中国实验血液学杂志
Journal of Experimental Hematology 중국실험혈액학잡지
- 主管单位： 实验血液学杂志
- 主办单位： 中国科学技术协会
- 影响因子： 0.98
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 11-4423/R
- 国内刊号： 陈潮
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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重症先天性中性粒细胞减少症基因突变和急性白血病转化
重症先天性中性粒细胞减少症(SCN)是一种罕见的骨髓衰竭性疾病,外周血中性粒细胞绝对值明显减少,具有强烈的向骨髓增生异常综合征(MDS)/急性髓细胞白血病(AML)转化的风险,目前发现与SCN相关的异常基因有14种,ELANE是SCN常见的致病基因.粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是目前主要的治疗手段.在治疗过程中经常会有CSF3R突变,可导致SCN转化为AML.深入研究SCN/AML转化机制有助于该疾病诊治.本文就SCN患者的遗传学及表型多样性,G-CSF对SCN的治疗作用及风险,SCN患者集落刺激因子3受体(CSF3R)突变影响G-CSF信号传导,CSF3R突变是SCN转化为急性白血病的重要因素和了解SCN/AML转化机制有助于疾病诊治等问题作一综述.
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利用CRISPR/Cas9技术敲除LSD1基因显著抑制人慢性髓系白血病K562细胞的增殖与CD235a的表达
目的:探索敲除LSD1基因对人慢性髓系白血病K562细胞产生的影响.方法:利用CRISPR/Cas9技术特异性敲除K562细胞系的LSD1基因;通过流式细胞分选技术获得单细胞后,经过扩增培养、Western blot与测序鉴定,分别获得l株LSD1+/-与LSD1-/-细胞株;MTS方法检测LSD1敲除对K562细胞增殖的影响;流式细胞分析技术检测LSD1对K562细胞表面标记表达的影响.结果:成功构建了K562的LSD1+/-与LSD1-/-细胞株;LSD1的敲除显著抑制了K562的增殖及CD235a的表达.结论:LSD1基因对K562细胞的增殖及CD235a的表达具有关键调控作用.
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儿童成熟B淋巴细胞白血病7例临床分析
目的:评估2014年中国抗癌协会儿科专业委员会联合中华医学会儿科学分会血液学组制定的儿童和青少年成熟B细胞非霍奇金淋巴瘤方案(CCCG-BNHL-2015方案)治疗儿童成熟B淋巴细胞白血病的疗效.方法:对本院2014年11月至2017年1月初诊的成熟B淋巴细胞白血病患儿,采用CCCG-BNHL-2015(R4组)方案治疗.结果:纳入统计的成熟B淋巴细胞白血病患儿共7例,中位发病年龄为7.2(4.1-11.75)岁;男性患儿5例,女性患儿2例;其中4例合并胸腔和/或腹腔肿块,l例仅累及淋巴结,2例合并骨质破坏,l例合并中枢神经系统白血病,2例疾病初期出现肿瘤溶解综合征;所有患儿首次乳酸脱氢酶(LDH)检查均显著增高.7例患儿均在2-4个疗程后获得完全缓解,其中2例在疗程结束后行自体造血干细胞移植,1例在所有疗程尚未结束时出现中枢神经系统白血病复发而放弃治疗,其余6例患儿均存活,平均随访时间14(7-28)个月,所有患儿化疗后均出现不同程度的骨髓抑制和感染,无治疗相关性死亡,无严重治疗相关并发症发生.结论:本研究采用的CCCG-BNHL-2015方案(R4组)的治疗效果良好、安全性高,完全缓解率高,无治疗相关死亡和严重并发症发生.
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DOT1L抑制剂EPZ-5676联合化疗药物对RS4;11细胞增殖及凋亡的影响
目的:探讨DOT1L抑制剂EPZ-5676与抗急性淋巴细胞性白血病药物在抗增殖及促凋亡方面的联合作用.方法:将EPZ-5676与5种抗急性淋巴细胞性白血病药物分别以单药、2药联合形式作用于MLL基因重排阳性的急性淋巴细胞性白血病RS 4;11细胞系.用CCK-8法测定不同浓度单药及联合用药对细胞抑制率的影响.应用compusyn软件评价联合用药对肿瘤细胞的抑制率(Fa)与联合作用指数(combination index,CI)的关系,判定药物间的相互作用.用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测EPZ-5676、长春新碱及糖皮质激素和/或EPZ-5676的细胞凋亡率,两者比较判断该浓度EPZ-5676是否具有与长春新碱及糖皮质激素联合促凋亡作用.结果:EPZ-5676与甲基强的松龙或长春新碱或VP16联用具有协同抗增殖效应;EPZ-5676与环磷酰胺或表柔比星2药合用产生拮抗效应.与对照组相比,3种浓度的EPZ-5676单药(5、10和25 μmol/L)对细胞凋亡均无显著性影响.5μmol/L的EPZ-5676与长春新碱或糖皮质激素的联合用药均具有协同促凋亡作用(56.87％ vs 12.93％)(P=0.00l),(8.86％ vs5.28％)(P=0.044).结论:EPZ-5676与甲基强的松龙或长春新碱或VP16具有协同抗RS 4;11细胞增殖的效应,EPZ-5676单药对于RS 4;11细胞凋亡的影响不明显,而低浓度EPZ-5676与长春新碱或糖皮质激素具有协同促凋亡作用.
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Rigosertib对白血病细胞系HEL和K562的抗肿瘤作用及机制研究
目的:探讨Rigosertib对白血病细胞系HEL和K562细胞的凋亡、增殖和细胞周期的影响及其作用机制.方法:Rigosertib梯度浓度作用于HEL和K562细胞,采用Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,WST-1法绘制细胞增殖曲线,PI染色流式细胞术检测细胞周期,流式细胞术胞内染色检测胞内信号通路蛋白表达.结果:Rigosertib明显诱导HEL和K562细胞凋亡且呈现时间依赖性(r =0.997)和剂量依赖性(r =0.987);以低剂量Rigosertib浓度(0.5μnol/L)分别作用于HEL和K562细胞6-54 h,明显抑制HEL和K562细胞增殖,诱导HEL和K562细胞阻滞于G0/M期,G1期细胞比例明显降低.流式细胞术分析显示,Rigosertib激活胞内凋亡蛋白cleaved caspase 3和cleaved PARP蛋白的表达,同时抑制增殖蛋白BCL-2和Cyclin D1蛋白的表达.此外Rigosertib明显抑制AKT、磷酸化AKT(S473)和磷酸化GSK-3α/β(S21/9)的表达.结论:Rigosertib诱导白血病细胞系HEL和K562细胞凋亡,增殖抑制和细胞周期阻滞,其抗肿瘤作用可能通过抑制AKT-GSK信号通路而实现的.本研究为rigosertib进一步应用于临床前研究提供了实验依据.
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Embelin逆转K562/D细胞对柔红霉素耐药与P-gp及MDR1mRNA无关
目的:探讨XIAP抑制剂Embelin逆转K562/D细胞对柔红霉素(daunorubicin,DNR)耐药的机制以及与P-gp及MDR1 mRNA的关系.方法:应用MTT法检测不同浓度DNR及联合Embelin对K562及K562/D细胞增殖抑制情况的影响;应用Annexin V-FITC/PI复染流式细胞术检测细胞凋亡的改变;用Western blot方法检测XIAP、Caspase-3、P-gp、BCL-2及BAX的蛋白表达情况;用RT-PCR检测XIAP、MDR1、BCL-2及BAX的mRNA表达情况.结果:DNR作用于K562与K562/D细胞系24 h的IC50值分别为2.177 μg/ml和69.43μg/ml,耐药指数为31.89;分别用浓度为3、10、30、100及300 μg/ml的Embelin作用于K562/D细胞系24 h,其增殖抑制率分别为2.70％±1.08％、10.92％±4.89％、28.13％±2.09％、36.56％±3.24％及43.59％±1.16％;用0.1、1、10及100μg/ml DNR联合10 μg/ml Embelin作用于K562/D细胞系24 h,细胞增殖抑制率分别为31.92％±3.29％、49.57％±6.87％、55.16％±0.78％和71.94％±3.89％,其IC50值为2.11 μg/ml,逆转指数为32.91.用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测凋亡率.单独应用0.1 μg/ml DNR作用于K562/D细胞系24 h的细胞凋亡率为12.06％±0.95％,而联合10和30 μg/ml Embelin作用于K562/D细胞系24h的细胞凋亡率分别为27.54％±0.59％和39.59％±1.57％;Western Blot结果显示,DNR联合Embelin后,Caspase-3的表达明显下降(P＜0.05),且用抑制剂Z-VAD-FMK可以抵消药物联合应用对细胞的增殖抑制作用.同时,XIAP和BCL-2蛋白表达明显下降(P＜0.05),BAX蛋白表达明显升高(P＜0.05),而P-gp的表达无改变;RT-PCR结果显示,DNR联合Embelin后,XIAP和BCL-2 mRNA表达明显下调(P＜0.05),BAX mRNA表达明显上调(P＜0.05),MDR1 mRNA表达无明显变化(P＞0.05).结论:降低XIAP表达有助于增强DNR对K562/D细胞的作用;Embelin逆转K562/D细胞对DNR耐药机制与P-gp及MDR1 mRNA无关.
