预冻温度和冻干机搁板温度对冷冻干燥红细胞的影响

为研究预冻温度和冷冻干燥机(冻干机)搁板温度对红细胞冻干保存后回收率的影响,采用主要成分为7%二甲亚砜和40%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的缓冲液作为保护液,在不同预冻温度或搁板温度下进行红细胞的冻干保存.首先将新鲜血液离心、洗涤和平衡以制备浓集红细胞,然后将浓集红细胞和保护液按1:3混匀制备红细胞悬液,在不同温度(-20,-35,-45,-80或-196℃)下预冻后移入冻干机(搁板温度设为-35℃,抽真空压力为200mbar)内进行真空干燥.为研究冻干机搁板温度对冻干红细胞的影响,将上述红细胞悬液先在-80℃下预冻后移入冻干机,在不同的搁板温度(-20,-25,-30,-35,-40或-45℃)下抽真空干燥,冻干结束后用37℃的再水化液快速水化.结果表明:在不同预冻温度下,冻干后红细胞和血红蛋白的回收率均在85%和75%以上,各组之间差异不显著.但-196℃组上清游离血红蛋白浓度显著高于其他各组(P<0.01);当搁板温度等于或高于-25℃时,样品无法冻干;当搁板温度等于或低于-30℃时,随着搁板温度的降低,冻干时间相应延长.再水化后红细胞和血红蛋白回收率均在90%以上,各组之间差异不显著;但当洗涤至等渗时,4组血红蛋白回收率之间差异不显著.结论:本冻干体系只有当预冻温度在-20℃至-80℃,冻干机的搁板温度等于或低于-30℃时冻干效果较好,同时预冻温度也不是越低越好.

生物素化HCV多抗原表位融合基因的克隆及可溶性表达

为了建立丙型肝炎病毒抗体(HCV-Ab)的双抗原夹心ELISA检测方法,克隆表达带有生物素标签的HCV多种抗原优势表位融合蛋白,选取HCV各抗原如Core,NS3,NS4,NS5和E的优势抗原表位片段编码序列,克隆重组为融合基因,插入PinpointTMXa-1 T栽体中诱导表达,并用Westem blot进行抗原性及标签生物素活性鉴定;表达抗原经Promega SoftLink Soft Release Avidin Resin系统亲和层析纯化后包被酶联板,用抗HCV单片段抗体阳性血清对表达融合蛋白各区的抗原性作间接ELISA法鉴定.结果显示:成功构建了带有生物素标签的HCV多抗原表位融合基因表达载体,该载体可在JM109(DE3)中可溶性表达目的蛋白,表达产物携带生物素标签,融合的各片段区均具有良好的抗原性.结论:所构建融合抗原可可溶性表达,可以用作双抗原夹心ELISA的酶标抗原,所含生物素标签也可用作酶联检测的生物素-亲和素信号放大系统.

可溶性HLA-I检测技术和贮存血中可溶性HLA-I的浓度变化观察

本研究建立可溶性人类白细胞抗原-Ⅰ类(sHLA-Ⅰ)检测方法,并探讨贮存血中sHLA-Ⅰ浓度变化的意义.采用ELISA双抗夹心法定量检测60例正常广东人血清中sHLA-Ⅰ水平和20例献血员成分血中sHLA-Ⅰ含量.结果表明:采用本技术时,可溶性HLA-Ⅰ低检测限为2.84 ng/ml,批内变异系数为5.80%,批间变异系数为9.00%,回收率≥98.57%,广东人sHLA-Ⅰ平均值为(699.54±360.10)ng/ml.贮存28天的RBC和随机供者血小板的sHLA-Ⅰ的浓度明显高于其它成分血,并且与成分血中残存的白细胞数和贮存时间有关.结论:用ELISA法检测可溶性HLA-Ⅰ灵敏、特异、稳定,在临床输血过程中可考虑选择性输注含有不同浓度可溶性HLA-Ⅰ的成分血.

川芎嗪对骨髓移植小鼠CD44表达的作用研究

为探讨川芎嗪对骨髓移植小鼠早期造血重建过程中黏附分子CD44表达水平的影响,将BALB/c小鼠随机分为3组:正常对照组,骨髓移植对照组(简称对照组)和骨髓移植+川芎嗪治疗组(简称川芎嗪组),对照组和川芎嗪组每天分别胃饲生理盐水和川芎嗪.于骨髓移植(BMT)后第7,14,21,28天处死小鼠,计数外周血细胞、骨髓有核细胞,分析骨髓中造血组织面积及成熟红细胞容量,用流式细胞术和免疫组织化学检测骨髓细胞上CD44的表达水平,并于第10天取小鼠脾脏,计数脾集落形成单位.结果显示,骨髓移植后第7,14,21,28天川芎嗪组外周血白细胞、血小板、骨髓有核细胞计数、骨髓中造血组织面积均显著高于移植对照组,外周血红细胞计数在第7,14,21天也较对照组为高;同时,川芎嗪组CFU-S计数明显高于同期移植对照组,骨髓中成熟红细胞容量则显著低于对照组,川芎嗪组CD44的表达在第7,14,21,28天明显高于对照组.结论:川芎嗪可提高骨髓移植小鼠骨髓细胞表面CD44的表达水平,促进造血干/祖细胞的归巢,加速移植后骨髓的造血重建.

