/121)(p<0.001);其余抗原的表达无明显区别.APL细胞中CD34为阳性且表现为非高侧向角(NL-SSC)时高度提示基因为bcr3型.结论:APL患者的免疫表型具有独特特征,CD123、CD33和CD9更适用于APL的MRD检测,CD34的阳性表达、NL-SSC与bcr3基因亚型相关,CD34的阳性界限设为10%更能提示基因类型与抗原表达的关系.
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线粒体途径在慢性髓系白血病信号转导中的作用
本研究旨在探讨线粒体途径在慢性髓系白血病(CML)信号转导中的作用.用脂质体转染法将bcr3/abl2反义寡核苷酸(ASO)导入CML细胞系K562细胞中;用MTT法检测bcr3/abl2 ASO对K562细胞活力的影响;流式细胞术(FCM)分析测定细胞凋亡率;荧光染料罗丹明123染色分析细胞线粒体跨膜电位(△ψm)的变化;Westernblot检测线粒体凋亡信号转导通路相关蛋白细胞色素C(CytC)的表达.结果表明,2 μmol/L bcr3/abl2 ASO与K562细胞作用24小时后,可明显抑制K562细胞活力,其抑制率为65.7%;可诱导细胞凋亡,凋亡率为16.9%;可下调K562细胞线粒体△ψm,有38.33%的细胞出现线粒体△ψm下降;可增强Cyt C的表达,激光光度扫描仪测得其表达光密度值由2.33±0.3升高到4.78±0.1.结论:线粒体途径通过介导凋亡信号而在CML信号转导中发挥重要作用.
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CD7阳性急性髓系白血病骨髓干/祖细胞5个基因表达的研究
本研究探讨abca5、mdr-1、kdr、dapk和irf-1 5个基因在CD7+性髓细胞性白血病干/祖细胞的表达.利用实时定量RT-PCR(RQ-PCR)方法检测了15例正常骨髓(NBM)和16例AML患者骨髓单个核细胞(MNC)中5个基因的表达.采用流式细胞仪(FCM)分选8例NBM和21例AML患者骨髓CD34+CD38+祖细胞和CD34+CD38-干细胞,利用微量细胞RQ-PCR方法检测分选细胞中5个基因的表达.结果表明:NBM MNC均表达这5个基因.其中irf-1与dapk表达水平高,相对表达量分别为4.08和3.86;abca5和mdr-1表述水平较低,为0.49和0.84;kdr表达低为0.02.在经分选的CD34+CD38+祖细胞中,dapk和irf-1表达明显减低(P<0.05),kdr表达明显增加(p<0.05),其余2个基因无明显变化.在CD34+CD38-Lin-干细胞中,5个基因的表达均高于CD34+CD38+祖细胞,普遍增加至近2倍,而kdr增加了3倍,其中kdr和irf-1表达的增加具有统计学差异(P<0.05).与NBM相比,AMLMNC中5个基因的表达水平均有不同程度减低,以abca5、mdr-1、kdr和dapk为显著(P<0.05).与AMLMNC相比,AML CD34+CD38+细胞中,irf-1和dapk表达明显减低(P<0.05),其余3个基因表达增加,以kdr表达增加有统计学意义(P<0.05).AML CD34+CD38+与CD34+CD38-细胞比较,发现5个基因在CD34+CD38+细胞中的表达均增加,尤以kdr和irf-1的表达增加有意义(P<0.05).AML CD34+CD38-CD7+细胞与CD34+CD38-CD7-细胞中5个基因的表达均比CD34+CD38+细胞中的高,其中只有CD34+CD38-CD7+细胞中KDR和CD34+CD38-CD7-细胞中KDR和irf-1的表达增加并具有统计学差异(p<0.05).结论:NBM中kdr主要表达在干/祖细胞中,而dapk和irf-1主要表达在较分化的细胞中.5个基因在干细胞阶段的表达均高于祖细胞阶段.AM CD34+CD38-CD7+细胞与CD34+CD38+CD7-都具有干/祖细胞的基因表达特点.
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三色流式细胞术分析急性淋巴细胞白血病免疫分型
本研究探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)各亚型免疫分型的特点及其临床意义.利用CD45/SSC双参数散点图设门方法,对40例ALL进行三色流式细胞术免疫表型分析.结果显示:采用CD45/SSC双参数散点图设门法能清楚地区分骨髓或外周血中的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、有核红细胞和原始细胞群.40例ALL中B-ALL26例,T-ALL 11例,HAL 3例.26例B-ALL中CD19全部(100%)阳性表达,而11例T-ALL中CD7表达的阳性率高(100%).伴髓系抗原表达的ALL(My+ALL)比较常见,本实验中共有12例,约达到30.0%,经常累及B淋巴系统(占My+ALL的75.0%);在髓系抗原中以CD13表达阳性率高;有3例患者为急性杂合性白血病(HAL),发病率为7.5%,且全部为髓系、B系共同表达,其中有2例患者CD34阳性表达,占66.67%.结论:在流式细胞仪上采用CD45/SSC双参数散点图设门方法进行三色流式细胞术分析,能排除正常细胞的干扰,使免疫分型的结果更为准确、可靠.
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急性髓系白血病患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族表达及克隆性增殖分析
本研究探讨AML患者在初发、治疗缓解后、复发等不同疾病状态下外周血T细胞TCR Vβ亚家族表达及T细胞克隆性增殖的情况,分析不同白血病细胞负荷对患者外周血T淋巴细胞数量及功能,尤其是对抗白血病功能的影响.应用RT-PCR扩增11例AML白血病患者不同疾病状态下及3名正常供者外周血的TCRBV24个家族的基因序列,通过基因扫描(genescan)的方法判断TCRBV家族的克隆表达、CDR3克隆性质,比较不同疾病状态下白血病患者外周血T细胞的Vβ亚家族的应用、克隆性增殖、T细胞的复杂性以及T细胞免疫袁型的变化.结果表明:11例AML白血病患者初诊时外周血T细胞均表达部分TCR Vβ亚家族,经体外诱导后TCR Vβ亚家族表达增加;完全缓解期患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族数量明显增多,但未达到完全正常;4例患者在复发时TCR Vβ亚家族表达数量明显下降;11例患者中有9例在初诊时外周血有1至2个TCR Vβ亚家族T细胞克隆性增殖,缓解期克隆性增殖的Vβ亚家族T细胞有增加趋势,在多数病例观察到部分Vβ亚家族T细胞在初发、缓解、体外诱导扩增以及复发时仍维持克隆性增殖状态;AML白血病患者初发及复发时T细胞CDR3复杂性明显降低,呈偏态分布,而疾病缓解时T细胞复杂性有所改善.结论:AML白血病患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族呈限制性表达;在大多数病例中无论是疾病初发抑或缓解及体外诱导、甚至在疾病复发时均可观察到克隆性T细胞的存在;在部分病例中某些Vβ亚家族在上述不同痰病状态下始终维持克隆性增殖状态,部分Vβ亚家族的克隆性增殖同白血病细胞的存在相关;在疾病状态下,AML白血病患者外周血T细胞的复杂性有所降低,而疾病缓解后可部分恢复.