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冬凌草甲素对白血病细胞增殖抑制及机制的研究
目的:探讨伊马替尼耐药的K562细胞(K562-R)的可能耐药机制及冬凌草甲素(oridonin,OR)对伊马替尼敏感的K562细胞(K562-S)和K562-R细胞的生长抑制作用及其可能机制.方法:Western blot法检测K562-S和K562-R细胞内p-Lyn的表达;采用改良的四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测OR对K562-S和K562-R细胞的增殖抑制作用,光学显微镜观察OR作用24 h后K562-S和K562-R细胞的形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测OR对K562-S和K562-R细胞内BCL-2的表达和蛋白激酶p-Lyn、Akt/mTOR信号通路的变化.结果:在K562-R细胞中,p-Lyn表达增高.OR对K562-S和K562-R细胞的生长具有抑制作用,且呈时间和浓度依赖性,OR作用72 h的半抑制浓度(IC50)值分别为4.23±1.30和4.97±2.23 μmol/L.OR作用24 h后,K562-S和K562-R细胞破坏明显,部分细胞裂解成碎片.流式细胞仪检测发现,OR使K562-S和K562-R凋亡细胞明显增多.Westemblot结果提示,OR使细胞内蛋白激酶p-Lyn表达下降,Akt/mTOR信号通路关键点蛋白磷酸化水平明显减低,凋亡抑制蛋白BCL-2表达下调.结论:p-Lyn高表达可能参与K562-R细胞的耐药.OR通过下调p-Lyn,抑制Akt/mTOR信号通路和下调BCL-2表达,促进细胞凋亡,抑制白血病细胞株K562-S和K562-R的生长.
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PD-L1、HSP90及HSP90α在急性白血病患者中表达及其意义
目的:探讨PD-L1、热休克蛋白90(HSP90)和热休克蛋白α(HSP90α)在急性白血病(AL)患者不同类型及不同疾病阶段表达情况及其临床意义.方法:选取2013年1月至2016年10月医院收治的84例急性白血病患者和选择体检健康者20例作为对照组,收集他们的血清及骨髓样本,应用ELISA法测定HSP90、HSP90α蛋白水平,流式细胞术检测PD-L1表达,分析患者临床转归与PD-L1、HSP 90和HSP90α表达的关系.结果:各组AL患者PD-L1阳性率、HSP90和HSP90α蛋白表达水平均显著高于对照组(P＜0.05),缓解期患者的PD-L1阳性率、HSP90和HSP90α蛋白水平均低于初治期患者(P＜0.05),复发患者的PD-L1阳性率和HSP90及HSP90α蛋白水平均高于初治及缓解期患者(P＜0.05),初治AML与初治ALL患者的PD-L1阳性率、HSP90蛋白水平无显著性差异(P＞0.05),初治AML患者HSP90α蛋白水平低于初治ALL患者(P＜0.05);患者经治疗后,未缓解患者PD-L1阳性率、HSP90及HSP90α蛋白水平显著高于完全缓解患者(P＜0.05);未复发患者化疗过程中HSP90α蛋白表达逐渐降低,造血干细胞移植术后患者HSP90α蛋白表达低,复发前HSP90α蛋白表达增加,复发后水平达高峰.结论:PD-L1、HSP90和HSP90α在急性白血病发展过程中发挥重要作用,可作为评估患者临床疗效及预后的参考指标.
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儿童急性淋巴细胞白血病SOCS3 mRNA的表达水平与临床特点、早期治疗反应的相关性
目的:观察细胞因子信号转导抑制因子-3(SOCS3 mRNA)在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)中的表达水平,分析SOCS3 mRNA表达水平高低与儿童ALl疾病状态、危险度之间的关系,探讨SOCS3 mRNA在儿童ALL疾病状态和危险度评估、靶向治疗中的应用.方法:采用SYBR Green荧光定量PCR的方法检测45例新诊断ALL患儿初诊时、诱导缓解期和13例正常儿童骨髓单个核细胞中SOCS3 mRNA表达水平;分别采用方差分析和秩和检验的方法分析SOCS3 mRNA表达水平与ALL危险度、临床特点的关系.同时采用免疫荧光组织化学染色联合激光共聚焦显微技术测定ALL患儿骨髓单核细胞中SOCS3 mRNA的位置与表达量.结果:45例患儿初诊时SOCS3mRNA表达水平明显低于正常儿童(P＜0.05);诱导缓解期45例患儿的SOCS3 mRNA表达水平与正常儿童无显著差异(P＞0.05);初诊时中、高危组患儿SOCS3 mRNA表达水平高于低危组(P＜0.05);按照中位数法将45例患儿初诊时SOCS3 mRNA表达水平分为高表达组和低表达组,比较2组患儿临床特点发现,SOCS3 mRNA高表达组具有更高的外周血白细胞计数、乳酸脱氢酶水平和预后不良基因.此外,2组在危险度比较时SOCS3 mRNA高表达组危险度更高.结论:SOCS3 mRNA在初诊时下调而在疾病诱导缓解后恢复正常表达,SOCS3可以作为评价疾病状态的指标.SOCS3 mRNA的高表达使ALL危险度上调,SOCS3 mRNA可以作为评价ALL危险度的因子,通过调节SOCS3 mRNA表达水平治疗ALL或许可以成为治疗的新方向.
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KLF4过表达对白血病K562细胞增殖、凋亡的影响
目的:建立稳定过表达人锌指转录因子Krüppel样因子4(Krüppe-like factor 4,KLF4)基因的K562细胞株,研究KLF4过表达对白血病K562细胞增殖、凋亡的影响.方法:将过表达KLF4的重组质粒pEGFP-KLF4电穿孔转染白血病K562细胞,G418压力筛选出稳定转染细胞克隆并扩大培养(K562/pEGFP-KLF4组),设pEGFP-C1空质粒转染K562细胞(K562/pEGFP-C1组)及空白K562细胞对照组.应用荧光显微镜观察EGFP-KLF4融合蛋白的表达,Western blot法检测各组细胞中KLF4蛋白表达水平,MTT比色法检测各组细胞的增殖能力,流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况.结果:pEGFP-KLF4重组质粒转染K562细胞后,经G418压力筛选,获得了表达绿色荧光蛋白的稳定细胞株;与对照组相比,K562/pEGFP-KLF4组细胞KLF4的蛋白表达水平明显升高,其过表达率为74.07％ (P ＜0.05);过表达KLF4的K562细胞增殖活力被显著抑制(P＜0.05);过表达KLF4的K562细胞凋亡显著增加(P＜0.05).结论:KLF4过表达可抑制K562细胞的增殖,促进其凋亡.
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FLT3-的AML细胞对PKC412体外敏感性的初步研究
目的:探索PKC412(midostaurin,米哚妥林)在FLT3-AML患者治疗中的价值.方法:无菌采集21例FLT3-的初治AML患者骨髓血或外周血肝素抗凝,应用密度梯度离心法分离单个核细胞,采用三磷酸腺苷生物荧光肿瘤体外药敏检测技术(ATP bioluminescence-tumor chemosensitivity assay,ATP-TCA)测定白血病细胞体外对8种浓度PKC412的敏感性,并分析其体外药敏结果、危险度分层及临床疗效三者之间的关系.结果:21例AML患者的白血病细胞在体外对PKC412的反应不相同,体外敏感率为42.9％,体外敏感浓度为1-5 μmol/L.PKC412体外药敏结果与患者危险度分层之间无相关性,与临床疗效之间也无相关性.低、中危组患者的存活率著优于高危组患者(P=0.015).结论:PKC412可能是FLT3-初治AML的有效治疗手段之一;白血病细胞对PKC412的敏感性有可能成为判断PKC421疗效的独立预测指标.
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孕妇IgG效价与不同血型新生儿溶血并发症的相关性分析
目的:探讨孕妇IgG效价与不同血型新生儿患溶血病(hemolytic disease of newborn,HDN)的相关性.方法:选取2014年5月-2015年1月在我院进行产检的0型血孕妇400例,且夫妻双方血型不同,在检查过程中对孕妇的IgG效价进行了检测,并且追踪孕妇产后新生儿溶血病的发生情况;根据新生儿是否出现HDN分为两组:HDN组和非HDN组.HDN组85例,非HDN组315例,并对IgG效价与其相关性进行系统的研究分析.结果:将产检过程中孕妇IgG效价分为＜1∶64、1∶64、1∶128、1∶256和1∶512 5组,对IgG效价＞644组的新生儿HDN发病率与IgG效价＜64的新生儿HDN发病率分别比较显示,ABO-HDN的患病率分别为96.9％、79.6％、63.7％和28.8％,孕妇IgG效价与新生儿ABO溶血病的发生存在着一定的相关性,即随着IgG效价的升高,新生儿溶血病的发病率有升高的趋势(r =0.8832).4组中新生儿的HDN发病的风险均高于IgG效价＜64新生儿的HDN组.结论:孕妇IgG效价与ABO-HDN的发病率有一定的相关性,因此对于IgG效价高的孕妇在产前进行效价的控制对于降低新生儿溶血病的发病率具有重要的临床意义.