多份脐血移植13例回顾性分析

为了探索成人多份脐血移植的可行性,对广州市脐血库1998年6月至2003年7月提供的13例非亲缘关系多份脐血移植进行回顾性分析.脐血均采自广州市妇婴医院正常分娩的足月顺产孕妇,脐血分离、冻存、复温方法参照纽约脐血库标准及相关文献;多份移植脐血HLA匹配为1/6-2/6位点不相合.结果表明:1998年6月至2003年7月,广州市脐血库向国内7家移植中心提供非亲缘关系脐血28份,治疗患者13例.受者中位年龄22(8-41)岁,中位体重50(21-75)公斤,28份脐血中TNC总输入量中位数为2.91×107/kg.13例中6例植入(中性粒细胞>5×108/L),植入率为46.1%,植入平均时间为19天.1例患者发生GVHD反应,1例患者发生自体恢复.生存率46.2%(6/13).结论:多份脐血移植具有良好的应用前景.

免疫毒素去除T细胞在异基因造血干细胞移植中的应用

观察应用免疫毒素部分去除T细胞(TCD)的方法进行人类白细胞抗原/混合淋巴细胞培养(HLA/MLC)不相合异基因造血干细胞移植的临床疗效.采用蓖麻免疫毒素部分去T细胞对13例恶性血液病患者行HLA/MLC配型不相合的造血干细胞移植,其中慢性髓性白血病(CP1)6例;急性淋巴细胞白血病CR11例,CR21例,复发1例;急性髓性白血病CR12例,CR21例;骨髓增生异常综合征转化成急性髓性白血病M4型(CR1)1例.结果表明:13例患者中8例成功植入,其中2例发生Ⅱ度急性移植物抗宿主病(aGVHD),2例发生Ⅲ-Ⅳ度aGVHD.随访8-90个月,2例发生Ⅲ-Ⅳ度aGVHD患者早期死亡,另有1例患者死于迟发感染,其余5例均无病存活至今.5例未植活的患者中4例回输同一供者外周血造血干细胞后3例未植入,1例植活,但死于移植相关合并症;1例再次行同基因造血干细胞移植成功并无病存活至今.结论:采用蓖麻免疫毒素部分去T细胞的方法行HLA/MLC配型不相合的异基因造血干细胞移植可减少重度aGVHD的发生,但移植早期排斥率(HVG)较高,临床应用效果有待进一步评估.

联合使用干细胞因子、FLT3配基与白介素2,7,15体外扩增人脐血来源CIK/NK细胞

通过干细胞因子(SCF)、FLT3配基(FL)联合白介素(IL)2,7,15等的不同组合体系体外扩增人脐血来源的CIK/NK细胞(CB-CIK/NK),探讨不同培养方式对CB-CIK/NK细胞诱导、扩增产率的影响.按诱导扩增体系的不同分3组:A组(SCF+IL2+IL7+IL15),B组(SCF+FL+IL2+IL7+IL15)和C组(IL2+IL7+IL15,对照组),培养21天,检测CD3+CD56+CIK细胞、CD3-CD56+NK细胞比例和扩增倍数.结果表明:经21天培养,A,B及C组CIK细胞比例分别为(19.84±2.93)%、(26.20±4.05)%及(24.03±4.99)%;而NK细胞的比例A、B及C组比例分别为(49.60±1.40)%、(51.16±6.45)%及(30.85±8.12)%.舍SCF+FL的B组扩增效率高,其中CIK细胞的扩增倍数由对照组(C组)的(575.81±221.72)倍增加至(796.09±278.47)倍(高为1 313倍);NK细胞由对照组(C组)的(30.39±14.47)倍增加至(65.85±30.83)倍(高为121.06倍).结论:通过合适的细胞因子组合可以同时扩增CB来源的CIK/NK细胞;联合诱导、扩增CB-CIK/NK细胞以采用含SCF+FL+IL2+IL7+IL15的培养体系为佳.

As2O3对KM3细胞端粒酶及其逆转录酶作用的研究

为了探讨三氧化二砷(As2O3)对多发性骨髓瘤(MM)细胞株KM3的作用及其可能机制,用台盼蓝拒染法检测细胞生长抑制率,用光镜、透射电镜观察形态变化,用DNA电泳观察As2O3诱导KM3细胞凋亡,用流式细胞仪检测细胞周期的变化,用TRAP-PCR-ELISA法检测As2O3作用KM3细胞后的端粒酶活性变化,并用半定量RTPCR法检测端粒酶逆转录酶(hTERT mRNA)的表达水平.结果表明:As2O3抑制KM3细胞的生长,具有诱导细胞凋亡的作用;As2O3阻滞细胞于G2期;As2O3可抑制KM3细胞的端粒酶活性和hTERT mRNA的表达,且hTERTmRNA下降趋势与端粒酶活性相一致.结论:端粒酶及其逆转录酶活性的下调可能在As2O3诱导KM3细胞凋亡的过程中起了重要作用.