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致敏的脐血源树突状细胞诱导CTL特异杀伤白血病细胞的实验研究
探讨脐血单个核细胞(MNC)诱导的树突状细胞(DC)通过负载冻融的HL-60、K562细胞抗原体外诱导产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HL-60、K562的杀伤作用.取脐血12份,分离MNC.在MNC中加入细胞因子GM-CSF(granulocyte monocyte colony-stimulating factor)、IL-3(interleukin 3)、SCF(stem cell factor)和EPO培养4周.使用CD83、CD1a、CD11c和CDw123单克隆抗体、流式细胞仪测定培养前后脐血DC抗原变化及扩增情况.DC通过负载HL-60、K562白血病细胞抗原致敏T淋巴细胞产生CTL.3H-TdR掺入试验测定DC免疫刺激活性,MTT法观察CTL对HL-60、K562细胞的特异性杀伤活性.结果表明:新鲜脐血CD1a+、CD11c+、CD83+、CDw123+细胞数分别为0.27×105/ml、5.87×105/ml、1.94×105/ml、2.73×105/ml.加入上述细胞因子培养的脐血MNC分化为CD1a+、CD11c+、CD83+、CDw123+DC,经培养2-4周,DC数明显增多,分别达11.02×105/ml、28.24×105/ml、10.57×105/ml、18.7×105/ml,此后逐渐减少.细胞因子诱导脐血DC具有免疫刺激活性,且DC与CBMNC细胞比例为1:40时的刺激活性佳.冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC诱导的CTL对HL-60、K562细胞的杀伤率分别为(42.04±8.46)%和(31.25±11.07)%,与实验组比较有显著性差异(P<0.01).结论:加入细胞因子GM-CSF、IL-3、SCF和EPO培养2-4周的脐血MNC可分化为CD1a+、CD11c+、CD83+、CDw123+DC.冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC,其诱导的CTL对HL-60、K562细胞具有特异的杀伤作用.脐血DC作为抗原呈递细胞在肿瘤免疫治疗上将起到重要作用.
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急性白血病患者非血缘脐血干细胞移植后NK细胞及其表面受体的早期重建
本研究探讨非血缘脐血移植(unrelated cord blood stem cell transplantation,UCBT)后早期NK细胞及其表面受体重建的特点和规律及其对临床的重要性.对11例接受UCBT的急性白血病患者使用流式细胞术分别检测UCBT后受者早期(植活后90天内)NK细胞及其表面受体的重建以及T细胞和B细胞的免疫重建情况.结果表明:UCBT后NK细胞重建较早,植活时外周血中NK细胞数即高于正常水平;植活后30天达峰值,60天时绝对值达峰值水平.NK表面活化性受体NKG2D的重建早,植活时即高表达,并逐步上升,约60天达峰值(82.55±9.10)%;NK细胞的另一种活化性受体NKp46也获得早期重建,至植活后90天仍维持在高水平.NK细胞抑制性受体NKG2A在UCBT后表达较活化性受体低并持续至移植后90天.UCBT后T细胞的重建较晚,表达水平低.结论:急性白血病患者UCBT后早期NK细胞的重建较早;NK细胞表面活化性受体特别是NKG2D的重建早于抑制性受体,提示NK细胞的活化可能在UCBT后早期移植物抗白血病(GVL)作用中承担了重要角色.
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藤黄酸对MUTZ-1细胞生长抑制作用及其机理研究
本研究旨在探讨藤黄酸时高危组骨髓增生异常综合征(MDS)细胞的生长抑制作用及其机制.以人MDS-RAEB细胞株MUTZ-1细胞为研究对象,采用MTT法测定增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期变化,用RT-PCR检测bax/bcl-2基因表达.结果表明,藤黄酸对MUTZ-1细胞有生长抑制作用,在0.2-0.8μg/ml浓度范围内随着药物浓度的增加MUTZ-1细胞的增殖抑制率增高;流式细胞学检测发现,藤黄酸浓度0、0.4、0.6、0.8μg/na引起的MUTZ-1凋亡率分别为(5±0.5)%、(13±0.5)%、(37±0.7)%和(56±0.6)%,而且凋亡率随着药物浓度增加而增加(P<0.05).bcl-2基因表达程度随藤黄酸剂量增加而减弱,而bax mRNA表达无明显变化.结论:藤黄酸通过诱导MUTZ-1细胞凋亡、下调bcl-2基因表达而抑制该细胞生长,这可能是藤黄酸抗肿瘤的主要机制之一.
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细胞周期蛋白A1 mRNA在骨髓增生异常综合症中的表达及其临床意义
本研究探讨骨髓增生异常综合症(MDS)患者中细胞周期蛋白A1(cyclin A1)mRNA表达及其临床意义.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测56例骨髓增生异常综合症患者及10例正常人骨髓细胞中的cyclin A1表达及cdk2、p21cipl的mRNA表达.结果表明:MDS患者中cyclin A1的阳性率及mRNA表达水平(69.64%;0.964±1.879)均较正常人(0%;0.012±0.014)明显增高(p<0.01);在初治MDS患者中,MDS-RAEB组cyclinA1表达水平(1.895±1.769)明显高于MDS-RA组(0.629±1.583)(p<0.01);治疗后MDS患者的cyclin A1表达水平较治疗前明显降低(p<0.01).结论:MDS患者cyclin A1表达水平较正常人明显增高,其异常表达可能是影响MDS患者预后的指标之一.
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造血干细胞移植术后环孢菌素A诱发急性胰腺炎的临床分析
本文报道1例AML-M2a患者在造血干细胞移植中服用环孢素A(CsA)诱发急性胰腺炎并进行临床分析.1例49岁急性髓性白血病(AML-M2a)患者,在进行同胞HLA相合造血干细胞移植术后20天并发急性胰腺炎.预处理方案采用改良Bu/Cy方案,移植物抗宿主病(GVHD)预防包括环孢菌素A(CsA)、短程甲氨蝶呤(MTX)及抗胸腺细胞球蛋白(ATG).结果表明:尽管患者腹部CT及彩超检查均显示胰腺无异常,但临床及实验室检查均支持急性胰腺炎的诊断.经过全身支持治疗及CsA减量患者终得以缓解.结论:CsA是导致急性胰腺炎的可能诱因.
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流式细胞术在免疫相关性全血细胞减少症诊断中的临床意义
本研究探讨流式细胞术检测在诊断免疫相关性全血细胞减少症(immonorelated pancytopenia,IRP)的临床意义.50例全血细胞减少症患者入院后进行了血清铁蛋白(SF),叶酸(FA)及维生素B12浓度,免疫学检查,血小板抗体,乙肝六项,甲肝及丙肝抗体、溶血相关检查、骨髓涂片及染色体核型分析等常规检查.50例患者分为A组(未明确诊断组)和B组(明确诊断组),另设正常对照组(30名正常人).A组:22例拟诊为IRP.B组:28例恶性血液病患者,其中再生障碍性贫血7例、阵发性睡眠性血红蛋白尿2例、骨髓增生异常综合征10例、巨幼细胞性贫血9例.对照A组和B组均采用流式细胞术测定骨髓造血干/祖细胞、有核红细胞、髓细胞结合的自身抗体,同时检测外周血总B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞的比率.时正常对照组仅进行外周血总B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞的比率检测.结果表明:A组22例拟诊免疫相关性全血细胞减少症患者中20例骨髓自身抗体检测结果阳性,阳性率为90.90%.抗体结合类型以IgG型多见,其次为IgM型,IgA型较少;B组中2例骨髓自身抗体检测结果阳性,阳性率为7.14%.前者抗体检出率显著高于后者(p<0.01).A组外周血总B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞比例显著高于B组及正常对照组(P<0.01),后两组相比无显著差异(P>0.05).结论:利用流式细胞术进行骨髓造血细胞自身抗体及外周血总B淋巴细胞、CD5+B淋巴细胞的检测能为免疫相关性全血细胞减少症的诊断提供可靠的依据,为全血细胞减少症的鉴别诊断提供了更多的检测手段,而且还有利于制定更有效的治疗策略.