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罕见Ael05/B101亚型鉴定及输血探讨
目的:应用分子生物学方法鉴定ABO正反定型不一致的患者,并探讨合理的输血策略.方法:在常规血型血清学鉴定的基础上,应用吸收放散法鉴定弱血型抗原;PCR方法扩增ABO基因的7个外显子及侧翼内含子;对扩增产物进行直接测序及克隆测序分析.结果:患者ABO血型正反定型不一致,患者正定型为B型,反定型为AB型;吸收放散试验证明患者红细胞上存在弱A抗原,ABO基因测序发现第7外显子767位碱基T＞C突变,导致256位异亮氨酸被苏氨酸替换,血型基因型为ABO* Ael05/Bl01.结论:α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶基因的767位T＞C突变是导致Ael05亚型A抗原表达减弱的分子机制.
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t(8；21)急性髓系白血病CD34-白血病干细胞的确认和特征的体外研究
目的:通过体外实验初步确定t(8;21)急性髓系白血病(AML)中CD34-白血病干细胞(LSC)的存在.方法:检测初诊t(8;21) AML骨髓样本,在荧光抗体标记后利用流式细胞仪分选出3个细胞群:Lin-CD34+ CD38-(简称为CD34+ CD38-)、Lin-CD34+ CD38+(简称为CD34+ CD38+)及Lin-CD34-CD38-CD45dimSSClow(简称为CD34-"LSC”).通过Hochest 33342和派洛宁Y(PY)双染色及乙醛脱氢酶(ALDH)活性检测实验比较各细胞群G0期细胞和ALDHbr细胞比例.分选各细胞群后采用实时定量PCR技术检测AML1-ETO和WT1 mRNA水平.结果:检测3例患者的G0期细胞比例均为CD34-"LSC”＞CD34+ CD38-＞ CD34+ CD38+.配对t检验显示,53例检测的患者CD34-”LSC”及CD34+ CD38-中ALDHbr细胞比例均显著高于CD34+ CD38+中(P=0.0004,P＜0.0001),并且CD34-"LSC”中ALDHbr细胞比例显著高于CD34+ CD38-(P=0.003).3例分选的患者的3群细胞之间AML1-ETO mRNA水平相似,而CD34-" LSC”的WT1 mRNA水平均明显高于另2个细胞群.结论:t(8;21)AML骨髓CD34-细胞群可能含有LSC,并且可能比CD34+ CD38-更原始.
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急性髓系白血病中DKK-3和WIF-1甲基化状态和mRNA表达的研究
目的:研究DKK-3和WIF-1在急性髓系白血病(AML)患者中的启动子甲基化状态和mRNA表达情况及其临床意义.方法:用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)检测56例AML患者骨髓标本和20例缺铁性贫血患者(对照组)骨髓标本中DKK-3和WIF-1启动子甲基化状态;用实时定量PCR检测上述标本中β-catenin、DKK-3和WIF-1mRNA表达情况,并分析其与临床资料及生存时间的关系.结果:AML组中DKK-3和WIF-1启动子甲基化率明显高于对照组(x2=15.330,P＜0.001;x2 =17.371,P＜0.001),且与性别、年龄、临床分型无相关性.DKK-3和WIF-1 mRNA相对表达量在AML患者中依次为0.840±0.320和0.792±0.313,明显低于对照组的1.134±0.392和1.047±0.334(t=3.415,P=0.000;t=3.070,P=0.003).AML患者骨髓标本3-catenin的mRNA相对表达量为0.756±0.304,高于对照组骨髓标本表达量0.342±0.105(t =5.943,P=0.001),且AML骨髓标本中DKK-3和WIF-1 mRNA相对表达量和β-catenin相对表达量呈均呈负相关性(r=-0.543;r=-0.562).Kaplan-Meier生存曲线分析显示,DKK-3甲基化阳性组AML患者总体生存时间短于阴性组患者(x2=3.957,P=0.042),而WIF-1甲基化阳性组AML患者总体生存时间亦短于阴性组患者(x2=4.520,P=0.029).结论:AML患者中Wnt/β-catenin信号通路存在有异常激活,DKK-3和WIF-1启动子甲基化可能参与了Wnt通路激活及AML的发病过程并影响其总体预后.
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黏着斑激酶在急性白血病患者中的表达及其临床意义
目的:观察黏着斑激酶(FAK)在急性白血病(AL)病人白血病细胞中的表达及临床意义.方法:采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测50例AL病人白血病细胞FAK mRNA的表达水平,以10例健康人作为正常对照.收集病人骨髓细胞,用24 h常规培养方法制备染色体,采用R显带技术分析其染色体核型.结果:10名正常人骨髓单个核细胞(MNC)中FAK mRNA阳性表达率为20.0％,50例AL病人白血病细胞FAK mRNA阳性表达率为66.0％,明显高于正常对照组(x2=5.486,P＜0.05);其中急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性非淋巴细胞白血病(ANLL)病人FAK mRNA阳性表达率和表达水平均高于正常对照组(x2=4.436,P＜0.05;t =7.985、5.595,P＜0.05),但ALL与ANLL二者之间相比无显著性差异(x2=0.0299,P＞0.05;t=2.009,P＞0.05).初诊和复发AL病人白血病细胞FAK mRNA阳性表达率和表达水平均明显升高,二者之间无显著性差异(P=1.000,t=1.010,P＞0.05),但均高于正常对照组(x2=9.38,P=0.015;t=8.789,t=7.5756,P＜0.05).缓解组病人FAKmRNA阳性表达率和表达水平明显降低,均低于初诊组和复发组(x2=10.26,P＜0.05;t =4.4359,t=7.822,P＜0.05),而与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05,t=0.5879,P＞0.05).AL病人FAK mRNA的表达与染色体核型的异常改变具有一定的联系,异常核型检出组的表达率和表达水平明显高于未检出组(x2 =5.82,t =6.72,P＜0.05).结论:FAK mRNA在白血病细胞中表达较高,且与疾病的转归相关,可能为白血病的靶向治疗提供新的位点.
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急性髓系白血病中辅助性T细胞Th9分布和转录因子表达
目的:研究急性髓系白血病(AML)中辅助性T细胞9(T helper cell,Th9)的分布及其与疾病临床特征的关系,同时研究Th9中不同转录因子的激活情况.方法:收集102名AML患者及83名健康人外周血样本,应用CD3磁珠法分离健康人及AML患者外周血T细胞,应用实时定量PCR检测IL-9的mRNA表达,应用流式细胞术检测CD4+ IL-9+ (Th9)细胞在疾病各阶段的比率,以及与IL-9共表达的转录因子激活情况.结果:AML-M2和M3型患者外周血T细胞中IL-9的mRNA表达显著高于健康对照者(P＜0.01),同时CD4+ IL-9+细胞比率也明显高于健康对照者(P＜0.01).对M2和M3中Th9细胞分布动态监测结果表明,初诊M2和M3及复发M2组Th9细胞比率及IL-9 mRNA表达显著高于缓解状态下M2和M3患者(P＜0.01).对调控IL-9表达的转录因子共表达分析表明,初诊及复发M2及M3患者的外周血中p-SMAD3+的Th9细胞显著多于缓解时M2及M3患者(P＜0.01);而与之相反,缓解期M2及M3患者外周血中IRE-1+的CD4+ IL-9+细胞显著多于初诊M2及M3患者(P＜0.01).结论:辅助性T细胞Th9细胞在AML-M2和M3中分布显著增高,并且与疾病状态相关;对于Th9细胞的功能预测需要与其转录因子结合进行,后者对AML患者体内肿瘤微环境具有重要意义.
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CXCR7在急性单核细胞白血病中的表达及对THP-1细胞功能的影响
目的:探讨基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)受体CXCR7在急性单核细胞白血病(AML-M5)中的表达,及其对急性单核细胞白血病细胞系THP-1增殖、凋亡和侵袭能力的影响.方法:应用流式细胞术、Western blot、RT-PCR分别检测初诊AML-M5患者和正常人外周血单个核细胞(PBMNC)及THP-1细胞CXCR7蛋白和mRNA表达.CCK8法、Annexin V/PI标记法和Transwell法观察CXCR7对THP-1细胞体外增殖、凋亡和侵袭的作用.结果:在初诊AML-M5患者PBMNC幼稚细胞表面CXCR7表达高于正常对照(P＜0.05),在THP-1细胞表面CXCR7也有高表达;THP-1细胞和AML-M5患者PBMNC中CXCR7蛋白和mRNA水平均明显高于正常对照(P ＜0.05);SDF-1α刺激可增高THP-1细胞增殖活性,但这种增殖活性可被CXCR7抗体抑制(P ＜0.01);CXCR7抗体不影响THP-1细胞凋亡(P＞0.05);CXCR7抗体可明显抑制SDF-1α诱导的THP-1细胞侵袭能力(P＜0.01).结论:CXCR7在急性单核细胞白血病患者及THP-1细胞中均有高表达,并参与细胞增殖和侵袭,阻断CXCR7表达有可能降低急性单核细胞白血病的浸润风险.
