SDF-1/CXCR4轴与白血病血管新生研究进展

基质细胞衍生因子-1(SDF-1)及其受体CXCR4所构成的SDF-1/CXCR4轴生物效应的研究近些年来进展迅速,其在肿瘤发生及发展中起重要作用,并与肿瘤血管新生密切相关,本文就SDF-1及其受体CXCR4,SDF-1/CXCR4轴在白血病细胞中的表达,SDF-1/CXCR4轴与白血病血管新生的关系,抗SDF-1/CXCR4抑制剂在血管新生治疗中的应用的研究进展加以综述.

肝素/血小板因子4抗体与肝素诱导的血小板减少症

肝素诱导的血小板减少症(heparin-induced thrombocytopenia,HIT)是肝素治疗引起的严重并发症,可导致血栓形成和栓塞.HIT的发病机制主要与肝素/血小板因子4抗体介导的免疫反应有关,IgC类是主要的致病抗体,能与肝素和血小板因子4结合形成复合物,引起血小板凝集和凝血反应增强,同时抗体还通过作用于血管内皮细胞和单核细胞参与HIT的形成.抗体相关的实验室检测包括功能性血小板试验和免疫学试验,临床表现结合实验室检测有助于本病的早期诊断和治疗,但是在检测方面目前尚没有理想的方法.本文就AHPF4抗体、HIT发病机制、临床实验室检测和免疫学试验检测等问题进行了综述.

SDF-1/CXCR4与多发性骨髓瘤溶骨性病变的关系

多发性骨髓瘤(MM)患者的溶骨性破坏是主要的临床问题,其机制与骨髓瘤细胞或骨髓微环境的细胞产生破骨细胞激活因子刺激破骨细胞生成有关,SDF-1a是骨髓瘤骨病发病中的一个重要因子,也是治疗多发性骨髓瘤骨病潜在的靶目标.本文就SDF-1/CXCR4的结构,SDF-1/CXCR4在MM患者骨微环境中的表达及对破骨细胞的作用、血浆SDF-1和骨髓瘤细胞CXCR4的表达与MM溶骨病变及预后的关系、SDF-1/CXCR4是治疗骨髓瘤骨病的潜在靶标进行了综述.

福建省RhD阴性个体RHD基因多态性

为了探讨RhD阴性福建个体的RHD基因结构,设计14对序列特异性引物,应用PCR-SSP技术检测104名福建省RhD阴性献血者的RH基因型,并对部分样本进行吸收放散试验,同时对2例携带RHD基因RhD阴性样本进行DNA序列测定.结果显示,61.54%阴性福建个体完全缺失RHD基因(RHD-/RHD-),25.97%RhD携带RHD 1227A等位基因(其中62.96% 为 RHD+/RHD-杂合子,37.04% 为 RHD+/RHD+ 纯合子),8.65%携带RHDCE(2～9)-D等位基因,1.92%携带RHD 710delC等位基因;多数RHD基因缺失存在于dce单倍体中,发现6例RHD基因缺失存在于dCe单倍体(RH基因型为dce/dCe)中,2例存在于dcE单倍体(RH基因型为dce/dcE)中;同时检测8个RHD基因外显子以及RHD 1227A等位基因,以预测RhD表型的准确性明显高于单独检测某个RHD基因外显子的准确性(χ2=24.43,p<0.005).结论:RhD阴性福建个体RHD基因具有多态性;在中国用RHD基因分型完全替代血清学检测RhD表型的条件尚未成熟.