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含高三尖杉酯碱的预激方案诱导治疗高危MDS或MDS转化为AML的疗效及其与CAG、HA方案的比较
本研究旨在探讨高三尖杉酯碱(HHT)、阿糖胞苷(Ara-C)合并使用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的低强度化疗方案(CHG方案)对高危骨髓增生异常综合征(MDS)或MDS转化的急性髓细胞白血病(AML)的疗效.30例未接受过化疗的高危MDS或MDS转化的AML患者入选CHG方案组,HHT和Ara-C每天1 mg和25 mg分别静脉滴注,连续14天,G-CSF 300 μg每天1次皮下注射,于化疗前12小时开始,持续使用至化疗结束或外周血白细胞计数>20×109/L.使用本方案1疗程后若取得完全缓解(CR),则给予常规化疗方案巩固并强化.33例高危MDS患者和MDS转化的AML患者入选CAG方案组,阿克拉霉素(Acla)每天10 mg,连续8天,Ara-C每天25mg,连续14天,分别静脉滴注,G-CSF用法用量,同CHG方案.33例高危MDS和MDS转化的AML患者入选HA方案组,HHT每天2-3 mg,Ara-C每天100-150 mg,分别静脉滴注,连续7天.外周血白细胞计数<4×109/L时,给以G-CSF,白细胞计数>4×109/L时停用.结果表明:(1)CHG方案组1疗程后14例患者达到CR(46.67%),7例患者达到部分缓解(PR)(23.33%),总有效率为70%.CAG方案组1疗程后14例CR(42.4%),9例PR(27.3%),总有效率69.7%.HA方案组1疗程后11例CR(33.3%),3例PR(9.1%),总有效率42.4%.经统计学检验,CHG与CAG方案组比较P>0.05,CHG与HA方案组比较P<0.05.(2)30例接受CHG诱导的患者在治疗期间发生粒细胞缺乏的比例为40%(12例),平均持续时间8天,无治疗相关死亡发生.(3)14例经CHG方案1疗程取得CR病人,1人失访,其他9例复发.平均复发时间为8.2月;复发者再重复使用该方案未能取得再次缓解.(4)CHG方案组中14例CR患者中除1例失访外,6例仅接受HA/DA方案巩固及强化,已全部复发,平均CR持续时间6.1个月.另外7名患者除接受HA/DA方案外,还交替接受AA/TA/MA/IA等方案巩固及强化,平均CR时间已达10.6月,仍有4例处于持续缓解中.结论:CHG方案能取得较高的1疗程缓解率,与CAG方案相仿,高于HA方案.CHG方案骨髓抑制较轻,临床应用较安全.但取得CR后应加强巩固/强化治疗,避免早期复发.
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IDA-FLAG方案治疗复发难治的急性白血病
本研究探讨去甲氧柔红霉素(IDA)联合FLAG方案应用于复发难治急性白血病(AL)的疗效和不良反应.IDA+FLAG方案具体为:IDA 10-12 mg/(m2·d),第1~3天,氟达拉滨(Flu)30 mg/(m2·d)(50 mg/d),第1-5天,静脉滴注;阿糖胞苷(Ara-C)2 000 mg/(m2·d),第1-5天;粒细胞集落刺激因子(G-CSF)300 μg/d,皮下注射,第0-5天.4例AL患者,男性,年龄32-44岁,其中急性髓细胞白血病(AML)3例,急性淋巴细胞白血病(ALL)1例,均为中大剂量阿糖胞苷巩固后复发或FLAG诱导无效.结果显示:4例接受IDA+FLAG治疗方案1个疗程后均达到完全缓解(CR).1例进行异基因外周血干细胞移植(allo-PBSCT)后4个月后发生血栓性血小板减少性紫癜死亡,1例缓解后10个月再次复发,2例持续CR时间为3和4个月.化疗的不良反应主要有骨髓抑制和粒细胞缺乏所致的感染,未见心脏毒性反应及其它严重的非造血系统不良反应.结论:IDA联合FLAG治疗复发难治的AL有一定疗效,尤其对于接受中大剂量Ara-C为主的方案后而复发或无效的AL患者有较高的CR率;此外,患者对此治疗方案的毒副作用可以耐受,这为进一步治疗创造时机.
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丙戊酸钠逆转Kasumi-1白血病细胞株AML1-ETO融合蛋白转录抑制的作用
本研究探讨组蛋白脱乙酰化酶抑制剂(HDAC)丙戊酸钠(VPA)逆转Kasumi-1白血病细胞株AML1-ETO融合蛋白转录抑制机制的作用.Kasumi-1细胞经不同浓度VPA处理不同时间,采用半定量RT-PCR分析AML1-ETO、AML1及cyclin D2 mRNA水平的变化情况.结果表明:不同浓度VPA处理Kasumi-1不同时间,AML1-ETOmRNA水平无明显变化;1-3 mmol/L VPA处理Kasumi-1细胞3天时,与对照组比较,AML1 mRNA表达水平增高,呈现剂量依赖性,差别具有统计学意义.以3 mmol/L VPA处理Kasumi-1细胞,与对照组比较,3 mmol/L VPA组cyclin D2 mRNA表达水平降低;以不同浓度VPA处理Kasumi-1细胞3天,结果发现随着VPA药物浓度加大cyclinD2 mRNA表达水平降低,呈现剂量依赖性,差别具有统计学意义.结论:VPA能通过抑制HDAC的活性,消除AML1/ETO融合蛋白的转录抑制并增加and-1基因转录,下调aml-1靶基因cyclin D2 mRNA的表达.
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长春花碱诱导MOLT-4细胞产生M期细胞阻滞的初步研究
本研究探讨化疗药物M期阻滞剂长春花碱(vinblastine,VLS)对MOLT-4急性淋巴细胞白血病细胞株产生的生物学影响并分析其意义.0.05 μg/ml的VLS诱导MOLT-4细胞0-12小时产生M期细胞阻滞和/或细胞凋亡,流式细胞术检测DNA直方图和共聚焦显微镜观测细胞形态,采用阻滞增长率、阻滞效率、凋亡率及形态学指标分析阻滞前后的细胞周期分布、凋亡和细胞形态变化.结果表明,细胞阻滞可不伴随有凋亡率的显著增加;细胞阻滞的流式DNA直方图呈时间依赖的细胞周期分布动态改变,阻滞程度可量化;M期阻滞伴随有S期细胞堆栈;阻滞后细胞增殖率减低;M期阻滞细胞具有特征性细胞分裂的形态学特征.结论:长春花碱能单独诱导MOLT-4细胞M期阻滞,M期细胞阻滞的流式细胞检测和形态学特征的研究有助于进一步研究细胞阻滞与凋亡、检测点机制和抗癌新药开发提供参考.
