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As2O3对KM3细胞端粒酶及其逆转录酶作用的研究
为了探讨三氧化二砷(As2O3)对多发性骨髓瘤(MM)细胞株KM3的作用及其可能机制,用台盼蓝拒染法检测细胞生长抑制率,用光镜、透射电镜观察形态变化,用DNA电泳观察As2O3诱导KM3细胞凋亡,用流式细胞仪检测细胞周期的变化,用TRAP-PCR-ELISA法检测As2O3作用KM3细胞后的端粒酶活性变化,并用半定量RTPCR法检测端粒酶逆转录酶(hTERT mRNA)的表达水平.结果表明:As2O3抑制KM3细胞的生长,具有诱导细胞凋亡的作用;As2O3阻滞细胞于G2期;As2O3可抑制KM3细胞的端粒酶活性和hTERT mRNA的表达,且hTERTmRNA下降趋势与端粒酶活性相一致.结论:端粒酶及其逆转录酶活性的下调可能在As2O3诱导KM3细胞凋亡的过程中起了重要作用.
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沙利度胺联合地塞米松对多发性骨髓瘤KM3细胞的作用
为了探讨沙利度胺(thalidomide,THD)联合地塞米松(Dx)对多发性骨髓瘤KM3细胞的作用及其可能的机制,采用细胞毒性试验(MTT法)观察不同浓度、不同作用时间的THD或THD+地塞米松(Dx)作用于KM3细胞后细胞的抑制率,以选取佳药物干预条件.使用该条件处理KM3细胞,并采用间接ELISA法检测细胞上清中IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、内皮抑素(ES)、凋亡抑制蛋白survivin的表达.结果表明:随着THD浓度的加大、作用时间的延长,KM3细胞生长的抑制也呈增强的趋势,同时THD与Dx联用可显著提高药物对KM3细胞的生长抑制作用.80μg/ml或100μg/mll THD联合Dx<(4 μg/ml)可使KM3细胞IL-6、TNF-α、survivin表达下降,ES表达增加,而对VEGF的表达无影响.结论:THD联合Dx对KM3细胞有协同抑制作用,THD联合Dx可能通过下调KM3细胞IL-6、TNF-α、survivin的表达,上调ES的表达而发挥抗多发性骨髓瘤的作用.
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三氧化二砷与硼替佐米联合应用对多发性骨髓瘤KM3细胞凋亡的作用及其机制研究
本研究探讨硼替佐米(Bor)单用及与三氧化二砷(As2O3)联合应用对多发性骨髓瘤(MM)细胞株KM3细胞凋亡的影响及其相关机制.采用MTT法检测Bor单用及与As2O3联合应用对KM3细胞增殖的抑制作用,计算其IC50值.采用Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测各药物组KM3细胞早期及晚期凋亡率,流式细胞术测定各药物组KM3细胞跨膜电位的变化.采用RT-PCR检测各药物组KM3细胞Caspase-3、Bim、Bcl-xL mRNA水平的变化.结果表明,Bor联合As2O3对KM3细胞生长抑制明显高于Bor单用,处理72 h作用明显[(27.64±0.81)％vs(21.67±2.20)％,P＜0.05].联合用药组KM3细胞早期凋亡率及晚期凋亡率均较Bor单药组明显增多,前者在作用48 h时效果明显[(53.20 +3.70)％vs (35.40 +2.58)％,P＜0.01],后者在作用72 h时效果明显[ (63.96±2.97)％vs(54.08±3.76)％,P＜0.01].联合用药组KM3细胞线粒体跨膜电位较Bor单药组明显下降,作用48 h时下降明显.与Bor单药组比较,联合用药组KM3细胞Caspase-3 mRNA、Bim mRNA均升高,Bcl-xLmRNA下降.结论:在体外As2O3可增强Bor对KM3细胞增殖的抑制,增加KM3细胞的凋亡,并且可能通过抑制Bcl-xL mRNA表达,诱导Caspase-3和BIM mRNA表达的途径增强凋亡作用.