美伐他汀对人多发性骨髓瘤细胞系U266体外增殖与凋亡的影响

为了探讨羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂对多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖与凋亡的调控作用及机制,应用MTT比色法、光镜形态学观察、流式细胞术、DNA凝胶电泳及RT-PCR研究了美伐他汀(mevastatin)对MM细胞系U266细胞体外增殖与凋亡的影响.结果显示,美伐他汀以剂量及时间依赖方式抑制U266细胞增殖;细胞周期分析显示美伐他汀诱导U266细胞G0-G1期阻滞,但对p27蛋白及mRNA的表达无影响:在美伐他汀作用下U266细胞出现核染色质凝聚、核固缩、核碎裂等凋亡形态改变,PI-AnnexinV+细胞增多,线粒体跨膜电位(△ψm)下降,DNA凝胶电泳出现梯形条带,bcl-2 mRNA表达下调.加入外源性甲羟戊酸(mevalonate,MVA)可完全逆转美伐他汀对U266细胞增殖与凋亡的效应.结论:美伐他汀可通过MVA途径,诱导G0-G1期阻滞抑制增殖、下调bcl-2表达及降低线粒体膜电位触发U266细胞凋亡.

激活Notch信号抑制多发性骨髓瘤细胞凋亡

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞的增殖及凋亡受骨髓造血微环境的调节.Notch信号是骨髓中细胞与细胞之间通讯的主要信号通路之一,它对多发性骨髓瘤细胞的调节作用目前并不清楚.本研究旨在阐明Notch信号对多发性骨髓瘤细胞凋亡的调节作用.利用RT-PCR分析多发性骨髓瘤细胞Notch信号分子的表达和采用逆转录病毒介导的基因转移方法将Notch-1胞内区(Intracellular domain of Notch,ICN)转入多发性骨髓瘤细胞株,以建立激活Notch信号的多发性骨髓瘤细胞系;采用台盼蓝拒染和TUNEL方法测定骨髓瘤细胞的死亡.结果表明:RT-PCR检测显示多发性骨髓瘤细胞表达Notch-1及相关分子,逆转录病毒可以介导外源Notch-ICN在骨髓瘤细胞中表达,激活Notch信号可以抑制二甲基鞘氨醇(N,N-dimethylsphingosine,DMS)诱导的多发性骨髓瘤细胞的凋亡.结论:Notch信号对多发性骨髓瘤细胞凋亡有抑制作用,这可能为多发性骨髓瘤的治疗提供新的靶点.

一种简单快速扩增和获取外周血γδT细胞的方法

本研究目的是建立一种简单快速的扩增人外周血γδT细胞的方法,以便用于γδT细胞的生物学特性和临床过继性免疫治疗的研究.取人外周血5-10 ml,分离获取单个核细胞,用结核杆菌低分子多肽抗原(MTb-Ag)刺激细胞增殖,通过荧光单克隆抗体TCRγδ-PE染色及流式细胞仪检测γδT细胞所占比例,用MTT试验检测细胞毒活性.结果表明:MTb-Ag能特异地刺激外周血单个核细胞中的γδT细胞增殖,γδT细胞可达69.2%,对K562细胞具有较高的杀伤活性.结论:本方法是一种简单、快速、特异的体外扩增和获取人外周血γδT细胞的方法.

脐血造血干细胞短期冻存效果的评价

为了探讨脐血造血干细胞在液氮中短期冻存复苏后的效果,分别将各自为8例冻存6个月、1年、2年的脐血干细胞进行复苏,观察造血干细胞活性.有核细胞(NC)计数采用自动血细胞分析仪测定,CD34+细胞采用流式细胞技术测定,用体外造血细胞培养技术分析粒-巨噬细胞集落生成单位(CFU-GM)产率,台盼蓝染色法判断造血细胞存活率.结果表明:脐血造血干细胞在液氮中冻存6个月、1年、2年后解冻,其有核细胞、CD34+细胞、细胞活率、CFU-GM产率在3个不同冻存时间的差异无显著性.结论:脐血干细胞于液氮中短期冻存,其干细胞数量和细胞活性没有明显的变化,冻存效果较好.

重组人G-CSF对放化疗引起乳腺癌患者白细胞减少症的疗效观察

为了观察国产粒细胞集落刺激因子rhG-CSF(粒生素)在放化疗中对白细胞减少症的治疗作用,对100例经病理证实的乳腺癌根治术后患者,随机分为观察组和对照组各50例,两组病人均于术后2周始行1个周期CAF方案化疗,然后放疗.观察组在化疗中加用粒生素75微克/天,皮下注射,连用5-7天,在放疗过程中针对不同程度的白细胞减少再应用3-5天.对照组在放化疗中不用粒生素.比较两组病人白细胞和中性粒细胞绝对数的动态变化.结果表明,观察组患者白细胞及中性粒细胞的低值均明显高于对照组,未见明显副作用.结论:粒生素对放化疗过程中白细胞减少的治疗效果确切,副作用不明显.