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Ahi-1基因导入Jurkat细胞中表达及功能的研究
本研究目的是探讨Ahi-1基因及其编码蛋白在人T淋巴细胞白血痛Jurkat细胞中的表达、细胞内定位以及Ahi-1基因对Jurkat细胞生长的调控作用.分别应用Northern blot、Wemtem blot检测Ahi-1基因的mRNA及蛋白表达水平.构建Ahi-1的真核表达质粒并导入Jurkat细胞,用G418筛选获得稳定过表达Ahi-1基因的Jurkat-A细胞,用XTT法检测细胞的增殖活性,半固体培养法检测细胞集落形成能力.结果表明:正常人外周血淋巴细胞(PBL)、Jurkat细胞以及HUT78细胞均表达6.5、4.2以及2 kb的Ahi-1基因mRNA转录本.PBL及Jurkat细胞均表达140 kD的Ahi-1蛋白且主要定位于细胞浆内,但在细胞核内未见表达.PBL尚表达120 kD的Ahi-1蛋白,主要存在于细胞核内,Jurkat细胞中120 kD的Ahi-1蛋白表达水平低下.甲异靛、阿糖胞苷(Ara-C)、高三尖杉酯碱(HHT)、甲氨喋呤(MTX)以及鬼臼乙叉甙(VPl6)可诱导Jurkat细胞核内140 kD的Ahi-1蛋白表达增强,甲异靛降低细胞浆内Ahi-1蛋白表达.与转染质粒对照Jurkat细胞(Jurkat-C)相比,高表达外源性Ahi-1的Jurkat-A细胞的生长及集落形成能力显著低于Jurkat-C细胞;细胞总c-myb蛋白表达水平无改变,但Jurkat-A细胞中磷酸化c-myb蛋白表达增强;细胞中AKT磷酸化水平无明显变化.结论:Jurkat细胞表达6.5、4.2以及2 kb的Ahi-1转录本;140kD的Ahi-1蛋白主要定位于细胞浆中,多种化疗药物可诱导细胞核内140 kD的Ahi-1蛋白表达增强;过表达外源性全长Ahi-1可抑制Jurkat细胞的生长及集落形成能力,并诱导c-myb蛋白磷酸化.
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人B7.1真核表达载体的构建、鉴定及其在白血病细胞上表达的实验研究
本研究构建包含人B7.1cDNA的重组真核表达戢体pDisplay-hB7.1并鉴定,实现其在白血病细胞株HL-60细胞上的表达,获得HL60-hB7.1.应用分子克隆、PCR法扩增人B7.1基因片段,采用ApaI、SalI分别双酶切PCR产物和表达载体pHook,纯化后的酶切产物由T4 DNA连接酶连接,转导大肠杆菌DH5α;应用Apal、SalI双酶切和DNA序列分析技术进一步鉴定阳性克隆pDisplay-hB7.1,应用脂质体转化技术将B7.1转染HL-60细胞,同一标本分别采用直接免疫荧光法、SABC法及FACS法鉴定hB7.1在HL-60细胞上的表达,阳性细胞命名为HL60一hB7.1.结果表明,PCR法扩增出约620 bp的基因片段;连接产物转导感受态细胞后,共筛选出5个阳性克隆,均可经ApaI、SalI双酶切出大小约620 bp的基因片段,与人B7.1基因片段大小相符,提示重组载体构建成功.进一步DNA序列分析证明人B7.1基因序列和读码框架正确,与文献报道人B7.1 cDNA序列一致,无基因突变.直接免疫荧光法鉴定表明,HL600-hB7.1阳性细胞数为70%,SABC法鉴定为65%,FACS法鉴定为92.7%.经以上鉴定证实hB7.1 cDNA已成功转染HL-60细胞株并在其膜上高效表达,获得了HL60-hB7.1.结论:应用分子克隆方法可成功构建人B7.1(CD80)重组真核表达载体,并稳定、高效表达B7.1-于HL-60细胞胞膜上,推测应用这种方案制备的瘤苗可能具有免疫治疗和免疫保护作用.
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基化PCR作为白血病微量残留病检测方法的探索
本实验研究探讨以甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)作为白血病微量残留病(MRD)检测方法的可行性.将Id4基因呈完全甲基化的HL-60细胞和Id4基因呈完全非甲基化的Hek937细胞按不同比例混合,实验分为3组:A组为10%HL-60+9%Hek937,B组为1%HL-60+99%Hek937,C组为0.1% HL-60+99.9%Hek937.用MS-PCR方法检测不同白血病细胞比例下Id4基因甲基化情况.结果表明,HL-60细胞仅有155 bp的Id4基因甲基化特异性扩增,呈Id4基因完全甲基化;Hek937细胞仅有156 bp的Id4基因非甲基化特异性扩增,呈Id4基因完全非甲基化.A、B、C组同时有155 bp的Id4基因甲基化和156 bp的Id4基因非甲基化特异性扩增,显示Id4基因甲基化表达.结论:MS-PCR方法可从0.1%比例含量的白血病细胞样本中检测到Id4基因甲基化,加之Id4基因甲基化在不同类型白血病中差异不明显,因此用MS-PCR检测Id4基因甲基化状态可以作为一种检测各种类型白血病微量残留病的方法.
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雷帕霉素对骨髓瘤细胞RPMI8226增殖、凋亡及趋化因子受体CXCR4表达的影响
本研究探讨雷帕霉素对骨髓瘤细胞系RPMI8226体外增殖、凋亡、细胞周期及对趋化因子受体CXCR4表达的影响.不同浓度雷帕霉素作用于RPMI8226细胞不同时间,应用MTT检测细胞的增殖,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,半定量PCR检测雷帕霉素干预RPMI8226后细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、CXCR4 mRNA表达,荧光定量PCR检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)mRNA表达的影响.结果表明:雷帕霉素对RPMI8226细胞有增殖抑制作用,细胞周期显示细胞阻滞于G0/G1期,G2/M期比例降低,cyclin D1、CXCR4和mTOR mRNA表达下调.结论:雷帕霉素呈时间-剂量依赖性抑制RPMI8226细胞增殖,诱导细胞凋亡,并通过下调mTOR及cyc-linD1表达,使细胞周期阻滞于G0/G1期,同时通过下调细胞CXCR4的表达,减少骨髓瘤细胞与基质细胞间的黏附及趋化作用达到抗肿瘤的效果.
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多发性骨髓瘤患者血管细胞间黏附分子VCAM-1的表达及其意义
本研究旨在观察多发性骨髓瘤患者血管细胞间黏附分子(VCAM-1)的表达,并分析其意义.采用RT-PCR方法检测23例多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞VCAM-1 mRNA水平的表达.结果显示:初治及复发/难治性多发性骨髓瘤患者黏附分子VCAM-1的表达较正常对照组及平台期患者明显升高,P<0.05,初发组与复发/难治组之间表达无显著差异(p>0.05).结论:多发性骨髓瘤患者黏附分子表达增加,其在骨髓瘤发病机制中起重要作用.
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慢病毒载体转染人骨髓间充质干细胞后其分化潜能的研究
本研究探讨携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体(lentiviral vector,LV)转染人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)后的分化能力.从骨髓中分离、培养MSC,通过携带EGFP标记的慢病毒载体体外转染人MSC,观测绿色荧光蛋白的表达情况.后,应用成脂诱导培养基(胰岛素、吲哚美辛、甘油-3-磷酸酰基转移酶IBMX、地塞米松)定向诱导分化已转染的MSC为脂肪细胞,苏丹黑染色观察诱导情况.结果表明,转染72小时后的MSC在荧光显微镜下显现弱荧光;经脂肪诱导培养基培养21天后在显微镜下可观察到细胞胞浆内形成高度折光性的脂滴,苏丹黑染色呈橘红色,且转染组与未转染组差异不大(P>0.05).结论:成功应用携带EGFP基因的慢病毒载体对MSC进行基因修饰,使转染后的MSC仍具有分化能力,能被诱导为脂肪细胞.MSC可作为基因治疗的一种靶向性细胞.