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EGCG对多发性骨髓瘤细胞KM3促血管新生作用的抑制效应及机制初探
本研究探讨绿茶茶多酚成分之一表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate.EGCG)]对多发性骨髓瘤细胞KM3促血管新生作用的影响及其机制.体外培养多发性骨髓瘤细胞KM3,观察不同浓度EGCG作用后的培养上清对血管内皮细胞株HUVEC迁移和形成血管能力的影响.ELISA法检测KM3细胞培养上清中血管内皮生长因子(VEGF)分泌水平;RT-PCR方法检测KM3细胞VEGFmRNA表达水平.结果表明:EGCG以浓度依赖方式抑制KM3细胞培养上清促内皮细胞迁移的作用,5,25,50和100 μmol/L的EGCG迁移细胞数目分别为414±27,299±70,202±42及116±13个,且EGCG的浓度与内皮细胞的迁移数目呈负相关(r=-0.952,p＜0.05).同时,内皮细胞形成小管的面积随EGCG浓度的升高而减少,25及50 μmol/L时的面积分别是88343.9±3231.1和60897.5±914.1 μm2,均明显低于对照组(p＜0.01),小管面积与EGCG浓度呈负相关(r=-0.888,p＜0.05).5、25、50、100 μmol/L的EGCG作用于KM3细胞48小时后培养上清中VEGF的含量分别为1399.0±47.4pg/ml,660.1±5.7 pg/ml,108.5±5.8 pg/ml和26.2±18.6 pg/ml,与对照组比较,25、50、100 μmol/L组均有统计学意义(p＜0.01).RT-PCR结果显示EGCG抑制KM3细胞VEGF的mRNA水平表达,且呈浓度依赖性.结论:EGCG能显著抑制多发性骨髓瘤细胞KM3的促血管新生作用;下调VEGF转录水平的表达,减少VEGF的分泌可能是其药理作用机制之一.
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伏立诺他与左旋苯丙氨酸氮芥对人类多发性骨髓瘤细胞的协同作用
目的 观察体外伏立诺他和左旋苯丙氨酸氮芥联合对人类多发性骨髓瘤细胞株U266、KM3的抗瘤作用.方法 应用MTT法分别测定伏立诺他和左旋苯丙氨酸氮芥不同浓度对骨髓瘤细胞株U266、KM3的抗瘤作用,计算两药的IC50值；应用MTT法测定固定一种药物浓度联合不同浓度另一药物时对U266、KM3的抑制作用,计算药物联合指数(CI),判断药物相互作用.结果 伏立诺他单药对U266细胞的IC50值介于5.0～ 7.5μmol/L,对KM 3细胞的IC50值介于2.5～5.0μmol/L；左旋苯丙氨酸氮芥单药杀伤U266细胞的IC50值介于40～60μmol/L,杀伤KM3细胞的IC50值介于60～ 80 μmol/L.固定伏立诺他浓度(U266细胞中为1.25 μmol/L,KM 3细胞中浓度为1.0μmol/L),在U266细胞中左旋苯丙氨酸氮芥浓度为20、40、60、80μmol/L时均CI＜ 0.9,表现为协同作用,在KM3细胞中左旋苯丙氨酸氮芥浓度为40、60、80、100 μmol/L时均CI＜0.9,表现为协同作用；同定左旋苯丙氨酸氮芥浓度(U266细胞中为10μmol/L,KM3细胞中浓度为20 μmol/L),在U266细胞中伏立诺他浓度为2.5、5.0、7.5μmol/L时均CI＜ 0.9,表现为协同作用,在KM3细胞中伏立诺他浓度为1.0、2.5、5.0 μmol/L时均CI＜0.9,表现为协同作用；当伏立诺他浓度为7.5μmol/L联合左旋苯丙氨酸氮芥20 μmol/L时呈现相加作用(CI=0.93).结论 体外伏立诺他单药对两种多发性骨髓瘤细胞株有明显的杀伤作用,与左旋苯丙氨酸氮芥有协同抗骨髓瘤细胞作用.
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阿霉素增强TRAIL诱导的人骨髓瘤细胞系KM3细胞凋亡的分子机制研究
目的 探讨阿霉素增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导人骨髓瘤细胞系KM3细胞凋亡的分子机制.方法 采用TUNEL法和流式细胞术比较单独TRAIL及联合应用阿霉素对KM3细胞凋亡率的影响.Western blot法检测阿霉素诱导前后KM3细胞核内转录因子NF-κB亚单位蛋白P65以及死亡受体DR5表达的变化.结果 流式细胞术分析显示,10、20、50、100 ng/ml的TRAIL联合应用1μg/ml阿霉素诱导KM3细胞后,细胞凋亡率分别为20.88%、40.03%、57.87%和60.82%,显著高于单独应用阿霉素或TRAIL诱导的细胞凋亡率;与TUNEL法检测结果一致.KM3细胞经不同浓度阿霉素(0.5、1.0、2.0、4.0μg/ml)联合20 ng/ml TRAIL处理后,DR5受体的表达量随应用阿霉素浓度的增加而上升,而细胞核内P65蛋白表达量则随阿霉素浓度的增加而下降.结论 骨髓瘤细胞膜DR5表达量提高和NF-κB的核转移是阿霉素协同TRAIL诱导凋亡反应的重要分子机制.