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单倍体相合造血干细胞移植治疗幼年型粒单核细胞白血病的临床研究
目的:探讨单倍体相合造血干细胞移植术(haploidentical-HSCT)治疗幼年型粒单核细胞型白血病(JMML)的效果.方法:对6例JMML接受了haploidentical-HSCT患者的造血植入、移植物抗宿主病(GVHD)发生率、并发感染、原发病复发及生存情况等临床资料进行了回顾分析.结果:6例患者全部为男性.供体均为亲缘性单倍体相合供者.接受了haploidentical-HSCT的6位患者的造血干细胞均成功植入,其中2例JMML死于移植后肺部感染,其余4例无病生存至今.3例发生急性GVID,1例发生慢性GVHD.总体生存率66.7％,无病生存率66.7％,复发率0.结论:haploidentical-HSCT是治疗JMML的有效手段.
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自体外周血造血干细胞移植的造血重建分析
目的:探讨自体外周血造血干细胞移植(auto-PBHSCT)过程中造血重建的影响因素.方法:回顾性分析接受auto-PBHSCT的177例病人的造血重建成功率、造血重建时间和移植后28 d造血重建状态,探索造血重建的影响因素.结果:粒系中位植入时间为12(8-21)d,植入率98.9％,均在28 d内植入;血小板中位植入时间为17(7-420)d,植入率95.5％,移植后28 d血小板累积植入率80.8％.单因素分析结果显示,回输CD34+细胞数量和rhTPO的使用是粒细胞植入时间的影响因素;而疾病种类、预处理方案、回输CD34+细胞数量是血小板植入时间的影响因素.多因素分析结果表明,回输CD34+细胞数量是粒细胞植入时间的独立影响因素,而疾病种类、回输CD34+细胞数量是血小板植入时间的独立影响因素.疾病种类和回输CD34+细胞数量是移植后28 d造血重建状态的独立影响因素.结论:对于auto-PBHSCT而言,疾病种类、预处理方案、回输CD34+细胞数量、rhTPO的使用是造血重建的影响因素.
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大剂量甲氨喋呤联合利妥昔单克隆抗体治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤的疗效观察
目的:探讨大剂量甲氨喋呤联合利妥昔单克隆抗体治疗原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)的疗效.方法:选取我科收治的100例原发性中枢神经系统淋巴瘤患者并将他们分为靶向治疗组和传统治疗组,各组50例.靶向治疗组所采用的治疗方法为大剂量甲氨喋呤联合利妥昔单克隆抗体治疗,传统治疗组所采用的治疗方法为传统的大剂量甲氨喋呤与全脑放疗相结合治疗,进行相关的影像学检查,统计两组的一般临床资料、影像学资料、随访结果以及生存时间并进行比较与分析.结果:在靶向治疗组中,完全缓解的病例有33例,病情稳定的病例有9例,部分缓解的有5例,病情有进展的有3例;而在传统治疗组中,完全缓解的病例有29例,病情稳定的病例有5例,部分缓解的有11例,病情进展的有5例.靶向治疗组与传统治疗组的中位无进展生存时间分别为28个月和11个月.结论:临床上首选治疗PCNSL的方案为大剂量甲氨喋呤化疗,与全脑放疗相结合进行治疗,具有一定的疗效,但不良反应较大,有很大可能会出现晚期神经毒性反应.大剂量甲氨喋呤联合利妥昔单克隆抗体治疗PC-NSL,疗效较高,不良反应较少,副作用较小,在治疗老年PCNSL患者方面也具有更积极的价值.
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B细胞分化标志对原发中枢神经系统淋巴瘤预后的影响
目的:探讨B细胞分化标志在119例原发中枢神经系统淋巴瘤患者预后评估中的价值.方法:采用免疫组织化学法测定BCL-2、BCL-6、CD10、MUM1/IRF4蛋白的表达,分析它们与原发中枢神经系统淋巴瘤预后的关系.结果:单因素分析显示,BCL-6+意味着更短的PFS(P=0.047)与OS(P =0.035).多因素分析显示,BCL-6+意味着更短的PFS(HR:1.95,95％CI:1.22-3.12,P=0.005),但与OS不相关(HR:1.85,95％CI:0.71-4.8,P=0.21).Hans分类及单个B细胞标记BCL-2、CD10、Mum1/IRF4与预后不相关.结论:BCL-6+是PCNSL的不良预后标记.
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mTOR抑制剂雷帕霉素对伯基特淋巴瘤细胞增殖抑制的研究
目的:探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂雷帕霉素对伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞和CA46细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响及其作用机制,寻找其靶向治疗方法.方法:采用MTT法观察雷帕霉素对Raji细胞和CA46细胞增殖抑制作用,PI单染流式细胞术分析雷帕霉素对Raji细胞和CA46细胞周期分布的影响,Annexin V-FITC+ PI双染流式细胞术分析雷帕霉素对Raji细胞和CA46细胞凋亡的影响,Western blot法检测雷帕霉素对Raji细胞和CA46细胞RPS6磷酸化水平及survivin、caspase-3蛋白表达水平的影响.结果:雷帕霉素能够明显抑制Raji细胞和CA46细胞的增殖,在雷帕霉素为1 nmol/L时,细胞增殖抑制率即达到20％,表现出雷帕霉素良好的生物活性,且抑制作用具有时间依赖性(r =0.507)和浓度依赖性(r=0.838).不同浓度雷帕霉素分别作用于Raji和CA46细胞24和48 h后,与对照组相比,发现细胞周期处于G1/G0期细胞逐渐增多,S期和G2/M期细胞则逐渐减少,呈现时间依赖性(r =0.961)和浓度依赖性(r =0.947).雷帕霉素100 nmol/L作用于Raji和CA46细胞48 h后,Annexin V+PI双染流式细胞术检测显示细胞明显凋亡,且主要为中晚期凋亡.Western blot法检测显示,雷帕霉素作用于Raji细胞和CA46细胞后,RPS6磷酸水平及survivin表达水平明显降低,caspase-3表达水平明显升高,且具有时间依赖性(r =0.926)和浓度依赖性(r =0.985).结论:雷帕霉素能够通过抑制mTOR下游通路RPS6蛋白磷酸化,进而抑制mTOR/RPS6通路活化,阻滞细胞周期于G1/G0期,达到有效抑制伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞和CA46细胞增殖,同时下调抗凋亡蛋白survivin的表达,激活内源性促凋亡蛋白caspase-3而诱导细胞发生凋亡.
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含吉西他滨的联合化疗方案治疗难治性非霍奇金淋巴瘤疗效
目的:探讨合吉西他滨联合化疗方案治疗难治性非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma,NHL)的临床效果.方法:按照化疗方案不同将82例复发或难治性NHL患者分为2组:吉西他滨+奥沙利铂组(Gem+ Oxa)(42例)和长春瑞滨+奥沙利铂组(Vin+ Oxa)(40例),比较2组患者疗程结束后临床疗效、毒副反应及无进展生存率.结果:Gem+ Oxa组患者总有效率略高于Vin+ Oxa组,但无统计学意义(P＞0.05);2组B细胞淋巴瘤患者临床总有效率均显著高于T细胞淋巴瘤,Ⅰ-Ⅱ期临床总有效率均显著低于Ⅲ-Ⅳ期,差异具有统计学意义(P＜0.05);Gem+ Oxa组患者血小板下降、恶心呕吐及周围神经症状发生率及严重程度均显著低于Vin+ Oxa组(P＜0.05);根据生存时间曲线,两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论:含吉西他滨联合化疗方案治疗NHL临床疗效显著,可明显延长患者无进展生存期,尤其对B细胞淋巴瘤患者以及Ⅲ-Ⅳ期NHL患者效果更佳,可作为治疗难治性NHL的优选方案.
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早期ENKTL患者接受吉西他滨-左旋门冬酰胺酶-奥沙利铂化疗方案与放疗的临床疗效及其影响因素分析
目的:分析早期结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤(ENKTL)患者接受吉西他滨-左旋门冬酰胺酶-奥沙利铂方案化疗与放疗的临床疗效及其影响因素.方法:回顾分析2013年5月至2016年5月期间收治的80例ENKTL患者临床资料.患者分为3组:Ⅰ组(50例)采用GELOX化疗后联合根治性放疗方案,Ⅱ组(16例)采用其他化疗方案后改用GELOX化疗后联合根治性放疗方案,Ⅲ组(14例)为仅接受GELOX化疗方案.全组平均化疗周期为3个周期,全组放疗平均照射总剂量为50.20±3.50.结果:治疗后80例早期结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤(ENK-TL)患者CR率为67.50％ (54/80).Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组接受化疗后CR率分别为45.00％、10.00％、18.00％ (P =0.029).80例患者2年PFS为79.00％,2年OS率为85.00％.Ⅰ组和Ⅲ组的2年PFS率和OS率分别为84.00％和92.00％.Ⅰ组2年OS率、PFS率(96.00％、84.00％)均高于Ⅲ组(47.00％、40.00％) (P =0.045、0.003)和Ⅱ组(50.00％、45.00％) (P =0.001、0.00));而Ⅱ、Ⅲ组之间OS率、PFS率差异无统计学意义(P =0.220、0.97).影响OS和PFS的因素为化疗后缓解情况.结论:临床上采用GELOX诱导化疗联合根治性放疗方案在治疗早期结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤(ENKTL)可以取得良好疗效.