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急性髓系白血病和非白血病骨髓间充质干细胞生物学特性的比较
本研究旨在比较急性髓系白血病的间充质干细胞(MSC)、急性髓系白血病完全缓解后骨髓MSC以及非白血病的MSC的三者生物学特性.将骨髓MSC分为3组:白血病组、完全缓解组以及非白血病组.采用光学显微镜观察各组MSC的形态学特征,在原位瑞氏染色后计数各组CFU-F数,计数各组MSC的融合时间,绘制各组MSC的生长曲线,应用流式细胞仪检测各组MSC的免疫表型及细胞周期并计算DI值.结果发现,3组骨髓MSC的形态无差异;3组原代MSC的CFU-F数有差异(P=0.01),其中白血病组MSC的CFU-F少;3组原代MSC的融合时间有差异(p<0.01),其中白血病MSC组的融合时间长;在第3、5、7天对3组MSC(第2代)的细胞计数进行比较,结果无显著性差异(P>0.05);3组MSC(第二代)免疫表型检测显示CD105、CD106均为高表达,CD45表达阴性,3组间结果比较无差异(p值分别为0.37、0.50);各组MSC(第二代)的G0/G1期细胞比例分别为(89.9±4.0)%,(90.2±3.0)%,(91.0±3.0)%,3组比较未显示差异(p=0.79).3组MSC的DI值都在0.9-1.1范围之内.结论:在对白血病与非白血病的第二代MSC的生物学特性比较中,未发现有显著性差异.
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骨髓间充质干细胞移植对急性心肌梗死大鼠心功能的改善作用
本研究探讨大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC)移植时急性心肌梗死大鼠心功能的影响及其作用机制.体外培养rMSC并采用流式细胞术检测细胞免疫表型.开胸直视下结扎大鼠冠状动脉左前降支,制作急性心肌梗死模型.实验动物分为3组:假手术组(只开胸腔不结扎冠状动脉前降支)、AMI组(开胸结扎后注射无血清DF12培养液)及rMSC组(开胸结扎后注入Dil标记的rMSC).将rMSC移植至大鼠心肌梗死周边心肌组织内8周后,通过超声心动检查、生理多导仪检测各实验组大鼠左室射血分数(LVEF)、左室收缩末压(LVESP)、左室舒张末压(LV-EDP)、左室压力大上升或下降速率(+dp/dtmax,-dp/dtmax)等心功能指标;用免疫荧光共聚焦检测移植细胞的分化;免疫组织化学染色检测CD31抗原以了解梗死边缘区新生血管数量.结果显示:体外培养的rMSC表达CD90、CD44、CD105、CD54,不表达CD34、CD45、CD31.移植的rMSC在大鼠心肌组织内可分化为心肌样细胞;rMSC移植组大鼠梗死周边组织新生血管数量较对照组明显增多;移植组大鼠LVEF、LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax较对照组均明显升高,而LVEDP明显下降.结论:rMSC移植后在心肌组织中可分化为心肌样细胞,可能促进新生血管形成,改善心肌梗死动物的心功能.
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不同检测体系下骨髓源间充质干细胞迁移特征的比较
为研究不同检测体系下骨髓源间充质干细胞(MSC)迁移特征的差异,本研究利用Boyden chamber观察hSDF-1对MSC迁移的影响是否存在浓度依赖性;观察上述体系经50 nmol渥曼青霉素(wortmannin),10 μmol/LLY294002,50 μmol/L PD98059, 10 μmol/L U73122,126 μmol/L AMD3100以及50 nmol/L维拉帕米等处理MSC后对MSC迁移的影响.结果表明:MSC迁移能力随着hSDF-1α浓度的递增而逐渐增强,并且发现Wortmannin、LY294002、PD98059、U70312、AMD3100、Verapamil对MSC迁移均有影响,其中U73122、AMD3100对MSC迁移阻断的效应显著.结论:SDF-1/CXCR4所介导的MSC迁移可能与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)和蛋白激酶C(PKC)等信号途径有关.
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实时定量PCR法检测淋巴瘤患者Bcl-2/IgH融合基因及其临床意义
本研究目的是检测滤泡性淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤患者bcl-2/IgH融合基因的表达水平,以探讨其临床意义.以SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR方法检测20例患者外周血和(或)骨髓bcl-2/IgH融合基因的表达水平,并对其中4例患者bcl-2/IgH融合基因的表达水平进行动态监测.结果表明,在bcl-2/IgH融合基因阳性表达的病例中,骨髓和外周血bcl-2/IgH融合基因的相对拷贝数分别为4.23和2.73,统计学分析差异无显著性(p=0.107),而治疗前后融合基因的相对拷贝数均数分别为3.61和2.69,统计学分析差异有显著性(p=0.000),初诊及复发组的bcl-2/IgH融合基因表达水平明显高于缓解组(p=0.008),在4例患者的外周血bel-2/IgH融合基因动态监测结果中,1例患者在临床复发前3个月bcl-2/IgH融合基因表达水平明显上升.结论:bcl-2/IgH融合基因表达水平与患者的疾病状态有一定的相关性,初诊及复发患者融合基因的表达水平高,而缓解患者融合基因的表达水平低,治疗后融合基因表达水平较治疗前明显下降,bcl/IgH融合基因表达水平的变化可能与临床疾病进程有关,检测外周血是比较可行的.
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c-myc小干扰RNA诱导人髓系白血病细胞系HL-60细胞凋亡
本研究探讨c-myc小干扰RNA对白血病细胞系HL-60诱导凋亡的作用.将体外合成的siRNA转染HL-60细胞,观察形态学变化,应用MTT法绘制细胞生长曲线,用细胞集落培养观察c-myc siRNA对HL-60细胞增殖的影响;应用DNA片段化分析细胞的凋亡,RT-PCR及Western blot检测c-myc siRNA作用前后c-myc基因mRNA及蛋白表达水平的变化.结果表明:c-myc siRNA能明显抑制HL-60细胞增殖,半数抑制浓度(IC50)约为150nmol/L;DNA片段化的检出证实c-myc siRNA能有效诱导HL-60细胞调亡,凋亡率与药物作用时间呈正相关.c-myc siRNA与HL-60细胞作用后c-myc基因和蛋白的表达水平与作用时间呈负相关.结论:c-myc siRNA能有效抑制HL-60细胞增殖,降低c-myc基因和蛋白的表达,诱导其凋亡.
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沉默核干因子基因表达对HL-60白血病细胞凋亡的影响
本研究探讨靶向沉默白血病细胞的核干因子(nucleostemin,NS)基因对HL-60白血病细胞凋亡的影响.用T7启动子介导体外合成两条短发夹状干扰RNA(NS-shRNA),以其中沉默NS基因作用强的一条NS-shRNA转染HL-60细胞,同时以与NS基因序列无关小干扰RNA转染HL-60细胞作对照,应用RT-PCR检测被转染的HL-60细胞NS-mRNA抑制效果,倒置显微镜下观察活体细胞形态变化,Wright-Giemsa染色观察细胞胞体和细胞核形态学变化,以流式细胞仪(FCM)和TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)测定凋亡细胞数并计算凋亡阳性率.结果表明:HL-60细胞被NS-shRNA转染48小时后NS-mRNA阻断率达到74.94%,凋亡率分别为(25.32±3.06)%和(27.3±3.21)%,对照组仅(3.12±0.38)%和(3.30±1.52)%,转染组与对照组比较差异显著(P<0.01).Wright-Giemsa染色显示细胞发生核碎裂并出现"凋亡小体".结论:靶向沉默NS基因表述可诱发和促进HL-60白血病细胞发生凋亡,为NS基因作为恶性肿瘤治疗的候选靶基因奠定了理论基础.