中国北方汉族骨髓供者HLA-B*15组基因多态性的PCR-SBT分型研究

为了研究中国北方汉族骨髓供者HLA-B*15等位基因的分布特征,探讨其可能对临床供体选择的影响,从中华骨髓库陕西分库内随机抽取815名已知低分辨分型结果中国北方汉族骨髓供者,采用聚合酶链反应-碱基序列直接测序(PCR-SBT)方法对其中206例HLA-B*15阳性样本和另外附加17例样本进行HLA-B位点DNA测序分析,并应用同源模建分子模拟技术对所有结果模拟出三维结构,用计算机软件Swiss-PdbViewer比较模拟结构间的差异大小.结果表明:随机抽取的815例样本HLA-A、B、DRB1基因分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,HLA-B*15基因频率为0.1379,总共检出16种HLA-B*15等位基因,分属7种血清学特异性,以B*1501、B*1511、B*1502和B*1518为主,频率分别为0.0485、0.0215、0.0178和0.0160,累计频率构成比占全部B*15的75.11%,其余12种B*15等位基因频率均<0.0100.19例HLA-B*15,一测序分析表明,其中10例中低分辨水平上的纯合子中仅4例为真正意义上的B*15xx,-纯合子,且均由各自优势基因构成.三维结构模拟分析发现同一血清型中既存在结构差异微小的等位基因,如B*1501、1505、1507、1525、1527、1532(RMSD≤0.02 nm),也存在差异较大的等位基因,如B*1502、1511、1521之间以及B*1503、1546之间(RMSD均为0.29 nm),而一些分属不同血清型的等位基因之间结构却近似(RMSD值≤0.02 nm).结论:本研究应用PCR-SBT,首次取得了中国北方汉族样本量大的高分辨水平HLA-B*15基因多态性分布特征,这将有助于临床患者寻找合适供者,并为移植免疫及本地区群体遗传学等方面的研究提供了重要依据,且对于临床选择适供者,像HLA-B*15这样血清学特异性及基因亚型高度多态性的家族进行准确的高分辨分型是必要的.

北京地区汉族人群ABO血型基因分型研究

本研究建立ABO基因分型技术,研究北京地区汉族人群中ABO基因型的分布,以了解该人群基因分布特点及规律.通过Multiplex-PCR-RFLP技术和PCR-SSP技术建立起稳定的ABO血型基因分型方法,应用该方法开展对北京地区汉族人群ABO基因分型的研究.研究结果表明,A102、O1、B为北京地区汉族人群中较为常见的等位基因;在北京汉族人群中A型以A102为主,占绝对优势;未检测到A201等住基因,但发现3例O2基因样本,此结果提示在北京汉族人群中存在O2基因.结论:通过研究初步了解了北京地区汉族人群ABO基因分型规律,为ABO血型系统的深入研究提供了参考依据.

双重复合型ABO糖基转移酶分子基础与表达产物的分析

为了查明ABO基因表达产物和分子遗传学背景,对7例ABO血型正反定型不相符、经初步分子生物学分析出现双重复合型ABO基因的血液标本进行了研究.血清学表达型运用单克隆、多克隆抗体鉴定,基因分型运用PCR产物直接和单倍体特异性引物法进行ABO基因的序列测定.结果表明:在中国人群中鉴定出6种具双重复合编码功能的ABO等位基因,B(A)和cis-AB血清型所表达的A抗原特征随着个体的不同而有所差异.结论:4个标本中有2对样本有不同的抗原表达却有着相同的ABO分子生物学基础.

ABO基因启动子CpG岛甲基化与白血病的相关性

近年来研究发现ABO血型与许多疾病的发生发展相关,某些肿瘤导致A、B血型物质减少的现象已日益引起关注.本研究探讨ABO基因启动子CpG岛甲基化与白血病的相关性.采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测了不同血型的健康人群和各种血液病患者外周血红细胞表面ABH抗原的相对含量,用PCR和MSP-PCR分别检测血液病患者和健康人ABO基因启动子DNA序列和CpG岛甲基化,以及ABO基因启动子-102位点的甲基化.结果发现,白血病患者均出现不同程度的A、B抗原减少;通过对比检测健康人和患者的AB0基因启动子序列,未发现有序列的不同,说明启动子序列高度保守;利用重亚硫酸盐对DNA样本进行修饰后,通过对健康人和患者的ABO基因启动子序列进行扩增和测序,发现健康人和再生障碍性贫血患者在ABO基因启动子的CpG岛区没有甲基化的位点,而急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)和部分骨髓增生异常综合征(MDS)患者在位置为-102、-101、-100、-99和-97位置的C碱基均有甲基化的现象.结论:甲基化是造成白血病患者AB抗原下降的原因;-102、-101、-100、-99和-97这几个甲基化位点有可能是白血病的特异性表现;针对-102位点检测结果提示-102位点是否甲基化有可能作为白血病鉴别诊断中一个有意义的分子标识物.