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单中心84例结外NK/T细胞淋巴瘤患者临床特点和预后的回顾性分析
目的:探讨结外NK/T细胞淋巴瘤患者的临床特点、治疗方案及预后的影响因素.方法:回顾性分析2006年6月至2016年6月军事医学科学院附属医院收治的结外NK/T细胞淋巴瘤患者的临床资料,探究其临床特点、疗效及预后的相关因素.结果:共收集到具有完整临床资料的结外NK/T细胞淋巴瘤病例84例,中位随访21(1-123)个月,5年总生存(OS)率和无进展生存(PFS)率分别为58.9％和52.1％.单因素分析结果显示,贫血、EBV-DNA拷贝数、LDH水平、IPI评分、ECOG评分、Ann Arbor分期、首程缓解对NK/T细胞淋巴瘤患者的OS和PFS均具有统计学意义,而化疗方案仅对PFS有统计学意义.多因素分析结果显示,首程缓解、LDH水平及ECOG评分对NK/T细胞淋巴瘤患者的的OS和PFS均有统计学意义.结论:LDH水平、ECOG评分和首程缓解是结外NK/T细胞淋巴瘤的独立预后因素.
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DNMT3b基因在骨髓瘤RPMI8226细胞株中的表达及其生物学意义
目的:研究多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226中DNMT3b基因的表达情况并分析其生物学意义.方法:ELISA方法检测RPMI 8226中DNA甲基转移酶的活性;半定量RT-PCR及实时荧光定量PCR方法检测RPMI 8226细胞中DNMT3b基因mRNA的表达;不同浓度地西他滨干预RPMI8226细胞24h后观察细胞增殖及DNMT3b基因mRNA表达水平的变化.结果:RPMI8226细胞中DNMT活性升高,DNMT3b基因mRNA表达水平升高.不同浓度地西他滨干预24 h后RPMI8226细胞增殖抑制,发生凋亡,DNMT3b基因mRNA表达水平降低.结论:骨髓瘤RP-MI8226细胞中DNMT3b基因表达水平升高,地西他滨可能通过抑制DNMT3b表达从而抑制RPMI8226细胞增殖并诱导其凋亡.因此,DNMT3b有望作为骨髓瘤治疗的新靶点.
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NS-398联合硼替佐米对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的增殖抑制作用
目的:观察NS-398能否增强多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞对硼替佐米(BOR)的化疗敏感性.方法:NS-398与BOR联用后,用MTT法测定对体外培养的RPMI 8226细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测对细胞周期和凋亡的影响;ELISA法检测细胞的Caspase-3活性;Cox-2试剂盒定量检测各组细胞Cox-2的活性.结果:NS-398联合BOR对RPMI 8226细胞的增殖抑制率大于单用组(Q＞0.85);NS-398联合BOR使RPMI 8226细胞阻滞于Go/G1期,细胞凋亡率明显高于单用组(Q＞1.15);NS-398联合BOR组细胞的Caspase-3的活性高于单用组(Q＞1.15).结论:NS-398具有协同增强BOR体外抗骨髓瘤RPMI 8226细胞的作用.
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骨髓单个核细胞中B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1表达对多发性骨髓瘤患者预后的影响
目的:研究分析骨髓单个核细胞中B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1(B lymphocyte induced maturation protein 1,Blimp1)的表达对多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)预后的影响.方法:选取本院2014年1月-2015年1月期间收治的48例MM患者,检测所有入组患者骨髓中Blimp1表达水平,依据Blimp1转录表达水平的中位值将入组患者分为低表达组(L组,22例)和高表达组(H组,26例),比较分析Blimp1不同表达水平的相关影响因素,比较Blimp1不同表达水平患者的临床疗效、免疫表型变化及无进展生存期差异.结果:2组患者在性别、年龄、分型、分期及治疗阶段等方面均无统计学差异(P＞0.05).低表达组总缓解率明显高于高表达组,差异有统计学意义(P＜0.05).治疗前两组患者CD19、CD38、CD56、CD138及微小病灶残留阳性率均无统计学差异(P＞0.05);治疗后低表达组患者CD38、CD56、CD138及微小病灶残留阳性表达率均明显低于高表达组,CD19+表达率明显高于高表达组(P＜0.05).低表达组1、2、3年无进展生存期(PFS)均明显高于高表达组(P＜0.05).结论:分期越高,治疗难度越大的MM,其患者Blimp1表达水平越高,低B limp1表达水平的患者,其临床疗效及预后均明显优于高表达患者.
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57例多发性骨髓瘤患者生存及预后因素分析
目的:探讨初诊多发性骨髓瘤(MM)患者临床相关指标水平和临床分期与患者预后关系,以期能更准确地评估患者病情并指导临床治疗.方法:回顾性分析57例收治的确诊MM患者的年龄、白细胞计数、血小板计数、FISH、ISS分期、kappa轻链水平、lammda轻链水平等指标,通过Kaplan-Meier和Cox回归生存分析模型,对多发性骨髓瘤预后影响因素进行单因素以及多因素分析,评价影响MM患者预后因素.结果:57例患者中位年龄63(29-81)岁,男25例,女32例.中位生存期(OS) 37.3个月,中位无进展生存期(PFS) 36.3个月,3年生存率73.6％,3年无进展生存率56.1％.单因素分析显示,年龄、白细胞计数、血小板计数、HSH结果、ISS分期、kappa轻链水平、lammda轻链水平以及缓解情况为影响患者预后的危险因素,具有统计学意义.多因素分析显示,kappa轻链水平≥19.4 mg/L以及血小板计数＜100×109/L为影响多发性骨髓瘤患者预后的独立危险因素.结论:高kappa轻链及低血小板计数的MM患者的临床预后极差,对初治的高kappa轻链及低血小板计数的MM患者治疗方案的选择应加以区别,有益于提高患者生存时间.
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IgG型和IgA型多发性骨髓瘤患者血清总轻链κ/λ比值与骨髓浆细胞比例相关性分析
目的:探讨IgG型和IgA型多发性骨髓瘤(MM)患者血清总轻链κ/λ比值(serum total light chain κ/λratio,sTLC-κ/λ)与骨髓浆细胞(bone marrow plasma cells,BMPC)比例的关系及其临床意义.方法:采用速率散射免疫比浊法检测79例初诊IgG型(n=52)和IgA型(n=27) MM患者血清kG、IgA、κ和λ-sTLC含量,并计算sTLC-κ/λ比值;同期进行骨髓穿刺涂片检查BMPC比例,并追踪观察治疗中19例的IgG型(n=16)和IgA型(n=3)MM患者sTLC-κ/λ比值和BMPC比例的动态变化.将26例非浆细胞增殖性疾病患者设为对照组.结果:IgGκ型和IgAκ型MM的sTLC-κ/λ比值显著高于对照组(P＜0.01),IgGλ型和IgAλ型MM的sTLC-κ/λ比值显著低于对照组(P＜0.01);IgGκ型MM的sTLC-κ/λ比值显著高于IgAκ型MM(P ＜0.01),而IgGλ型MM的sTLC-κ/λ比值显著低于IgAλ型MM(P ＜0.01).IgGκ型和IgAκ型MM的sTLC-κ/λ比值分别与IgG和IgA浓度水平均呈显著正相关(r=0.778,P=0.000和r=0.601,P=0.039),而IgGλ型和IgAλ型MM的sTLC-κ/λ比值分别与IgG和IgA浓度水平均呈显著负相关(r=-0.586,P=0.01和r=-0.718,P=0.003).此外,除了IgGκ型MM患者的sTLC-κ/λ比值与BMPC比例呈正相关(r=0.579,P=0.002)之外,其余各型MM患者的sTLC-κ/λ比值与BMPC比例之间均无显著相关性.然而,在19例IgG型和IgA型MM患者复查结果中,有18例患者的sTLC-κ/λ比值与BMPC比例变化一致.结论:IgG型和IgA型Ml患者sTLC-κ/λ比值与BMPC比例相关性较低,但同一患者的sTLC-κ/λ比值与BMPC比例变化高度一致,提示sTLC-κ/λ比值对IgG型和IgA型MM诊断和病情监测具有重要意义.
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T淋巴细胞亚群及外周血IL-17、IL-35和IFN-γ在多发性骨髓瘤患者中的水平及其临床意义
目的:探讨外周血T淋巴细胞亚群、调节性T细胞(Treg)、白介素IL-17、IL-35和γ-干扰素(IFN-γ)在多发性骨髓瘤(MM)患者中的水平及其临床意义.方法:选取2014年1月-2017年1月医院收治的86例多发性骨髓瘤患者作为MM组,并选取同时期体检健康者30例为对照组.应用流式细胞术检测外周血CD4+/CD8+T细胞比例和CD4+ CD25high/+ CD127low/-调节性T水平,ELISA法检测血清IL-17、IL-35和IFN-γ表达水平;比较各组不同指标间的差异.结果:与对照组比较,多发性骨髓瘤患者CD4+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比例降低,CD8+T细胞、Treg细胞比例升高;MMⅢ期患者的T淋巴细胞亚群与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);随着临床分期的提高,Treg细胞呈现增高趋势;MMⅢ期rreg细胞水平明显高于Ⅰ期(P＜0.05);血清IL-17水平依次为MM Ⅲ期＞Ⅱ期＞Ⅰ期＞对照组,血清IL-35和IFN-γ水平依次为对照组＞Ⅰ期＞Ⅱ期＞Ⅲ期(P＜0.05);Treg细胞比例依次为进展期＞稳定期＞对照组(P＜0.05);血清IL-17水平进展期＞稳定期＞对照组,血清IL-35和IFN-γ水平则对照组＞稳定期＞进展期(P＜0.05).结论:T淋巴细胞亚群、调节性T细胞、IL-17、IL-35和IFN-γ水平异常与多发性骨髓瘤患者疾病进展及预后相关.