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丁酸钠激活TRAIL通路诱导白血病细胞凋亡机制的研究
本研究旨在探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACI)丁酸钠诱导白血病细胞凋亡的机制.应用流式细胞术检测白血病细胞NB4、U937和Jurkat的凋亡情况,并应用Western blot和RT-PCR方法分别检测TRAIL及其受体DR4/DR5细胞表面蛋白及mRNA的变化情况.结果表明:经HDACI处理后,白血病细胞TRAIL和DR5蛋白及mRNA表达均随时间延长而增加,而DR4没有变化.结论:丁酸钠诱导白血病细胞凋亡的机制是与上调TRAIL及DR5 mRNA的转录及蛋白表达密切相关的,而DR4可能不参与该凋亡过程.
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P27Kipl和TGF-β1在原代APL细胞凋亡中作用机制的研究
本研究探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)对原代APL细胞凋亡及周期的影响,As2O2作用前后P27Kipl、TGF-β1、cyelin E和bcl-2的变化以及P27Kipl>在As2O3诱导急性早幼粒细胞白血病细胞凋亡中的作用.用细胞形态学及流式细胞仪分别检测原代APL细胞凋亡和细胞周期改变,免疫组织化学法和RT-PCR技术检测药物处理前后细胞P27Kipl、TGF-β1、cyclin E以及BCL-2蛋白和基因表达的变化.结果表明:As2O3与APL细胞共同培养24小时,浓度为1、5、10 μmol/L时,凋亡细胞所占比例分别为1.42%、4.57%、10.67%;至48小时,凋亡细胞分别为8.92%、16.07%和18.90%,明显高于相同浓度的As2O3作用24小时(P<0.05);至72小时,细胞以碎片为主.同一时段随着As2O3浓度的增加,APL细胞凋亡不断增多;同一浓度As2O3作用于APL细胞,随着作用时间的延长,APL细胞凋亡也随之增多.5、10 μmol/L的As2O3作用于APL细胞24、48、72小时可见细胞周期阻滞于G1期,G1期细胞比例均明显高于对照组(P<0.05),而1 μmol/L As2O3作用后的细胞周期无明显变化.1、5和10 μmol/LAs2O3作用于APL细胞.P27Kipl蛋白表达增高,P27KiplmRNA与β-actin灰度值之比(P27Kipl/β-actin)分别为0.181、0.489和0.921,表明随着As2O3浓度的增高,P27KiplmRNA表达水平显著上调(P<0.05),P27Kipl表达与凋亡细胞数之间存在正相关(r=0.55,P<0.05);与对照组相比,TGF-β1蛋白和mRNA表达上调,伴有Cyclin E、BCL-2蛋白和mRNA表达下调,TGF-β1表达与凋亡细胞数之间存在正相关(r=0.51,P<0.05),TGF-β1表达与P27Kipl表达之间也存在正相关(r=0.31,P<0.05).结论:As2O3体外可诱导原代APL细胞凋亡,存在时间-剂量依赖关系,并使细胞周期阻滞于G1期.P27Kipl表达的变化情况与As2O3诱导细胞凋亡的作用效果密切相关,As2O3诱导原代APL细胞凋亡的机制可能是通过上调TGF-β1,从而上调P27Kipl,拮抗Cyclin E和BCL-2的作用,抑制细胞增殖,使细胞周期阻滞于G1期,从而诱导细胞发生凋亡.
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2-甲氧基雌二醇对慢性髓系白血病K562细胞Caspase-3及Survivin表达的影响
本研究探讨2-甲氧基雌二醇(2-ME)对慢性髓系白血病(CML)K562细胞caspase-3和survivin表达的影响.实验分3组:对照组,培养基中不舍2-ME;实验组,分别用1、2、4、8及16 μmol/L的2-ME处理K562细胞;阴性对照组,培养液中以不含RNase的灭菌蒸馏水代替K562细胞.应用TUNEL、流式细胞术(FCM)、半定量RT-PCR分别检测K562细胞凋亡率、caspase-3及survivin蛋白及其基因表达水平.结果表明:2-ME在一定的浓度范围内呈剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡,与对照组比较差异均有统计学意义(p均<0.01),且TUNEL和FCM方法检测的K562细胞凋亡率呈正相关(γ=0.845,P=0.034).随着2-ME浓度增加,caspase-3蛋白表达量逐渐增加,而survivin蛋白表达量逐渐降低,两者与对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);且caspase-3与survivin蛋白表达量之间呈负相关(γ=-0.956,P-0.001).随着2-ME浓度增加,caspase-3基因表达量逐渐增加,而survivin基因表达量逐渐降低,两者与对照组比较差异均有统计学意义(p均<0.01),且caspase-3与survivin基因表达量之间呈负相关(γ=0.966,P=0.001).结论:2-ME能够以剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡,显示了其对CML有潜在的治疗价值.
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甲基化抑制剂5-aza-2'-deoxycytidine对K562细胞SHP-1基因表达及细胞增殖与凋亡的影响
本研究探讨5-氮杂胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-CdR)对K562细胞中抑癌基因SHP-1的转录调控作用及对K562细胞增殖凋亡的生物学影响,为寻找肿瘤治疗新靶点提供实验依据.采用MSP方法检测SHP-1基因甲基化状态,MTT法检测不同剂量(0.5,1,2 μmol/L)5-aza-CdR作用K562细胞1,3,5天时对K562细胞存活率的影响,流式细胞术(FCM)分析5-aza-CdR作用1,3,5天时细胞周期及凋亡率的变化,实时定量PCR(FQ-PCR)和Western blot方法检测5-aza-CdR处理前后SHP-1 mRNA及蛋白表达水平、P-STAT5蛋白表达变化.结果表明,K562细胞中存在SHP-1基因的甲基化,5-aza-CdR作用使K562细胞中SHP-1 mRNA和蛋白重新表达,而p-JAK2蛋白表达随之呈下降趋势;5-aza-CdR明显抑制K562细胞增殖,并与药物浓度及作用时间呈正相关.JAK2特异性抑制剂AG490明显抑制K562细胞增殖;5-aza-CdR可使K562细胞凋亡率增加,且作用也呈时间依赖性,用药1,3,5天细胞凋亡率分别为9.3%,24.2%,37.7%.2 μmol/L的5-aza-CAR处理24小时后,G0/G1期细胞逐渐增多,G2/M期细胞逐渐减少,细胞阻滞在G0/G1期.5-aza-CdR作用1,3,5天时G2/M期细胞比例分别为30.7%,23.4%,19.3%.结论:特异性甲基化转移酶抑制剂5-aza-CdR能使K562细胞中沉默的SHP-1基因重新表达,并可能通过JAK/STAT路径活化抑制白血病细胞增殖并诱导其凋亡.