非亲缘HLA相合骨髓移植治疗一例骨髓增生异常综合征

为了探讨非亲缘HLA相合供者骨髓移植(UD-BMT)治疗骨髓增生异常综合征(MDS)的可行治疗方案和疗效,采用HLA配型相合的非亲缘骨髓移植治疗1例骨髓增生异常综合征-难治性血细胞减少伴多系病态造血(MDS-RCMD)男性患者,31岁.预处理方案为马利兰、环磷酰胺、阿糖胞苷、甲基环己亚硝脲和抗胸腺细胞球蛋白.以霉酚酸酯、环孢菌素A加短疗程的甲氨喋呤预防移植物抗宿主病(GVHD).结果显示,移植后10天中性粒细胞(0.5×109/L,20天血小板升至58×109/L,3个月血红蛋白升至114 g/L,无GVHD发生;移植后无病存活时间已达9个月.结论:非血缘HLA相舍骨髓移植治疗骨髓增生异常综合征是可行而且有效的.

基质细胞对体外扩增造血细胞造血重建活性的促进作用

本研究探讨骨髓单个核细胞(BMMNC)在不同的培养条件下扩增后是否具有造血重建的活性.在小鼠BMMNC液体培养体系中,分别在含有几种细胞因子组合和(或)基质细胞层存在的条件下进行体外扩增,然后将不同条件下扩增的细胞经尾静脉回输至经致死量照射的小鼠体内,动态观察小鼠的骨髓有核细胞数及各种祖细胞集落数,以观察其造血重建的效果.结果表明:单纯细胞因子介导BMMNC体外扩增后并不能增进这些细胞的造血重建功能,但含有骨髓基质细胞底层的体外扩增,无论是否加入细胞因子,均有明显的促进移植受体造血功能重建的作用.结论:骨髓基质细胞支持下体外扩增的造血细胞具有促进移植受者造血重建的功能,证实了在维持体外扩增造血细胞的移植活性中,基质细胞具有非常重要的作用.

小鼠骨髓内皮细胞条件培养液体外扩增胚胎及成体造血干/祖细胞的差异及其机制探讨

本研究比较小鼠骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)联合FL和TPO对卵黄囊和骨髓造血干/祖细胞体外生长的影响,并对其机制进行探讨.取卵黄囊和骨髓单细胞悬液,对照组中加入合10%FBS的DMEM,实验组分别加入10%mBMEC-CM,FL(5 ng/ml)和TPO(2 ng/ml),10%mBMEC-CM复合FL和TPO培养24小时后进行集落培养,计数CFU-GM和HPP-CFC的集落数.应用Atlas cDNA Expression Array对卵黄囊和骨髓造血细胞表达的细胞因子受体进行检测.结果表明:mBMEC-CM能扩增卵黄囊和骨髓CFU-GM和HPP-CFC,其与FL和TPO联合后扩增能力明显增强;mBMEC-CM扩增骨髓CFU-GM和HPP-CFC的能力明显强于其扩增卵黄囊CFU-GM和HPP-CFC的能力.检测到小鼠卵黄囊及骨髓造血细胞存在差异表达的细胞因子受体;卵黄囊造血细胞表达PDGF-Rβ,PDGF-Rα和促肾上腺皮质激素释放因子受体,而在骨髓造血细胞中未检测到上述受体的袁达;在骨髓造血细胞中表达的IFN-γR,GM-CSFR,多巴胺D2受体和卵泡刺激素受体则未在卵黄囊造血细胞中检测到mRNA的表达.结论:mBMEC-CM能支持卵黄囊和骨髓造血祖细胞的体外扩增,其与FL和TPO联合后扩增能力明显增强;mBMEC-CM对骨髓造血祖细胞表现出更强的扩增作用.检测到卵黄囊和骨髓造血细胞之间存在差异表达的细胞因子受体,提示mBMEC-CM对胚胎及成体造血细胞扩增中存在的差异可能与两种造血细胞存在差异表达的细胞因子受体有关.