kir3dl1启动子表达调控载体的构建及其在K562细胞中的活性

为了分析kir3dl1基因核心启动子区域的功能并明确其表达调控机制,构建了kir3dl1基因启动子-荧光素酶报告载体,分析其在K562细胞中的活性.采用PCR方法从含有kir3dl1基因转录起始位点5'侧翼区的质粒中扩增kir3dl1基因核心启动子序列,插入经BglII和NcoI双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-Basic;采用阳离子脂质体SuperFect包裹荧光素酶报告重组子转染K562细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性;采用MTT法检测脂质体-DNA复合物对细胞存活率的影响.结果表明:成功构建了含有254 bp的kir3dl1基因核心启动子序列的荧光素酶报告重组子3DLl-luc254并通过酶切及基因测序方法的鉴定;荧光素酶报告重组子在K562细胞中的荧光素酶活性明显高于阴性对照,且荧光素酶活性、相对活性持续3天无明显衰减,转染了3DLl-luc254报告质粒的K562细胞存活率在76%-92%之间.结论:成功构建了kir3dl1基因启动子-荧光素酶报告载体,本研究采用的转染系统能够有效地在K562细胞中进行基因转染,kir3dl1基因核心启动子在K562细胞中具有较高活性.

runx3启动子区域甲基化在急性白血病中意义的初步研究

为了探讨runx3基因启动子区域甲基化在急性白血病发病机制中的作用及其临床意义,采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测CHRF、U937、K562细胞系及40例急性白血病患者和10例正常人骨髓或外周血runx3基因启动子区域的甲基化情况,并用RT-PCR方法检测各系runx3基因的表达情况.结果发现,健康人及细胞系中均未检测到甲基化,而检测到该基因的表达;40例急性白血病患者甲基化检测阳性率35%(14/40),明显高于正常人0%,差异有统计学意义(p<0.05),其中AML 30.43%(7/23),ALL 41.18%(7/17),P>0.25,两者无明显差异.甲基化检测阳性患者均未检测到runx3基因的表达.存在runx3启动子区域甲基化患者化疗前骨髓原始细胞数均高于runx3启动子区域未甲基化患者(p<0.01),而且首次化疗后完全缓解率低于未甲基化者(p<0.05),差异有显著性.结论:runx3基因启动子区域甲基化在急性白血病的发病机制中起一定的作用,其检测对估计白血病预后具有临床意义.

热休克蛋白70及pim-1基因在白血病骨髓单个核细胞的表达特点及临床意义

本研究观察热休克蛋白70(HSP70)基因/蛋白,pim-1基因在白血病患者骨髓单个核细胞(BMMNC)中的表达,确定其表达是否与白血病类型、肿瘤负荷程度及预后有规律性联系.用RT-PCR技术检测40例白血病患者和10例对照BMMNC HSP70 mRNA及pim-1 mRNA的表达并半定量;用Western blot检测34例白血病患者和10例对照BMMNC HSP70蛋白表达并半定量,并结合白血痛类型、肿瘤负荷程度及对治疗的反应进行分析.结果表明:白血病组与对照组BMMNC均存在HSP70 mRNA和蛋白表达,在白血病组显著高于对照组;CML组、AML组HSP70 mRNA/蛋白表达的平均ODR值均显著高于ALL组;肿瘤重度负荷的急性白血病患者组HSP70 mRNA/蛋白表达显著高于肿瘤轻度负荷组;白血病患者化疗后HSP70 mRNA/蛋白表达显著高于化疗前;白血病组及对照组BMMNC均表达pim-1 mRNA,在白血病组显著高于对照组;ALL组pim-1 mRNA表达显著高于AML组和CML组;经相关性分析,白血病患者HSP70 mRNA表达与pim-1 mRNA表达成正相关(r=0.327,P<0.05).结论:白血病患者BMMNC存在HSP70、pim-1高表达,其中pim-1 mRNA表达与HSP70 mRNA表达呈正相关,HSP70与pim-1基因/蛋白过表达亦与白血病肿瘤负荷程度有关.