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重组人红细胞生成素对骨髓瘤细胞株MPC-11作用的体外研究
目的:探讨重组人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)在体外对骨髓瘤细胞株有无抗瘤作用及其作用机制,以便为rhEPO治疗多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)提供理论依据.方法:取对数生长期骨髓瘤细胞株MPC-11细胞以1×104/ml密度接种入96孔培养板中.实验设置对照组及rhEPO组(rhEPO终浓度分别为20、40、60、80、100、200、400 U/ml).在细胞培养后收集各时间点(1、2、3、4、5、6d)各组细胞,应用CCK-8法检测各组细胞的增殖活性,Annexin V/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡情况,并提取各组细胞上清液,用酶联免疫定量分析(ELISA)法检测细胞上清液中IL-6、IgG和kappa轻链的水平.结果:流式细胞术结果显示:经200 U/ml rhEPO处理后的MPC-11细胞在培养21 d后细胞凋亡率明显高于对照组(P＜0.05);经400 U/mlrhEPO处理后的MPC-11细胞分别培养10、15、21 d后,其细胞凋亡率均分别高于相同时间节点的对照组(P＜0.05),且细胞凋亡率随rhEPO浓度的增加和作用时间的延长而增高(P＜0.05).ELISA结果显示:rhEPO作用MPC-11细胞株15 d,400 U/ml rhEPO组细胞上清液中IL-6水平低于对照组(P＜0.05);而在21d,经100、200、400U/ml rhEPO作用下细胞上清液中的IL-6水平降低(P＜0.05);培养21 d时,400 U/ml rhEPO组细胞上清液中的IgG、Kappa轻链水平均明显低于对照组(P＜0.05).结论:rhEPO可明显诱导MPC-11骨髓瘤细胞株凋亡,且与剂量和时间相关;可降低MPC-11细胞株所分泌的IgG、Kappa轻链水平,且与作用时间呈正向变化关系.
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基于血清多肽组学的多发性骨髓瘤肾脏损害标记物的筛选
目的:筛选与多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)肾脏损害有关的血清多肽,寻找MI患者肾脏损害的早期标记物.方法:采用弱阳离子交换磁珠联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对临床上确诊的MM患者伴或不伴肾脏损害的血清多肽组进行对比分析.结果:在分子量为700-10 000 Da的范围内共获得18个有统计学意义的差异多肽峰(P＜0.05),其中表达上调的多肽有7个,下调的有11个.利用内嵌软件将其中区分MM患者是否伴有肾脏损害的能力强的3个质谱峰建成了1个QC(Quick Classifier)诊断模型,其敏感性为97.14％,特异性为94.12％;其中分子量为3 908.85 Da和3 216.06 Da的多肽在MM伴肾脏损害组中表达明显上调,而分子量为2 990.08 Da的多肽在MM伴肾脏损害组中明显下调.结论:利用血清多肽组学技术获得的与MM肾脏损害有关的多肽,可为临床上早期评估和诊断MM肾脏损害提供新的线索.
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地西他滨联合小剂量IA方案治疗骨髓增生异常综合征伴原始细胞增多的临床观察
目的:观察地西他滨联合小剂量去甲氧柔红霉素、阿糖胞苷(DAC+ IA)方案治疗骨髓增生异常综合征伴原始细胞增多的临床疗效.方法:回顾性分析2015年6月-2017年1月在西安交通大学第一附属医院血液科治疗的37例骨髓增生异常综合征伴原始细胞增多患者,分别采用DAC+ IA方案(19例)和单用DAC(18例)方案治疗,观察其临床疗效和不良反应.结果:1-2疗程后,DAC+ IA组CR+ CRi率为57.9％,总反应率100％,骨髓病理组织幼稚细胞明显减少,外周血中性粒细胞、血红蛋白、血小板水平显著提高,完全缓解中位持续时间7.3月,无进展生存时间为10月,3例患者缓解后停止治疗,3.5月复发.DAC组CR+ CRi率为16.7％,总反应率38.9％,中位无进展生存时间为6月.3例患者达到完全缓解,中位时间4个月均进展为AML.两组患者常见的不良反应为骨髓抑制和感染,其差异无统计学意义.结论:DAC联合小剂量IA方案治疗骨髓增生异常综合征伴原始细胞增多,可延长患者生存期,改善生存质量,近期疗效显著,但远期疗效仍有待于异基因造血干细胞移植进行巩固.
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低剂量地西他滨序贯CAG方案治疗MDS-难治性贫血伴有原始细胞过多的临床疗效
目的:通过回顾性分析探讨低剂量地西他滨序贯CAG方案治疗骨髓增生异常综合征-难治性贫血伴有原始细胞过多(MDS-RAEB)的临床疗效.方法:将我院收治的接受低剂量地西他滨序贯CAG方案治疗的36例MDS-RAEB患者,纳入地西他滨序贯CAG组;同期将单用地西他滨治疗的MDS-RAEB 40例患者作为对照,比较2组患者临床特征、疗效及不良反应等.结果:序贯CAG组总有效率(ORR)[完全缓解(CR)+部分缓解(PR)+血液学改善(HI)]为83.3％ (30/36),明显高于单用地西他滨ORR 62.5％ (25/40)(P=0.043),2组不良反应比较无显著差别.地西他滨序贯CAG组常见的不良反应为3度以上的血细胞减少和感染,在治疗早期(第1-2疗程)比较常见,治疗有效后上述不良反应逐渐减少,其他非血液学不良反应少见.结论:地西他滨序贯CAG方案治疗MDS-RAEB比单用地西他滨疗效更确切,此方案对不适合行造血干细胞移植的患者可能有重要的临床价值.
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稳定表达GFP的骨髓增生异常综合征转白血病细胞株的建立
目的:建立稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的骨髓增生异常综合征转白血病的细胞株,评价其生物学特性及其应用.方法:以人骨髓增生异常综合征转化为白血病细胞系SKM-1为母系细胞,通过携带GFP基因的慢病毒进行转染,以有限稀释法获得GFP阳性的单细胞克隆,并将扩大培养后的细胞通过皮下注射的方式进一步在小鼠体内筛选,致瘤后将瘤块分离,继续进行培养,获得SKM-1/GFP细胞株.通过荧光倒置显微镜观察细胞形态,应用流式细胞术检测细胞荧光表达水平,应用CCK-8法检测细胞生长特性,将扩大培养后的SKM-1/GFP细胞接种在免疫缺陷小鼠的皮下,致瘤后观察瘤块以及各个脏器组织的浸润情况.结果:SKM-1/GFP细胞形态和生长特性与SKM-1母系细胞无差异,流式细胞术检测GFP的表达率为100％,体外CCK-8法检测生长曲线显示,SKM-1/GFP细胞与母系SKM-1细胞无明显差异.将SKM-1/GFP细胞接种于NOD/SCID小鼠皮下,14d时可见瘤块形成.30 d时,在荧光显微镜下观察荷瘤小鼠,可见瘤块自发荧光.在荧光显微镜下观察肿块冰冻切片,可见较为均一的GFP阳性细胞.冰冻切片显示,小鼠心、肝、胃、肾均有肿瘤细胞浸润.结论:成功建立了稳定表达GFP的骨髓增生异常综合征转白细胞株SKM-1/GFP,该细胞株可以灵敏地追踪肿瘤细胞,应用于微小残留病的研究,为研究骨髓增生异常综合征转化的急性白血病提供一个新的实验平台.
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地西他滨对MDS-L细胞增殖的抑制作用及其相关作用机制研究
目的:探讨去甲基化药物地西他滨(Decitabine,DAC)的不同剂量对MDS-RAEB(骨髓增生异常综合征-原始细胞增多型)细胞株MDS-L细胞增殖的抑制作用及其相关作用机制.方法:采用LC-MS/MS生物分析法检测应用DAC 20和15 mg/m2×5d的两组MDS患者血药浓度水平;模拟患者的血药浓度,设计不同剂量的DAC(0.5、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025和0.01 μg/ml)作用于MDS-L细胞24、48、72和96 h,用CCK-8法检测细胞的增殖抑制效应;光学显微镜下观察细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞周期变化及凋亡情况;PCR检测DAC作用后MDS-L细胞P15的甲基化水平的变化.结果:注射结束即刻,DAC 20 mg/m2 ×5 d组患者血药浓度为174.08±80.15(84.7-311) ng/ml,明显高于15 mg/m2×5d组的89.87±32.94(43.2-165)ng/ml(P =0.014).DAC对MDS-L细胞有明显增殖抑制作用,且呈时间浓度依赖关系(r=0.786),但DAC≥0.1 μg/ml浓度时,各浓度对细胞的抑制作用无明显差异.DAC处理后G1期细胞明显增多,而S期细胞明显减少.与对照组相比,MDS-L细胞经DAC 0.01、0.025、0.05、0.1、0.2 μg/ml作用96 h后,P15INK4B表达均下降,但各浓度之间无显著差异(P＞0.05).结论:低浓度DAC对MDS-L细胞有明显增殖抑制作用,在0.1和0.2μg/ml浓度时,对MDS-L细胞的抑制作用达理想范围.DAC可以将MDS-L细胞阻滞在G1期,阻止G1期细胞向S期细胞转化.