VEGFA、VEGFC及其受体和angiopoietin-1/angiopoietin-2及其受体在人胚胎卵黄囊血岛、AGM区的表达

本研究观察VEGFA、VEGFC及其受体和angiopoietin-1、angiopoietin-2及其受体在发育第3-12周人胚胎卵黄囊血岛、主动脉-生殖腺-中肾(AGM)区的表达.在征得意外流产孕妇同意并签字后,收集其意外流产的受精龄第3-12周的人胚胎,用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片,HE和免疫组织化学染色,光镜观察.结果表明:第21-25天人胚卵黄囊血岛血管内皮细胞和造血细胞强表达VEGFA及其受体flt1和flk-1,VEGFC及其受体flt4,angiopoietin-2及其受体Tie-2蛋白;弱表达angiopoietin-1蛋白.背主动脉和中肾于发育第4周开始表达上述各种因子及其受体,免疫阳性反应物集中在大而圆、有核的造血细胞.阳性细胞的数量到第7周到达高峰.8周以后,阳性细胞数量显著减少,到12周几乎所有的血细胞为免疫阴性反应.生殖腺主要在第6-8周表达VEGFA,flt1,flt4,angiopoietin-1,angiopoietin-2和Tie-2蛋白,但不表达VEGFC和flk-1.在AGM区的血管内皮细胞未检测到上述各因子的表达.结论:人胚胎卵黄囊血岛造血细胞和内皮细胞以及背主动脉和中肾共表达多种与血管发生和血液发生相关的因子.人胚内造血发生于第4周.

人骨髓间充质干细胞与脐血单个核细胞对混合淋巴细胞反应及PHA诱导转化的抑制

为研究和比较人骨髓间充质干细胞(MSC)和脐血单个核细胞在体外的免疫调控能力,从人骨髓分离培养间充质干细胞,用Ficoll分离得到脐血单个核细胞,分别以不同剂量加入到外周血混合淋巴细胞培养体系和植物血凝素(PHA)刺激的外周血淋巴细胞转化体系中,用MTT还原法测定细胞增殖,分别观察MSC和脐血单个核细胞对混合淋巴细胞反应和淋巴细胞转化的影响.结果显示,5×104,1×104MSC以及2×105脐血单个核细胞均抑制混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞增殖,而<1×104MSC和<2×105脐血单个核细胞对混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用均不明显;5×104MSC对淋巴细胞增殖的抑制能力明显强于2×105脐血单个核细胞.结论:大剂量的骨髓间充质干细胞和脐血单个核细胞在体外对混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞转化均具有抑制作用,而且间充质干细胞的抑制能力强于脐血单个核细胞.

反义核酸基因治疗中电子计算机的辅助设计

本文概述了反义寡核苷酸作为基因治疗药物的状况,归纳了目前对妨碍反义寡核苷酸作为基因治疗药物取得快速进展的主要因素:反义寡核苷酸作为基因治疗药物的有效性;反义寡核苷酸作为基因治疗药物的毒副作用.从细胞和基因水平详细介绍目前对这些影响因素的分析:①反义寡核苷酸未能有效对靶基因的同源基因的鉴别是导致其毒副作用的主要原因.②靶基因的二、三级结构严重影响反义寡核苷酸达到靶位置.③影响反义寡核苷酸的传送和快速退火的问题.也介绍如何使用电子计算机方法对反义寡核苷酸的靶基因做全面分析,即对靶基因的二级结构和同源性分析,并终设计出反义寡核苷酸,达到降低反义寡核苷酸作为治疗药物的毒副作用,提高治疗的有效性的目的.后归纳出计算机辅助设计的方法.

树突状细胞肿瘤疫苗的制备及临床应用面临的问题

树突状细胞(DC)是目前发现的功能强的抗原呈递细胞,其在肿瘤免疫临床治疗中的应用受到越来越多的关注.目前,通过各种方法提取肿瘤抗原来冲击致敏DC,再将已培养成熟的DC回输到病人体内,以激发机体产生明确的抗肿瘤免疫应答,已成为有效的临床抗肿瘤治疗手段,也为肿瘤临床继手术切除、放化疗及其它综合治疗后又开辟了一个新的治疗途径.本文就DC的生物学特性、体外培养及其临床应用作一综述.

基因治疗的安全性、有效性和稳定性原则

以病毒和非病毒为载体的体细胞基因治疗是一种富有前景的治疗人类疾病的方法.它已从初步的动物实验发展至临床试验.基因治疗应用的载体和靶基因主要集中于非病毒载体、病毒载体和单个靶基因或单基因.每个载体系统有其优点和缺陷.然而,当前人类疾病基因治疗应用的限制主要是转基因方法的潜在风险、相对低效率和靶基因的胞内稳定性.因此,安全性、有效性和稳定性是人们常常遇到的基因治疗的三个问题,也是人们应遵守的基因治疗的三个原则.

提高腺病毒载体转染造血细胞效率的研究进展

重组腺病毒作为基因转移的载体已经广泛应用于基因治疗的基础研究和临床试验,但造血细胞由于缺乏腺病毒特异性受体柯萨奇-腺病毒受体(coxsacke virus and adenovirus receptor,CAR)导致转染效率较低,从而限制了腺病毒栽体在造血系统的应用.多种策略可以提高腺病毒转染造血细胞的效率,这些策略包括腺病毒本身的改造、造血细胞CAR表达水平的提高等.本文就这一领域的主要研究进展作一综述.

分步洗脱亲和层析法快速纯化纤溶酶-α2抗纤溶酶复合物

为快速地获取高度纯化的纤溶酶-α2抗纤溶酶复合物(plasmin-α2-antiplasmin complex,PAP),对其纯化方法进行了改进.将尿激酶激活的新鲜乏血小板血浆上Lysine-Sepharose 4B亲和层析柱后,以不同成分的洗脱液分步洗脱.结果表明,每100 ml新鲜血浆能获取纯化PAP 3.0 mg,整个纯化过程可在数小时内完成.结论:本方法简单、快速、经济以及得率高.