CD147对白血病细胞U937侵袭能力的影响

本研究探讨CD147对白血病细胞U937侵袭能力的影响.将U937细胞按照不同的处理方式分为以下4组:正常U937细胞组(对照组),脂多糖(LPS,50 μg/m1)诱导组(LPS组),CD147单克隆抗体(10 μg/m1)阻断组(CD147 mAb组),LPS诱导及CD147单克隆抗体阻断组(LPS+CD147 mAb组).使用RT-PCR和流式细胞术分别检测各组中CD147的mRNA和蛋白表达情况;应用RT-PCR和明胶酶谱法分析基质金属蛋白酶(MMP)的表达及活性;采用体外细胞侵袭实验检测细胞运动和侵袭能力的变化;将DAPI标记的U937细胞经尾静脉注入SCID小鼠体内观察细胞在各组织器官中的转移情况.实验结果显示,LPS在体外能够诱导白血病细胞U937表面CD147的表达,同时增强MMP-2和MMP-9的表达、活化和分泌;使用CD147抗体阻断CD147后,MMP-2和MMP-9的分泌及活性下降;U937细胞经LPS诱导后,其体外侵袭能力增强;U937细胞经尾静脉注入SCID小鼠后发生肺部浸润和转移,并检测到CD147、MMP-2和MMP-9的表达增强,CD147抗体在一定程度上能够抑制上述现象.结论:LPS可诱导U937细胞表面CD147分子表达增加,CD147通过上调U937细胞MMP-2和MMP-9的分泌和活性促进U937细胞的侵袭和转移.

抑制mll-af9融合基因表达对急性单核细胞白血病细胞THP-1增殖的影响

本研究探讨siRNA(small interfering RNA)对人急性单核细胞白血病细胞系THP-1的mll-af9融合基因的影响.选择THP-1细胞特有的m11-af9融合基因为靶基因,设计并合成siRNA片段.以人急性单核细胞白血病细胞系THP-1为靶细胞,应用脂质体转染方法,将siRNA导入细胞,通过流式细胞仪检测siRNA转染效率,用RTPCR法比较转染前后mll-af9 mRNA表达水平的变化,以MTT法检测细胞增生抑制率,流式细胞术检测细胞周期的改变和细胞凋亡水平.结果表明:siRNA转染效率为(69.1±1.8)%,转染siRNA后THP-1细胞生长受到明显抑制,m11-af9融合基因表达量大幅度减少,细胞周期发生了明显的变化,主要表现为G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,并使细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞凋亡水平增高,而对照组siRNA转染后则无上述改变.结论:利用siRNA靶向干扰mll-af9融合基因的表达可以有效抑制人急性单核细胞白血病细胞THP-1的增殖.

小鼠调节性树突状细胞分泌的外泌体诱导免疫耐受的实验研究

本研究探讨小鼠调节性树突状细胞(rDC)分泌的外泌体(regulatory exosomes,rDex)诱导免疫耐受的作用,并与正常未成熟树突状细胞的外泌体(immature exosomes,iDex)诱导免疫耐受的作用进行比较.取C57BL/6(H-2b)小鼠骨髓细胞诱导未成熟树突状细胞(iDC),TGF-β1联合IL-10诱导调节性树突状细胞(rDC),流式细胞术检测两种DC的表型.采用超速离心结合膜超滤的方法分别提取rDex和iDex.建立小鼠皮肤移植模型,以C57BL/6小鼠为供者,以BALB/c(H-2d)小鼠为受者,按对受者处理的不同实验分3组,iDex组术前7、3天受者经尾静脉注射10μg供者的iDex,rDex组术前7、3天受者经尾静脉注射10 μg供者的rDex,另设PBS对照组,观察移植皮肤存活情况.通过单向混合淋巴细胞反应(MLR)观察供者及非亲缘异基因供者DBA/2对同种异基因小鼠T细胞增殖情况.结果表明:TGF-β1、IL-10可下调DC表面共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达.移植皮片平均存活时间(MST),在对照组为7.8天,iDex组为10.7天,rDex组为18.8天;iDex组的移植皮片MST明显长于对照组(p<0.05);rDex组的移植皮片MST明显长于iDex组(p<0.01).MLR结果证明iDex组和rDex组B/C小鼠均对C57小鼠的脾细胞产生特异性耐受,尤其是rDex组;对非亲缘异基因DBA供者的脾细胞两组仍表现出强烈的免疫应答.结论:iDex和rDex均有诱导免疫耐受的作用,且rDex作用较iDex作用好.