关键词： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 阿霉素 KM3细胞 细胞凋亡 -
三氧化二砷增强硼替佐米、地塞米松对多发性骨髓瘤细胞的作用
目的 通过观察硼替佐米单用及与三氧化二砷(As_2O_3)、地塞米松(DXM)联合应用对多发性骨髓瘤(MM)细胞株KM3细胞增殖及凋亡的影响,探讨As_2O_3能否增强硼替佐米、DXM的抗MM作用.方法 采用MTT法检测硼替佐米单用及与As_2O_3、DXM联合应用对KM3细胞增殖的抑制作用,计算其IC_(50)值.采用细胞形态学、琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段观察硼替佐米对KM3细胞凋亡的影响,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测硼替佐米联合As_2O_3、DXM后KM3细胞凋亡率的变化.结果 硼替佐米、As_2O_3及DXM对KM3细胞增殖抑制呈时间和浓度依赖性IC_(50)值分别为0.27、3.10、8.01 μmol/L;硼替佐米联合As_2O_3及DXM对KM3细胞的增殖抑制作用强于硼替佐米联合As_2_O3或DXM[(34.51±0.51)%对(25.39±0.90)%;(34.51±0.51)%对(23.80±0.78)%].0.25μmol/L硼替佐米与KM3细胞共孵育48 h后,KM3细胞出现典型的凋亡形态学改变,DNA电泳呈现梯形条带,Annexin V阳性细胞比例增高;硼替佐米联合As_2O_3、DXM组的KM3细胞凋亡率明显高于硼替佐米联合DXM组.结论 在体外,硼替佐米能够抑制KM3细胞增殖,诱导其凋亡.硼替佐米联合As_2O_3及DXM对KM3细胞增殖抑制作用显著增强;As_2O_3可增强硼替佐米、DXM对KM3细胞的诱导凋亡作用.
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氟达拉滨、米托蒽醌对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226 KM3的增殖抑制作用
目的:观察氟达拉滨、米托蒽醌对两株不同多发性骨髓瘤细胞RPMI8226、KM3体外增殖的抑制作用.方法:采用MTT法观察1.25～20μg/mJ氟达拉滨及联合应用米托蒽醌处理RPMI8226、KM3细胞后其增殖的变化.结果:氟达拉滨剂量逐渐增大时,对两株多发性骨髓瘤细胞抑制率逐渐增强(P<0.01).氟达拉滨对RPMl8226细胞的IC50为5.261μg/ml,对KM3细胞的IC50为4.931μg/ml.氟迭拉滨联合米托蒽醌对RPMI8226、KM3细胞的增殖抑制作用显著强于氟达拉滨或米托蒽醌单独处理组(P<0.01).结论:氟达拉滨对两种不同性质的多发性骨髓瘤细胞株均有明显的杀伤作用.氟达拉滨联合米托蒽醌能更有效地抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖,为临床治疗多发性骨髓瘤提供实验依据.
关键词： 氟达拉滨 米托蒽醌 RPMI8226细胞 KM3细胞 -
补肾养骨汤诱导多发性骨髓瘤细胞株KM3的凋亡及机制探讨
目的 探讨补肾养骨汤对人多发性骨髓瘤细胞株KM3细胞增殖、凋亡的影响及其机制.方法 取对数生长期KM3细胞,分别加入5％、10％、20％的补肾养骨汤含药血清培养,培养12、24、48和72 h后,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测补肾养骨汤对KM3细胞增殖的影响;KM3细胞经过不同浓度含药血清培养72 h后,采用流式细胞术检测补肾养骨汤对KM3细胞周期和凋亡作用;RT-qPCR和Western blot检测B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)和核转录因子(NF)-κB的表达水平.结果 补肾养骨汤抑制KM3细胞株的增殖,诱导KM3细胞株呈剂量依赖性凋亡,使KM3细胞周期停滞在G0/G1期,导致KM3细胞株Bcl-2、NF-κB表达下调,Bax表达上调.结论 补肾养骨汤抑制KM3细胞的增殖,影响细胞周期,诱导其凋亡,此作用机制可能与Bcl-2、Bax和NF-κB表达异常有关.