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microRNA-223调控人胚胎干细胞向树突细胞分化
目的:建立人胚胎干细胞(ESC)向树突细胞诱导分化的新策略,探讨microRNA-223(miR-223)在人胚胎干细胞源树突细胞产生过程中的调控作用及其分子机制.方法:采用人胚胎干细胞在胞外基质Ⅳ型胶原蛋白上直接贴壁培养,加入造血生长因子分步向造血干/祖细胞、共同髓系祖细胞和树突细胞诱导的方案,通过形态学、流式细胞术和造血集落形成实验鉴定分化细胞;人胚胎干细胞经慢病毒转染过表达miR-223或抑制其表达后启动向树突细胞分化,比较不同miR-223表达水平下分化细胞中造血集落形成的数目和表面标记物的表达量;应用双荧光素酶报告基因检测验证TGFBR3是miR-223发挥作用的直接靶标.结果:人ES细胞成功诱导为树突细胞,分化细胞中表达CD83比例可达82％,在整个分化过程中miR-223表达呈上调趋势;添加miR-223模拟物组分化细胞表达CD34+ CD45+、CD34+ CD45+以及CD83+的比例均显著高于添加miR-223抑制剂组和阴性对照组(P＜0.05);添加miR-223抑制剂组分化细胞表达各阶段细胞标记物显著低于阴性对照组(P ＜0.05);添加miR-223模拟物组分化细胞出现大约759个CFU/105细胞数,显著高于其它各组(P＜0.05);双荧光素酶报告基因结果显示,miR-223显著抑制TGFBR3-3'UTR结构的荧光素酶活性(下降了37％)(P＜0.05),而且TGFBR3-3'UTR突变型的荧光素酶活性显著高于野生型(P＜0.01);随着向树突细胞分化成熟,添加miR-223模拟物组分化细胞表达TGFBR3水平逐渐下降,而添加miR-223抑制剂组由于内源性miR-223受到抑制而明显上调TGFBR3的表达.结论:miR-223调控人胚胎干细胞向树突细胞分化,可能通过直接作用于靶标TGFBR3而促进胚胎干细胞源树突细胞的产生.
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MiR-486通过调控Sirt1调节TF-1细胞的糖代谢
目的:探索低氧条件下造血细胞miR-486表达变化及miR-486对造血细胞糖代谢的调控作用及机制.方法:利用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法检测低氧条件下TF-1细胞miR-486及Sirt1的表达水平.用慢病毒技术将miR-486过表达或沉默后检测Sirt1、葡萄糖转运因子1(glucose transporter 1,Glut1)和葡萄糖转运因子4 (glucose transporter 4,Glut4)的表达水平.另外,将Sirt1沉默后分别用qRT-PCR及Western blot检测Sirt1的表达,并用qRT-PCR检测Glut1和Glut4的表达水平.结果:低氧促进miR-486的表达并抑制Sirt1的表达;过表达miR-486导致Sirt1的表达下调,而沉默miR-486可以促进Sirt1的表达;过表达miR-486上调Glut1和Glut4的表达,而沉默miR-486则抑制Glut1和Glut4的表达;沉默Sirt1可以促进Glut1和Glut4的表达.结论:MiR-486可以通过影响Sirt1调节TF-1细胞的糖代谢.
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重组人干细胞因子对重症急性放射病猴的治疗作用研究
目的:观察重组人干细胞因子(rhSCF)于照射后早期给药对重症骨髓型急性放射病猴的救治作用.方法:12只成年恒河猴经7.0 Gyγ射线全身照射后分为照射对照和SCF给药2组(n=6).SCF组恒河猴于照射后0.5和24h各1次皮下注射rhSCF 200 μg/kg,给照射对照组皮下注射等体积生理盐水.观察照射后40 d内恒河猴的存活情况,并于不同时间检测外周血象,比较照射对照组和SCF组间的差异.结果:照射后40 d内对照组恒河猴存活2只,而SCF组恒河猴全部存活.rhSCF能促进恒河猴造血恢复,其外周血白细胞数、中性粒细胞数和血小板水平的低值较照射对照组显著提高.SCF组恒河猴对症治疗简化.结论:rhSCF于照射后早期干预对重症急性放射病恒河猴有明显的救治作用.
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ZNF300促进巨核细胞分化
目的:研究ZNF300对巨核细胞分化和增殖的影响.方法:通过公共数据分析及定量RT-PCR方法检测ZNF300表达水平以研究ZNF300与白血病及巨核细胞分化的相关性;使用慢病毒和逆转录病毒感染介导过表达ZNF300,使用流式细胞术、MTT比色法、集落形成试验分析K562细胞和原代小鼠骨髓细胞向巨核细胞分化、增殖的情况;应用细胞浆和细胞质蛋白分离结合蛋白印迹实验方法检测ZNF300亚细胞定位;并应用双荧光素酶试验和用ChIP-qPCR技术探讨ZNF300调控的靶基因.结果:ZNF300表达水平伴随巨核细胞的分化而升高;TPA诱导后巨核细胞分化的表面标记CD41、CD61在过表达ZNF300的K562细胞明显比对照细胞增多.同时,ZNF300显著降低K562细胞增殖率、阻滞G1ME细胞周期并降低小鼠骨髓细胞集落形成单位.ZNF300蛋白主要位于细胞核内,能够结合在C-MYC基因的启动子区并增强启动子活性.结论:过表达ZNF300可促进巨核细胞分化.
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P2X7R抑制剂BBG对小鼠异基因造血干细胞移植后aGVHD的抑制作用研究
目的:探讨P2X7R抑制剂酸性亮蓝G(brilliant blue G,BBG)对小鼠异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生的影响.方法:建立小鼠allo-HSCT后并发aGVHD模型,通过不同剂量P2X7R抑制剂BBG(50和75 mg/kg)给药处理,观察受鼠生存情况、体重变化,检测肝脏病理变化及肝功能改变,检测肝脏P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA及相关蛋白表达的变化.结果:成功建立小鼠allo-HSCT后并发aGVHD模型.腹腔注射BBG可减轻受鼠弓背、竖毛、皮肤剥脱、体重下降等aGVHD的临床表现;减轻受鼠肝脏水肿、出血、坏死等病理改变,改善受鼠的肝功能;降低受鼠肝脏P2X7R、IL-13蛋白的表达;降低受鼠肝脏P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-13、IL-18因子mRNA表达;且aGVHD+ 75 mg/kg BBG组受鼠各项指标变化为显著.结论:BBG可减轻allo-HSCT后aGVHD引起的肝脏炎性损伤,减少炎性因子分泌,且75 mg/kg BBG组的保护作用优于50 mg/kg BBG组.
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血栓弹力图预测静脉血栓栓塞症发生的价值分析
目的:系统搜集有关血栓弹力图预测静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism,VTE)的临床研究文献,评价血栓弹力图在预测血栓发生事件中的应用价值.方法:计算机检索PubMed,Central,Embase数据库中的相关临床实验研究文献,并手工检索相关参考文献,然后运用QUADAS-2工具对纳入文献的质量进行评价,终对纳入的研究进行定性分析.结果:共纳入研究15篇,涉及293名VTE患者.纳入文献的质量及血栓弹力图预测VTE的准确性参差不齐.三分之二的研究显示,血栓弹力图参数的变化可以预测VTE的发生.结论:目前的研究显示,血栓弹力图预测VTE的准确性差异较大.血栓弹力图联合血栓与止血的其它实验室检测指标可能会提高预测VTE发生的准确性.
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单纯抗凝及其与接触性导管溶栓联合抗凝治疗下肢深静脉血栓的效果比较
目的:对比单纯抗凝(anticoagulation,AC)与接触性导管溶栓联合抗凝(catheter-directed thrombolysis,CDT)治疗下肢深静脉血栓(DVT)的效果.方法:选取本院2011年5月-2013年9月收治的139例DVT患者,根据随机数字表法分为AC组(n=66)与CDT+ AC组(n=73),观察两组溶栓效果、不良反应、血栓后综合症(PTS)和生活质量情况.结果:两组患者在治疗期间和治疗结束后均无严重的不良反应发生,其中CDT组有2例穿刺处血肿,l例血尿,2例牙龈出血;AC组有1例牙龈出血,1例血肿.与AC组相比,CDT+AC组患者中Ⅰ级溶解的人数显著降低(60.61％ vs 9.59％)(P＜ 0.05),Ⅲ级溶解的人数显著升高(7.57％ vs49.31％)(P＜ 0.05).随访期间,两组的PTS发病率均呈逐渐增高趋势,但无l例患者出现重度PTS.CDT+AC组患者在第12个月和18个月时的PTS发病率均较AC组显著降低(17.81％ vs 33.33％,24.66％ vs43.94％)(P＜ 0.05).与AC组相比,CDT+AC组在第6个月、12个月及18个月时生理职能和活力评分均显著升高(P＜0.05).结论:接触性导管溶栓联合单纯抗凝治疗下肢深静脉血栓形成疗效显著,安全性高,而且有利于患者生活质量的改善.