HLA三维结构匹配预测脐带血移植后急性GVHD

为探讨一种有效预测脐带血移植后急性移植物抗宿主疾病(aGVHD)的方法,采用分子模拟技术对25对已接受非亲缘脐带血移植并成功植入的血液病患者及其供者HLA-A,B,DRB1分子的三维结构进行了模拟,并通过计算供受者不匹配的HLA分子间均方根差(RMSD)及各差异位点的总RMSD,将供受者之间不匹配HLA分子的结构差异转化为数字,根据量化差异分析预测非亲缘脐带血移植后aGVHD的发生和程度.25名患者分为3组:第1组为不发生aGVHD组,第2组为aGVHDⅠ-Ⅱ组,第3组为aGVHDⅢ-Ⅳ组.结果表明:第1组8例,第2组13例,第3组4例.3组供受者总RMSD值±标准差分别为:0.24±0.15,0.25±0.14和0.47±0.22.第3组的总RMSD值明显高于第1和第2组(P<0.05).结论:采用HLA分子三维结构模拟匹配的方法,可以快速、简捷、准确地预测非亲缘脐带血移植后严重的aGVHD发生,为临床医生选择佳脐血供者和避免严重的aGVHD的发生提供了理论依据,并对移植后免疫抑制药物的应用具有重要的指导意义.

3438例山东汉族脐血供者HLA-DRB1等位基因频率的分布特点

为研究山东汉族人群DRB1基因的分布特征,探讨中国广大地区甚至世界其它人种利用山东脐血供者进行造血干细胞移植的可能性,应用PCR-SSP方法对山东地区3 438例无血缘关系的汉族健康新生儿脐血进行了HLA-DRB1低分辨等位基因的分布调查.结果显示:在山东汉族人群中前5位高频率等位基因依次为DRB1*15(0.1817),*07(0.1369),*09(0.1221),*04(0.1084)和*12(0.1038),低频率的等位基因是DRB1*0302/0303(0.0003),*10(0.0151),*16(0.0262)和*01(0.0322).通过山东汉族人群与相关文献中其它人种和不同地域的汉族人群的比较分析显示:没有任何1个DRB1等位基因是某一人种或民族所特有的,但DRB1基因在不同种族的人群中有其各自独特的人群分布特征,并且在不同地域的同一民族人群中亦有其独特的地理分布特征.结论:北方人在山东脐血库中容易寻找到DR等位基因相合的异基因脐血供者.中国南方人和日本人在山东也完全可能寻找到DR等位基因相合的异基因脐血供者,其机率较北方人稍低.白种人甚至非裔美国人均有可能在山东脐血库中寻找到DR位点低分辨等位基因相匹配的异基因脐血造血干细胞.

siRNA对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制

为了探索CML的治疗新思路研究了siRNA(small interfering RNA)对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制作用.制备特异性对应bcr-abl融合基因的siRNA,转染K562细胞株,采用RT-PCR法测定bcr-abl融合基因mRNA的表达.结果表明:siRNA对bcr-abl基因表达的抑制作用随浓度的增加而增强,0.2μg siRNA能使bcr-abl融合基因mRNA的表达在24和48小时分别降低至对照组的19.9%和26.6%,但72小时时恢复到原水平,同时转染siRNA后细胞生长受到抑制.结论:siRNA可以有效的抑制K562细胞株中bcr-abl融合基因的表达.

白血病和卵巢癌亲代及耐药细胞系细胞外调节蛋白激酶与端粒酶活性的变化

本研究观察白血病和卵巢癌亲代及耐药细胞系中端粒酶活性及细胞外调节蛋白激酶(extracelluar regulated protein kinases ERK)磷酸化蛋白表达水平的变化,探讨端粒酶与ERK在白血病及卵巢癌耐药中的作用.采用MTT法评价白血病和卵巢癌亲代和耐药细胞系对HRT或DDP的敏感性,用流式细胞术分析这两种细胞系间细胞周期分布的差别,用端粒酶重复扩增技术(TRAP)、生物发光分析法定量和定性检测端粒酶活性及用Westernblot检测法检测磷酸化ERK1和ERK2蛋白的表达水平.结果表明:白血病和卵巢癌耐药细胞系处于G0/G1期的细胞比例增加,端粒酶活性和磷酸化ERK1/2蛋白表达水平耐药细胞系较亲代细胞系高.结论:耐药细胞系G0/G1期细胞比例增加可能是细胞产生耐药的一种标志.白血病和卵巢癌细胞系耐药的产生可能与端粒酶活性和磷酸化ERK1/2蛋白表达水平的增高有关.