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氟达拉滨对多发性骨髓瘤细胞系KM3细胞分泌IL-6的影响
目的:研究氟达拉滨(fludarabine)在体外对多发性骨髓瘤细胞KM3细胞生长的影响及对细胞上清液IL-6、sIL-6R的影响.方法:采用MTT法及细胞计数法分别观察不同浓度氟达拉滨对KM3细胞生长的影响;用双抗夹心法检测不同浓度氟达拉滨作用KM3细胞后上清液白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)和可溶性白细胞介素6受体(soluble interleukin-6 receptor, sIL-6R)的表达水平.结果:MTT法及细胞计数法均显示氟达拉滨对KM3细胞有明显的抑制作用,氟达拉滨作用KM3细胞72 h后,25、50、100、200、400 nmol/L组的增殖抑制率均高于对照组(P＜0.01),且与浓度成正比.400 nmol/L组对KM3细胞增殖抑制率随时间的延长而增加.双抗夹心法检测结果显示KM3细胞经氟达拉滨作用96 h后,其IL-6水平先升高后明显下降,而sIL-6R水平随药物浓度的升高而逐渐下降.结论:氟达拉滨能明显抑制KM3细胞的增殖,同时能抑制KM3细胞自分泌IL-6和sIL-6R..
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沉默survivin基因以增加骨髓瘤细胞对阿霉素敏感性的研究
背景与目的:Survivin是凋亡抑制蛋白家族成员之一,在多种恶性肿瘤中高表达,但在正常成人分化组织中无表达.其表达与多种肿瘤的预后及肿瘤对放、化疗的耐受有关.本研究采用RNA干扰技术下调survivin基因在人骨髓瘤细胞系KM3中的表达,观察其诱导KM3细胞凋亡的作用,及是否增加KM3细胞对阿霉素的敏感性.方法:针对survivin mRNA体外化学合成小干扰RNA(siRNA),采用脂质体介导转染KM3细胞,以RT-PCR和Western blot方法检测转染后24h、48 h和72 h KM3细胞survivin mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察干扰前后细胞的凋亡情况,细胞毒分析方法比较转染前后对阿霉素敏感性的变化.结果:转染survivin siRNA后24 h、48 h和72 h,与阴性对照组相比,KM3细胞survivin mRNA 水平分别下调了(47.0±4.3)%、(81.4±6.2)%和(49.1±7.9)%,蛋白质表达下调了(39.6±3.8)%、(564±6.7)%和(68.2±5.1)%.荧光显微镜下可见转染survivin siRNA 48 h后的KM3细胞,凋亡率为(28-+7)%,明显高于转染阴性对照siRNA的细胞.转染后细胞对阿霉素的敏感性增加,IC50由(1.12+0.14)μmol/L下降至(0.31+0.03)μmol/L.结论:以siRNA下调survivin的表达可有效诱导KM3细胞凋亡,并增加其对阿霉素的敏感性.
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Survivin在多发性骨髓瘤患者骨髓细胞中的表达及其临床意义
背景与目的:Survivin是凋亡抑制蛋白家族成员之一,在多种恶性肿瘤中高表达,但在正常成人分化组织无表达.其表达与多种肿瘤的预后及肿瘤对放、化疗的耐受有关.本研究旨在通过检测Survivin在正常人、初治及复发/难治多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者骨髓细胞及骨髓瘤细胞系KM3中的表达,以揭示Survivin在骨髓瘤中的表达与耐药及疗效的关系.方法:RT-PCR和Western blot法检测29例MM患者(其中初治17例,复发/难治12例)、9例正常人骨髓标本及KM3细胞系中Survivin mRNA和蛋白质水平表达.结果:骨髓瘤细胞系KM3高表达Survivin.Survivin mRNA在正常人、初治和难治/复发MM患者骨髓细胞中阳性率分别为22.2%、70.5%和83.3%,表达水平(Survivin/β-actin比值)分别为0.06±0.04、0.31±0.14和0.69±0.24,骨髓瘤患者表达率和表达水平显著高于正常人(P＜0.01),而难治/复发MM组表达水平高于初治组(P＜0.05).所有的正常人标本中均未检测到Survivin蛋白,在初治和难治/复发MM组Survivin蛋白阳性率分别为41.1%和58.3%(P＞0.05),表达水平(Survivin/α-tubulin半定量比值)分别为0.11±0.07和0.21±0.12,难治/复发MM组明显为高(P＜0.05).17例初治患者中,7例Survivin阳性者4例部分缓解(partial response,PR),1例微小反应(minor response,MR),2例无变化(no change,NC),有效率[完全缓解(complete response,CR)+PR+MR]71.4%;10例Survivin阴性者中2例CR,4例PR,2例MR,2例NC,有效率80%,略高于阳性组.但统计学分析未发现两组有效率存在显著性差异.结论:Survivin在骨髓瘤患者中的高表达可能是部分患者对化疗不敏感的原因之一,由于Survivin仅特异性表达于骨髓瘤细胞,Survivin可作为逆转骨髓瘤细胞耐药治疗中的潜在靶点.