CMV pp65基因修饰的树突状细胞刺激自身T细胞活化

巨细胞病毒(CMV)感染易发生于慢性移植物抗宿主病(cGVHD)患者,其特异性免疫依赖于T细胞活性.本研究探讨CMV pp65基因修饰的树突状细胞(DC)对自身T细胞的活化作用.采用具有高效转染非分裂细胞的慢病毒系统将CMV全长pp65基因导入鼠源性DC;采用CpG-DNA诱导DC细胞成熟;采用流式细胞术及免疫荧光方法测定T淋巴细胞抗原及IFNγ表达.结果表明:慢病毒感染DC的感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50,佳感染效率可达30%-40%;表达pp65基因的成熟DC能刺激自身naive T细胞表达CD69;表达PP65蛋白的成熟DC能够刺激自身CD4+ 或CD8+ T细胞分泌IFNγ.结论:pp65基因修饰、CpG-DNA诱导成熟的DC能体外激活CMV特异性T淋巴细胞.

干扰素α对慢性髓系白血病来源树突状细胞表达Th细胞因子和CCR7的影响

本研究探讨干扰素α(IFN-α)对慢性髓系白血病(CML)来源树突状细胞(DC)表达趋化因子CCR7及分泌IL-10、IL-12 P70的影响.在诱导CML-DCs的无血清条件培养基中,除加入SCT、GM-CSF、TNF-α及IL-4外,还加入不同浓度IFN-α.培养10-14天后,用流式细胞术检测共刺激分子及CCR7表达,G显带法显示Ph1染色体,噻唑蓝(MTT)法检测CML-DC刺激正常人外周血淋巴细胞增殖状况,ELISA法检测培养上清IL-10及IL-12P70含量.结果显示:IFN-α(300 U/ml)组与无IFN-α组比较其CML-Dc的CD40、CD83、CD86及CCR7的表达均升高1倍,异体混合淋巴细胞反应(MLR)中OD值增加1倍,Phl染色体阳性比例及IL-10和IL-12 P70浓度均减低.结论:IFN-α能够部分纠正CML-DC免疫表型及功能缺陷,这同其上调DC共刺激分子和CCR7表达及解除了CML血清中IL-10对CML-DC分化的抑制有关.