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1例Aα链Arg16突变所致遗传性异常纤维蛋白原血症家系研究
目的:1例遗传性异常纤维蛋白原血症家系的表型及基因型分析.方法:用血凝仪检测凝血指标,Clauss法检测纤维蛋白原活性,血浆蛋白电泳检测纤维蛋白原含量,Native-PAGE检测血浆纤维蛋白原及其片段分布,应用PCR扩增纤维蛋白原基因FGA、FGB和FGC所有外显子及其侧翼序列,PCR产物纯化后直接测序并进行基因分析.结果:先证者APTr正常,PT、TT明显延长;纤维蛋白原含量正常而活性降低,先证者姊妹及其女儿的检测结果与之相似,患者配偶所有指标均正常.基因分析显示,先证者纤维蛋白原FGA基因2号外显子g1233-a杂合碱基改变(密码子CGT→CAT),导致了Arg16His错义突变,该突变来源于父系.结论:该错义突变是导致遗传性异常纤维蛋白原血症的原因.
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生血合剂联合骨髓腔输血给药治疗再生障碍性贫血研究
目的:研究生血合剂联合骨髓腔输血给药治疗再生障碍性贫血的疗效及安全性.方法:2011年至2015年,陕西医大血液病研究院对收住的53例再生障碍性贫血(脾肾两虚证)患者应用生血合剂200 ml,口服,2/d;司坦唑醇2 mg,3/d;吗替麦考酚酯成人1.0g,2/d;骨髓腔输注:重组人红细胞生成素10000 U、重组人粒细胞刺激因子450μg、重组人白介素-11 4.5 mg、地塞米松注射液20 mg,骨髓腔注射,1周1次,共4次.治疗1月,观察血象和骨髓.出院后巩固治疗3-6个月,观察疗效,随访1年以上.结果:治疗1个月,基本治愈40例(75.47％)、缓解8例(15.09％);Hb、WBC及Plt与治疗前对比,均有显著好转(P＜0.01),有效率90.57％(48例);骨髓增生活跃者46例(86.79％),与治疗前9例(16.98％)相比,有好转(P＜0.05);治疗3-6个月,基本治愈40例(75.47％),缓解8例(15.09％),明显进步3例(5.66％)、无效2例(3.77％),基本治愈率和缓解率90.57％(48/53例),明显进步率5.66％,总有效率96.23(51/53例),治疗后检查无明显毒副作用.随访1年无复发.结论:生血合剂联合骨髓腔输血给药,是一种较好的治疗方法.
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FeCl3损伤小鼠肠系膜小动脉血栓模型的主要影响因素
目的:探讨FeCl3损伤小鼠肠系膜小动脉血栓模型的主要影响因素.方法:通过下腔静脉获取C57Bl/6小鼠全血,用Calcein-AM标记洗涤血小板,将荧光标记的血小板输入受体鼠眼球后静脉窦,进入血液循环系统.实验分为回输血小板数1×107、1×108和2×108 3组;小鼠的周龄分为3-6、6-10和＞10周3组;FeCl3浓度分为6％、12％、24％、48％4个组.血管堵塞时间在10-20 min内,且栓子形成后15 s不脱落即为此模型建立成功.观察回输血小板的数量、小鼠的周龄、FeCl3的浓度、滤纸片的大小等因素对建立肠系膜小动脉血栓模型的影响.结果:3-6周龄雄鼠血管堵塞时间为16 min,时间相比6-10周的(25 min)短(P＜0.05),＞10周(38 min)短(P＜0.叭);1×108和2×108的回输血小板数血管堵塞时间约15-18min,时间相比1×107(30 min)的短;6％和12％的FeCl3的血管堵塞时间在15-20 min之间,但是24％和48％的FeCl3一般在10 min以内就会出现血管堵塞现象.结论:FeCl3损伤的小鼠肠系膜小动脉血栓模型的成功建立受很多因素影响.3-6周龄C57Bl/6雄鼠、回输血小板数(1-2) ×108和6％-12％ FeCl3可成功建立肠系膜小动脉血栓模型.
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nCD64与CD14指数对血液肿瘤合并细菌感染的诊断价值
目的:探讨外周血nCD64和CD14指数在血液肿瘤合并细菌感染中的诊断价值.方法:选取血液肿瘤患者64例,其中细菌感染组33例,非感染组31例.用流式细胞仪检测外周血nCD64和CD14相关指标,并计算nCD64 IND及CD14 IND,同时测定WBC、ESR、CRP.结果:两组指标相比,nCD64 IND、CRP差异有统计学意义(P＜0.05),CD14 IND、ESR、WBC差异无统计学意义(P＞0.05).绘制ROC曲线,可见曲线下面积CD64 IND(0.974)＞ CRP (0.786)＞ESR(0.675)＞WBC(0.598)＞CD14 IND (0.556),与标准面积0.5相比CD64 IND、CRP、ESR统计学差异显著(P＜0.05),CD14 IND、WBC统计学差异不显著(P＞0.05).结论:nCD64对合并细菌感染的血液肿瘤的诊断具有较高价值,其灵敏度及特异性均高于CRP及ESR.
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ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对慢性高原病患者骨髓有核红细胞中Ras、BRaf、MEK、ERK1/2表达的影响
目的:探讨ERK1/2信号通路阻断剂PD98059对Ras、B型丝/苏氨酸蛋白激酶(BRaf)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、细胞信号调节激酶1/2 (ERK1/2)表达的影响,以期为慢性高原病(chronic mountain sickness,CMS)的基础研究和临床治疗探讨新的途径.方法:选取CMS患者16例,取骨髓液分离单个核细胞,以CD71与CD235a抗体磁珠分选阳性细胞,将细胞分为5组:空白对照组、DMSO溶剂组及PD98059 5、10和20 μmol/L组.在低氧条件下培养72 h,应用ELISA法测定培养骨髓有核红细胞上清液中Ras-GTP水平,RT-PCR法测定骨髓有核红细胞中BRaf、MEK、ERK1/2 mRNA的表达,Western blot方法检测骨髓有核红细胞中p-BRaf、p-MEK、p-ERK1/2蛋白表达.结果:PD98059对各组Ras-GTP的水平无明显影响(P=0.798).溶剂组与空白对照组相比,BRaf、MEK mRNA的表达水平差异无统计学意义(P =0.826、P=0.298).与PD98059 20 mol/L比较,其余4组ERK1/2 mRNA的表达水平差异有统计学意义(P =0.001、P=0.002).溶剂组与空白对照组相比,p-BRaf、p-MEK蛋白的表达差异无统计学意义(P =0.370、P=0.351).与PD98059 20 mol/L比较,其余4组p-ERK1/2蛋白水平差异有统计学意义(P ＜0.001、P＜0.007).结论:PD98059能下调骨髓有核红细胞ERK1/2 mRNA及p-ERK1/2蛋白的表达.Ras/Raf/MEK/ERK 1/2通路是调控CMS骨髓有核红细胞的主要信号传导途径,可能参与了慢性高原病的发病过程.
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Bruton酪氨酸激酶泛素化调节的研究
目的:探讨Bruton酪氨酸激酶(Bruton's Tyrosine Kinase,Btk)的代谢调节途径和可能的分子机制.方法:用蛋白酶体抑制剂和/或佛波酯(PMA)处理内源性表达Btk的B细胞系A20、Ramos细胞及转染了外源性Btk的293T、COS-7细胞,应用RT-PCR法检测上述细胞Btk mRNA表达水平,Western blot法检测Btk蛋白表达水平;通过抗IgM抗体交联BCR刺激A20细胞,检测细胞Btk泛素化水平;用Btk、泛素和Cbl共转染COS-7细胞,检测其泛素化Btk水平;用Btk和编码野生型或突变型泛素(K29R、K48R、K63R)即单泛素的质粒共转染293T细胞,经蛋白酶体抑制剂处理后用抗泛素抗体和抗Btk抗体检测泛素化Btk水平;稳定转染并表达Btk-GFP的293T细胞经氯喹处理后,应用Western blot检测其Btk蛋白表达水平.结果:蛋白酶体特异性抑制剂和/或佛波酯可减少Btk转录,从而引起Btk蛋白表达下降.Btk通过泛素化进行翻译后修饰,泛素化修饰程度与Btk的表达及活化水平有关.Cbl为Btk的E3泛素连接酶,它可导致Btk泛素化.Btk受多聚和/或单泛素化调节,Btk可在溶酶体内发生泛素化和降解,溶酶体抑制剂氯喹可上调Btk的表达.结论:Btk蛋白的表达水平受泛素化途径调节,该调节与Btk的表达水平有关.
| 年 | 期数 |
| 2019 | 01 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 |
| 2000 | 01 02 03 04 |