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2-甲氧基雌二醇诱导K562细胞凋亡及机制研究
本研究探讨2.甲氧基雌二醇(2-ME2)对K562细胞的诱导凋亡作用及其机制.采用不同浓度2-ME2处理K562细胞,MTT法检测K562细胞的增殖活性,DNA琼脂糖凝胶电泳和AnnexinV/PI双染色法检测K562细胞的凋亡效应.流式细胞术检测细胞线粒体膜电位的变化,RT-PCR和Western blot方法分别检测相关基因mRNA和/或蛋白的表达变化.结果表明:2-ME2抑制K562细胞增殖呈时间和剂量依赖性;48小时的半数抑制浓度(IC50)为2μmol/L;2 μmol/L 2-ME2作用于K562细胞24、48、72小时,DNA凝胶电泳分析可见典型DNA梯形条带;AnnexinV/PI双染色法检测显示,细胞凋亡率分别为13.78%、22.32%和29.43%,而对照组凋亡率仅为1.78%(P<0.05);1、2和4 μmol/L 2-ME2分别处理K562细胞24小时,流式细胞术检测显示细胞线粒体膜电位下降;2 μmol/L2-ME2处理K562细胞24、48和72小时,K562细胞中bcr/abl、bcl-2 mRNA表达下调,而bax mRNA表达上调,Bcl-2、procaspase-3、procaspase-9、PARP(116 kD)和p-Akt蛋白表达下调,胞浆Cyto-C和PARP活性片段(85 kD)表达上调.而对总Akt蛋白表达无影响.结论:2-ME2通过升高bax/bcl-2比值降低线粒体膜电位、促使细胞色素C(Cyto-c)释放入胞浆、触发K562细胞的线粒体凋亡途径,活化caspase-3,导致K562细胞凋亡并抑制其增殖;通过下调bcr/abl mRNA表达以阻断PI3K/Akt信号通路也参与了该过程.
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阿霉素诱导Egr-1启动子调控的造血因子GM-CSF基因表达对荷瘤小鼠造血功能恢复的影响
本研究探讨阿霉素(ADM)诱导早期生长因子(Egr-1)启动子调控的造血因子基因表达对荷瘤小鼠化疗后造血功能恢复的作用.将构建的携带有Egr-1启动子的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)cDNA和增强型绿色荧光蛋白(FGFP)cDNA双顺反子真核表达载体导入基质细胞HFCL后,输入重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内.实验小鼠随机分4组:①ADM诱导的HFCL/EG组(HFCL/EG+ADM组),②ADM诱导的HFCL组(HFCL+ADM组),③单纯输注HFCL/EG组(HFCL/EG组)和④单纯输注HFCL组(HFCL组),每组6只动物.观察外周血象动态改变,用流式细胞术检测eGFP+人基质细胞,用RT-PCR和Western blot分别检测GM-CSF mRNA及其蛋白的表达.结果表明:化疗组与未化疗组相比外周血白细胞降低,而且下降幅度较低,恢复加快;各组间CFU-GM数无显著性差异;肿瘤抑制率与化疗相关,而与外源基因表达不相关;ADM处理后实验组小鼠骨髓可见绿色荧光阳性的基质细胞;RT-PCR和Western blot显示GM-CSF mRNA和GM-CSF蛋白表达增强.结论:ADM诱导的Egr-1启动子造血因子基因疗法具有化疗后促进造血恢复作用.
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SDF-1/CXCR4轴在人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖中的作用
本研究探讨基质细胞衍生因子(stromal cell derived factor-1,SDF-1)及其受体CXCR4在人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCBSCs)促进巨核细胞增殖中的作用.以巨核细胞系HEL细胞作为研究对象,实验分HEL/hUCBSC共培养组、HEL/骨髓基质细胞(human bone marrow stromal cells,hBMSCs)共培养组和HEL悬浮培养组.应用ELISA法检测hUCBSC和hBMSC培养上清SDF-1水平,应用激光共聚焦和流式细胞仪检测HEL细胞CXCR4蛋白表达,RT-PCR检测CXCR4 mRNA表达.结果表明:hUCBSC高分泌表达SDF-1,其分泌高峰在培养第8天,稍迟于hBMSCs.与hUCBSCs共培养的HEL细胞,流式细胞仪和激光共聚焦检测均显示其CXCR4蛋白的表达较弱(P<0.05),且可在部分HEL细胞胞浆中发现红色点状荧光.RT-PCR检测结果显示,不同培养条件下HEL细胞CXCR4 mRNA表达无显著性差异(P>0.05).结论:hUCBSC在分泌SDF-1和调控巨核细胞表达CXCR4方面起重要作用.
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SDF-1/CXCR4对脐血AC133+细胞趋化功能的影响
本研究探讨SDF1/CXCR4系统在脐血AC133+细胞趋化中的作用.用跨膜迁移实验(Transwell实验)确定SDF-1佳趋化浓度,采用双色直接免疫荧光标记法和流式细胞仪测定脐血AC133+细胞表面CXCR4表达水平,并评价SDF-1佳趋化浓度条件下细胞迁移率.结果发现,随着SDF-1浓度的增加,新鲜脐血AC133+细胞迁移率升高,但SDF-1浓度达到150 ng/ml时迁移率趋于平稳;当CXCR4阻断型抗体作用后,迁移率与未加SDF-1组无差异.重组人造血生长因子组合SCF、FL、TPO体外培养AC133+细胞时,在培养的早期趋化因子SDF-1受体CXCR4的表达升高,同时迁移率也升高,但随着培养时间的延长,CXCR4表达量渐渐降低,迁移率随之降低.结论:AC133+细胞趋化率与CXCR4表达量间存在相关性.
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高迁移率族蛋白B1对人脐血CD34+细胞迁移的影响
本研究探讨高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)对人脐血CD34+细胞迁移的影响及其机制.用流式细胞仪检测脐血CD34+细胞表面HMGB1受体:晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced gly-cation end products,RAGE)、Toll样受体2(Toll-like receptors 2,TLR2)及TLR4的表达.用磁珠分选法富集的新鲜人脐血CD34+细胞,经不同浓度的HMGB1(10、50、100、1000 ng/ml)刺激后,应用transwell小室趋化装置观察HMGB1对人脐血CD34+细胞的迁移活性,显微镜下计数,计算趋化指数,即试验孔与对照孔细胞数的比值.以未加HMGB1的培养细胞为时照组.结果表明:人脐血CD34+细胞经免疫磁珠分选富集的纯度达98%以上.HMGB1在一定的浓度范围内随浓度递增对人脐血CD34+细胞的迁移作用逐渐增强,当HMGB1浓度为100 ng/ml时迁移活性强,与对照组比较差异显著(P<0.01).抗-RAGE抗体可部分抑制HMGB1对脐血CD34+细胞的迁移作用.结论:一定浓度的HMGB1加强人脐血CD34+细胞迁移功能,此作用有可能通过RAGE介导.
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应用DNA测序技术检测血友病B患者FⅨ基因突变
为了研究3名中国汉族非亲缘系血友病B患者凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因突变的类型,常规检测患者血浆APTT及FⅨ:C,进行表型诊断;抽提患者外周血白细胞基因组DNA,应用PCR技术分8段扩增FⅨ基因外显子序列,用双脱氧终止法检测核酸序列.结果表明:与正常对照者相比,HB患者APTT测定值明显升高,FⅨ:C测定值明显降低,PT测定值正常.测序结果显示3例HB患者均有相应的基因序列改变,患者1有外显子6 G22119A点突变,患者2有外显子1 G7932C点突变,患者3有外显子T32685C点突变.结论:3例HB患者均检测到相应的基因序列改变,这为HB患者基因缺陷的分子机制提供了证据.