曲古菌素A对HL-60细胞组蛋白乙酰化水平和凋亡的作用

本研究旨在探讨曲古菌素A(trichostatin A,TSA)高效低毒的抗癌机理.应用细胞培养、MTT法,免疫细胞化学技术和Annexin-V-FITC/PI双标流式细胞术观察TSA对HL-60细胞和正常人外周血单个核细胞(normal human peripheral blood mononuclear cell,NPBMNC)的生长抑制,组蛋白乙酰化水平以及诱导凋亡的影响.结果表明:TSA能够以时间、剂量依赖性方式抑制HL-60细胞增殖,36小时IC50为100 ng/ml.TSA能够诱导HL-60细胞凋亡,其作用也呈时间、剂量依赖性.TSA在显著诱导HL-60细胞凋亡的浓度和时间范围内对NPBMNC无明显的诱导凋亡作用.TSA处理4小时后,HL-60细胞和NPBMNC组蛋白乙酰化水平上调显著高于未用TSA各组(P<0.05),但两者之间无显著性差异(P>0.05).结论:TSA对HL-60细胞有明确的抑制增殖能力;TSA有明确的诱导HL-60细胞凋亡的能力,这可能是TSA体外抑制白血病细胞系HL-60生长和发挥抗白血病作用的主要机理之一;与NPBMNC相比较,TSA能够选择性诱导HL-60细胞凋亡;TSA选择性抑制HL-60细胞的机理与TSA调控HL-60细胞和NPBMNC组蛋白乙酰化水平的差异无关.

急性髓细胞白血病淋系分化抗原表达及临床意义

为了探讨淋系分化抗原在急性髓细胞白血病(AML)的表达及其临床意义,采用淋系和髓系单克隆抗体,用间接免疫荧光法对62例原发性AML进行免疫表型分析.结果表明:¨例除表达髓系抗原外尚有淋系抗原表达(Ly+AML).Ly+AML初诊时肝脾结肿及血像特点与Ly-AML组无显著差异,用标准诱导化疗仅有1例获长期缓解.结论:Ly+AML对常规诱导缓解方案不敏感,选择兼顾ALL+ANL的方案可望提高治疗效果.Ly+AML患者长期生存率低可能与CD34+高表达有关.

慢性粒细胞白血病患者Ph染色体变异易位的细胞遗传学特征与荧光原位杂交研究

本研究探讨慢性粒细胞白血病(CML)中变异Ph染色体易位的细胞遗传学特征并比较双色单融合(DC-SF)与双色双融合(DC-DF)bcr/abl探针荧光原位杂交技术(FISH)在变异易位CML中的应用价值.应用常规细胞遗传学方法分析我院42例CML变异Ph易位患者,其中9例进行DC-SF-FISH和11例进行DC-DF-FISH研究.结果表明:在642例Ph阳性CML中变异易位42例(6.5%),简单变异易位42.9%(18/42),复杂变异易位54.8%(23/42),遮蔽的或隐匿的Ph易位1例.除4,6号染色体外,其余染色体均被累及.4种类型变异易位分别出现于至少2个病例中.变异易住伴附加异常15例(35.7%).FISH检测bcr/abl阳性19例(95%),阴性1例.DC-DF-FISH显示除1例患者部分细胞(8.8%)能检测到abl/bcr融合信号外,其他患者皆缺乏该融合信号.但在易位后的9号和参与变异易位的另外染色体上分别可以见到abl和bcr基因信号.DC-SF-FISH不能观察到信号的变异特征.结论:CML变异Ph易住广泛累及除9,22外其他染色体,部分类型属重现性异常;FISH检测能给予精确的分子诊断,而DC-DF-FISH可提供直观的、准确的分子变异特征分析.

汉防己甲素联合屈洛昔芬逆转K562/A02细胞耐药与诱导凋亡相关性的研究

本研究旨在探讨汉防己甲素(tetrandrine,Tet)联合屈洛昔芬(droloxifene,DRL)对耐药细胞系K562/A02的逆转作用与诱导凋亡有无相关性.采用Annexin V/PI法测定耐药调节剂汉防己甲素、屈洛昔芬单独或联合应用后细胞凋亡的情况.结果发现0.62μg/ml汉防己甲素或1.94 μg/ml屈洛昔芬单独作用于K562细胞48小时后均可诱导一定比例的细胞凋亡,作用呈时间依赖性,两者联合应用作用增强.0.62μg/ml汉防己甲素或1.94μg/ml屈洛昔芬单独作用于K562/A02细胞均不能诱导细胞凋亡,两者联合应用72小时可诱导小部分细胞凋亡.结论:汉防己甲素,屈洛昔芬逆转耐药的机理与诱导K562/A02细胞凋亡无关.