LMP2混合肽负载树突状细胞与EB病毒感染患者外周血单个核细胞共培养产生识别EB病毒抗原的T细胞

LMP2是EB病毒感染细胞后表达的一种蛋白.本研究探讨应用适于不同HLA分型的EB病毒-LMP2抗原混合肽(MIX-LMP2)体外刺激EB病毒感染患者外周血单个核细胞,诱导产生EB病毒抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL).取EB病毒相关噬血细胞综合症患者的外周血,分离并诱导培养树突状细胞,在培养过程中用EB病毒MIX-LMP2混合肽刺激,促成熟后在体外激活自体T淋巴细胞,每周刺激1次,共刺激2次;同时对部分分离的淋巴细胞在培养过程中不予以刺激作为对照.用基因扫描T细胞受体(TCR)β基因图谱的方法观察培养前后的T细胞克隆分布变化;用流式细胞术检测T淋巴细胞的表型变化;将培养的细胞和靶细胞共培养检测IFN-γ的分泌以研究CTL细胞抗原特异性的细胞毒作用.研究结果表明,基因扫描TCRβ基因结果显示体外培养改变了患者的TCRβ基因图谱,培养前为寡克隆的TCRB基因家族在培养后出现与正常人相似的多峰分布,提示淋巴细胞亚群分布恢复正常;流式细胞分析显示培养前的淋巴细胞CD3+、CD3+ CD8+、CD3+ CD45RA-CD45RO+ 比例分别为70.73%、42.99%、27.56%,用负载EB病毒LMP2肽2次刺激体外培养后,上述的淋巴细胞表型分别升高为95.17%、52.54%、81.41%.NK细胞(CD3-CD56%)、调节性T细胞(CD4+ CD25+ FOXP3+)比例变化不大,分别从培养前的2.12%,0.03%变化为2.35%,0.02%.CD3+ CD45RA-CD45RO+ 细胞增长比例较大,表明2次刺激后大部分的初始型T淋巴细胞被激活.IFN-γ分泌检测结果显示,当负载LMP2肽的DC细胞作为靶细胞时,刺激1次的细胞分泌IFN-γ量和刺激2次的细胞分泌IFN-γ量明显高于同期未刺激细胞分泌IFN-γ量(p<0.05).而对于未负载LMP2的DC细胞作为靶细胞时,IFN-γ检测结果则显示无统计学意义(p>0.05).结论:用负载EB病毒MIX-LMP2肽的树突状细胞(DC)刺激T淋巴细胞的培养方法,可以改变患者T淋巴细胞克隆分布,产生识剐EB病毒的特异性T淋巴细胞.

维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病中的高白细胞血症及治疗对策

为了解用全反式维甲酸(ATRA)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)过程中高白细胞血症发生情况并探讨白细胞数的高低对ATRA治疗效果的影响,本研究根据患者外周血白细胞数量的多少,将其分为白细胞数<30×109/L单用ATRA诱导治疗组、白细胞>30×109/L单用ATRA治疗组及白细胞>30×109/L用ATRA和化疗相结合治疗组,以观察疗效.结果表明:39例APL病人在用ATRA治疗过程中23例出现高白细胞血症,高白细胞血症发生率为58.97%.单用ATRA及ATRA+化疗的总缓解率为91.3%.其中外周血白细胞数<30×109/L而单用ATRA治疗组缓解率为100%,血白细胞数>30×109/L而单用ATRA治疗组缓解率为87.5%,血白细胞数>30×100/L而用ATRA+化疗组的组缓解率为90.9%.结论:ATRA与化疗相结合,可有效控制ATRA治疗期间出现的高白细胞血症,降低早期病死率.

植物雌激素协同化疗药的抗白血病作用体外研究

异黄酮类的Genistein及daidzein和黄酮类的quercetin是天然的植物雌激素,具有抗癌特征.本研究探讨植物雌激素在急性和慢性粒细胞性白血病中的抗增殖作用及与化疗药的协同作用.用台盼蓝染色法分析genistein单独应用和与化疗药联合应用在NB4和HL-60白血病细胞中的抗增殖作用;用MTT法分析quercetin对K562及K562/A细胞的生长抑制作用;确定genistein与化疗药联合应用中同时及顺序给药的佳作用次序;观察联合作用24、48、72小时后细胞的生长状态,研究genistein的凋亡诱导作用和细胞周期阻滞作用.结果表明:Genistein对NB4和HL-60白血病细胞有剂量、时间依赖性的增殖抑制作用,可诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞.Crenistein和化疗药联合应用对细胞生长有协同抑制作用,且与作用次序相关.Quercetin对白血病敏感株和耐药株均有明显的抑制作用.结论:本研究报道genistein和化疗药联合有协同抗白血病细胞增殖作用,具有作用次序相关性特性,这种联合应用有可能为白血病临床治疗提供新的思路.