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特发性血小板减少性紫癜患者外周血共刺激分子的表达及与血小板抗体关系的临床研究
本研究检测特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者外周血共刺激分子CD80、CD86和CD137的表达及血清血小板抗体(PAIgG)含量并探讨二者相关性及与血小板数量等疾病表现的关系,以期阐明共刺激分子在特发性血小板减少性紫癜发病及病情判断中的作用.分别应用免疫荧光法和流式细胞术检测48例ITP患者及40名正常人外周血单个核细胞(PBMNC)表面共刺激分子CD80、CD86和CD137的表达;应用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清PAIgC含量.结果表明:ITP患者CD80、CD86和CD137的表达水平分别为(4.92±2.02)%,(8.68±4.25)%,(5.32±2.67)%,PAIgG平均含量为210±3.02 ng/107PA,均明显高于正常对照组(2.01±0.75)%,(4.56±2.06)%,(1.37±1.25)%和20±1.13 ng/107PA(p<0.01).共刺激分子表达水平与PAIgG含量呈正相关(r=0.302,P<0.05),与患者血小板数量呈负相关(r=-0.369,P<0.05).结论:共刺激分子CD80、CD86和CD137是参与ITP发病和免疫反应的重要共刺激分子,其过度表达与ITP发病及临床病情密切相关.纠正其异常表达、调节免疫状态可能是ITP的治疗策略之一,具有重要的临床研究意义.
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TNF-α对人脐静脉内皮细胞表达MCP-1及IL-8的影响
本研究探讨肿瘤坏死因子α-(TNF-α)刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后对细胞表达单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白介素-8(IL-8)的影响及其可能的分子机制.用RT-PCR的方法检测MCP-1和IL-8 mRNA的表达,免疫荧光染色法检测HUVEC核内转录因子κB(NF-κB p65)的激活.结果表明:TNF-α刺激HUVEC后,细胞内MCP-1和IL-8 mRNA的表达增强,且有时相性变化;IL-8 mRNA表达8小时达到高峰,MCP-1 mRNA表达12小时达到高峰.细胞核内NF-κB p65蛋白表达增强,在感染后0.5小时开始增加,1小时达峰值.然后,胞浆染色逐渐减弱,而核染色增强,表明转录因子NF-κB p65明显的核移位.结论:TNF-α刺激HUVEC后能增加细胞内MCP-1、IL-8 rnRNA和NF-κB p65蛋白质的表达,提示TNF-α可能通过NF-κB途径诱导血管内皮细胞MCP-1和IL-8等炎症介子的过度表达.
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异硫氰酸苯乙酯对K562/A02细胞阿霉素耐药影响的研究
本实验研究探讨异硫氰酸苯乙酯(phenylhexyl isothiocyanate,PHI)对K562/A02细胞的阿霉素(ADM)耐药性与敏感性的影响,并研究其可能的相关机制.运用MTT法分别检测阿霉毒素(ADM)以及PHI+ADM对K562/A02细胞的生长抑制率,计算其耐药倍数;用流式细胞仪检测PHI作用前后细胞的凋亡、细胞内ADM浓度的变化和MRP1蛋白变化;分光光度仪测定细胞内还原性谷胱目肽(GsH)的含量;RT-PCR半定量检测PHI作用前后MRP1 mRNA的水平.结果显示,随着PHI浓度的增加,细胞生存率降低;两药联合应用时K562/A02细胞凋亡率均增加;当PHI≥20 μmol/L时其耐药倍数有显著差异(p<0.05),两种细胞内ADM浓度增加亦有显著差异(p<0.05).单独运用1 μg/ml ADM时K562/A02细胞内的GSH含量下降5%,单独运用PHI时K562/A02细胞内的GSH含量随着PHI浓度的增加先是轻度升高尔后下降,GSH含量下降点约在10 μmol/L;当PHI≥20 μmol/L与1 μg/mlADM联合应用时,K562/A02细胞内的GSH含量随着PHI浓度的升高而进行性下降;而不同浓度的PHI的作用前后.两种细胞的MRP1的表达无论是蛋白水平还是基因水平都无显著差异(P>0.05).结论:PHI对K562/A02细胞的细胞毒作用与细胞内GSH耗竭无直接关系,PHI不但可以增强K562/A02细胞对ADM的敏感性,而且通过耗竭细胞内GSH部分地逆转K562/A02细胞对ADM的耐药.联合使用PHI可减少ADM的用量,从而降低其毒副作用.
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载有柔红霉素的磁性纳米Fe3O4提高裸鼠异种移植模型中多药耐药K562白血病细胞对化疗效果
肿瘤的多药耐药是肿瘤化疗失败的主要原因,由于载有柔红霉素的磁性纳米Fe3O4颗粒在体外显示了良好的耐药逆转效果,本实验研究了载有柔红霉素的磁性纳米Fe3O4颗粒在体内时白血病多药耐药逆转效果.将裸鼠高成瘤性白血病细胞株K562-n及其相应的多药耐药株K562-n/VCR分别接种于棵鼠的两侧腹股沟皮下,以建立人类白血病移植瘤模型;将双侧成瘤裸鼠随机分为5组,A组给予生理盐水,B组给予磁性纳米Fe3O4颗粒,C组给予柔红霉素,D组给予载有柔红霉素的磁性纳米Fe3O4颗粒,E组给予栽有柔红霉素的磁性纳米Fe3O4颗粒同时在肿瘤表面建立固定磁场.在实验开始后的第1,5,9,13,17,21天分别测量肿瘤体积.实验结束后,分离瘤组织并用RT-PCR.Western blot检测mdr-1的转录和表达.结果表明:D组、E组的K562-n/VCR肿瘤体积显著小于A、B、C 3个组(D或E组相时于A,B或C组p<0.05).病理检查显示:A组、B组肿瘤细胞生长良好,未见明显细胞坏死;C组肿瘤细胞有散在细胞坏死,部分细胞出现核固缩、核碎裂等;D、E组肿瘤组织内可见细胞明显破碎、坏死、组织的纤维化.D和E组的mdr-1的转录水平明显低于A、B、C 3个组,但是P-gp的表达在5个组中无差异.C组、D组、E组3个组K562-n肿瘤平均肿瘤体积显著小于的A、B两组的平均肿瘤体积(C、D或E组相对于A或B组p<0.05).A组、B组肿瘤细胞生长良好,未见明显细胞坏死;在C、D、E组肿瘤组织内可见细胞明显破碎、坏死、组织的纤维化.结论:载有柔红霉素的磁性纳米Fe3O4颗粒在体内具有明显的逆转多药耐药的作用,但是相对于单用柔红霉素,载有柔红霉素的磁性纳米Fe3O4颗粒在敏感的k562-n的肿瘤中并不能进一步提高疗效;本实验中外加磁场并未增加疗效.
年 | 期数 |
2019 | 01 |
2018 | 01 02 03 04 05 06 |
2017 | 01 02 03 04 05 06 |
2016 | 01 02 03 04 05 06 |
2015 | 01 02 03 04 05 06 |
2014 | 01 02 03 04 05 06 |
2013 | 01 02 03 04 05 06 |
2012 | 01 02 03 04 05 06 |
2011 | 01 02 03 04 05 06 |
2010 | 01 02 03 04 05 06 |
2009 | 01 02 03 04 05 06 |
2008 | 01 02 03 04 05 06 |
2007 | 01 02 03 04 05 06 |
2006 | 01 02 03 04 05 06 |
2005 | 01 02 03 04 05 06 |
2004 | 01 02 03 04 05 06 |
2003 | 01 02 03 04 05 06 |
2002 | 01 02 03 04 05 06 |
2001 | 01 02 03 04 |
2000 | 01 02 03 04 |