急性早幼粒细胞白血病病人服用硫化砷制剂后砷的吸收及蓄积研究

为了解急性早幼粒细胞白血病(APL)病人服用硫化砷(As4S4)制剂后的砷吸收及蓄积水平,应用氢化物原子吸收法测定了硫化砷治疗的APL病人血砷、尿砷及发砷含量.结果表明,APL病人服用硫化砷制剂7-9天的血砷水平为51.7±18.7 μg/L(n=41),尿砷水平为2359.1±1910.6μg/L(n=36),尿砷排出量为5.1±4.06mg/d(n=32);服药10-12天的血砷水平为61.7±22.7 μg/L(n=30),尿砷水平为2834.0±1958.3μg/L(n=27),尿砷排出量为6.3±4.98 mg/d(n=24);服药13-15天的血砷水平为62.8±25.1μg/L(n=34),尿砷水平为2859.3±2298.2μg/L(n=32),尿砷排出量为6.82±5.58 mg/d(n=24).停药7-9天的血砷水平为20.7±10.9μg/L(n=31),尿砷水平为525.5±337.1μg/L(n=28),尿砷排出量为1.76±1.3 mg/d(n=17);停药13-15天的血砷水平为16.1±10.1 μg/L(n=34),尿砷水平为207.1±164.5μg/L(n=28),尿砷排出量为0.42±0.27 mg/d(n=22).APL病人服用硫化砷(As4S4)制剂10天以上,血砷、尿砷及尿砷排出量达到稳定浓度,体内砷的吸收与排泄已基本达到平衡.服药期病例尿砷排出量为6.82±5.58 mg/d,则估计服药期APL病例每日吸收砷量为9.74±7.97mg/d,估计无机砷的吸收效率为(0.25±0.20)%.结论:在停药的2周过程中,体内吸收的砷大部分通过尿及其他途径排出体外,但仍有部分砷蓄积于体内,在口服硫化砷制剂治疗APL过程中,血砷浓度、尿砷浓度、尿砷排出量及毛发砷浓度可被认为监测砷吸收及蓄积的可靠指标.

三氧化二砷、人参皂甙和β榄香烯对K562细胞株端粒-端粒酶系统作用机制的研究

本研究目的是探索三氧化二砷、人参皂甙及β榄香烯等几种药物在不同浓度作用时对K562细胞株端粒长度和端粒酶活性的调节及抑制作用,并研究上述药物抗白血病的作用机制,为寻求治疗急性白血病的新方法奠定基础.用3组不同浓度的三氧化二砷、人参皂甙及β榄香烯与人类红白血病细胞株K562共培养,采用PCR-ELISA法检测端粒酶活性,Southern blot法检测端粒长度.观察上述药物对K562细胞端粒酶活性及端粒长度的影响.结果表明:①经人参皂甙、三氧化二砷及β榄香烯作用后,K562细胞株端粒酶活性下降,下降程度呈浓度、时北间依赖性,在一定浓度及作用时间后端粒酶呈阴性.②三氧化二砷、人参皂甙、β-榄香烯作用后K562细胞的存活率下降,且抑制作用呈浓度、时间依赖性.③三氧化二砷、人参皂甙及β-榄香烯作用于K562细胞72小时后,端粒长度略有延长.结论:①三氧化二砷、人参皂甙及β-榄香烯均能抑制K562细胞的端粒酶活性,抑制作用呈浓度、时间依赖性.抑制端粒酶活性可能是其抗肿瘤作用的机制之一.②三氧化二砷、人参皂甙及β-榄香烯均能抑制K562细胞的生长,抑制作用呈浓度、时间依赖性.③抑制端粒酶活性后,K562细胞的端粒长度略有延长.本研究结果提示除了端粒酶以外,白血病细胞可能存在其他的端粒长度调节机制.

急慢性白血病P27(Kip1)表达及其临床意义

为观察P27(Kip1)蛋白在常见白血病患者中的表达,探讨其与白血病类别、染色体异常、临床疗效和预后的关系,用蛋白印迹法加化学发光法对82例初诊或复发白血病患者的骨髓或外周血进行P27(Kip1)蛋白的检测.结果显示,P27(Kip1)在急性淋巴细胞白血病(ALL)中表达高于在急性非淋巴细胞白血病(ANLL)(P=0.033)和慢性粒细胞白血病(CML)(P=0.008)中表达.P27(Kip1)在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中表达高于在CML中表达(P=0.017).P27(Kip1)>0.655组首次化疗有效率(CR和PR)高于P27(Kip1)≤0.655组,两者有显著差异(P=0.041).急性白血病患者中,P27(Kip1)>0.655组生存期长于P27(Kip1)≤0.655组,P=0.0065;而且在ANLL(P=0.0271)、ALL(P=0.0266)组中均有显著差异,P27(Kip1)表达高的,生存时间长,P27(Kip1)表达低的,生存时间短.P27(Kip1)表达低似乎与ALL患者多种染色体异常相关(r=-0.775,P=0.04).而P27(Kip1)表达与白血病患者的性别、年龄、外周血白细胞数、原始细胞数、血LDH以及血尿酸水平无明显相关性.结论:P27(Kip1)表达的高低与急性白血病的首次化疗效果、生存时间密切相关,低表达预示着不良预后.

血浆病毒灭活仪

亚洲血液学会第二届学术会议--北京国际脐带血造血干细胞移植研讨会

《中国实验血液学杂志》编辑委员会