外泌体联合CpG ODN免疫刺激佐剂诱导CTL抗白血病效应

为了探讨外泌体(exosomes)作为白血病治疗性疫苗的可行性,体外研究了外泌体联合CpG佐剂诱导CTL杀伤白血病细胞的作用.获取正常人外周血MNC-DC,并分为7组,其中3组分别加入K562细胞来源外泌体(Kexo)、K562细胞诱导分化树突状细胞来源外泌体(DCexo)及K562细胞冻融抗原冲击K562细胞诱导分化树突状细胞来源外泌体(FTexo)作为实验组(分别为Kexo、Dcexo和FTexo);另外3组在加入Kexo、DCexo和FTexo的同时加入CpG ODN佐剂也作为实验组(Kexo+CpG、DCexo+CpG和FTexo+CpG);第7组作为空白对照组.所有7组DC再继续培养3天,然后加入同源正常人T淋巴细胞共同培养3天,诱导T淋巴细胞为效应细胞(CTL),K562细胞为靶细胞,用MTT法测CTL对K562细胞的杀伤活性.结果显示:各外泌体实验组刺激诱导的CTL的杀伤作用比对照组明显增强(P<0.05).DCexo及FTexo诱导的CTL对K562靶细胞的杀伤作用比Kexo强(P<0.05),联合应用GPG ODN佐剂可以进一步增强这种杀伤作用(P<0.05).结论:外泌体能诱导有效的CTL对白血病靶细胞的杀伤作用,CPG ODN佐剂能进一步增强这种杀伤作用,外泌体有望作为治疗性疫苗用于白血病的临床治疗.

VEGF反义RNA促骨髓瘤细胞凋亡及抑制内皮细胞形成血管作用的体外研究

本研究探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)反义RNA对人多发性骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡及内皮细胞ECV304体外血管形成的影响和以VEGF反义RNA进行多发性骨髓瘤(MM)基因治疗的可行性.将VEGF121反向克隆入真核表达质粒pIPES2-EGFP构建重组质粒AS-VEGF,酶切、测序鉴定.用此真核表达重组质粒转染人骨髓瘤细胞系U266,G418筛选获得阳性克隆.RT-PCR、Western blot法分别检测阳性克隆中VEGF mRNA和蛋白的表达;利用MTT法、流式细胞术检测转染细胞增殖、凋亡的变化;利用基质胶中内皮细胞ECV304的网络形成检测血管形成.结果表明:获得了携带反义VEGF基因的真核表达重组质粒AS-VEGF;VEGF121反义RNA部分阻断了U266细胞中VEGF的表达,转染重组质粒的U266细胞VEGF mRNA和蛋白表达都较对照组细胞有明显减少,细胞的增殖受到抑制,凋亡增加.转染重组质粒的细胞培养上清在基质胶中作用ECV304细胞后的血管形成较对照组亦有明显减少.结论:VEGF反义RNA可以下调VEGF表达,从而抑制骨髓瘤细胞系U266增殖,增加其凋亡并抑制血管形成.

多发性骨髓瘤的过去、现在及未来

多发性骨髓瘤是一种浆细胞系恶性肿瘤,依靠传统的化疗方案不能够治愈.近年来,基于对骨髓瘤生物学、遗传学以及肿瘤发生学的深入研究,开发研制出一些新药,并提出了靶向治疗的新方法,如利用蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂等,能够极大的改善病人的预后;另外,新的联合化疗方案的出现,也明显提高了缓解率.这些新的治疗策略为临床工作带来了巨大帮助,本文对治疗多发性骨髓瘤的新看法的近进展进行了评述.

B7-1与CD40L在淋巴瘤免疫治疗中的协同作用

为了研究B7-1与CD40L共刺激途径在淋巴瘤的免疫治疗中的作用,探讨治疗淋巴瘤疫苗有效的作用方式,将A20淋巴瘤细胞株接种在BALB/c小鼠身上以构建荷瘤小鼠模型,将B7-1与CD40L表达载体单独或联合导入肿瘤内,以PBS和空载体作为对照,观察肿瘤生长的情况;应用肿瘤病理切片和HE染色技术观察肿瘤组织形态及淋巴细胞浸润情况,采用CCK-8试剂盒检测荷瘤小鼠脾CTL杀伤效应.结果显示,瘤内注射B7-1或CD40L表达载体可导致肿瘤生长延缓或体积缩小,两者联合注射较对照组和单独注射组的肿瘤消退效应明显增强.肿瘤形态学观察表明,治疗小鼠肿瘤局部有炎性细胞浸润并伴有大面积的坏死,肿瘤局限化;CCK8试剂盒检测显示小鼠脾CTL杀伤能力增强.结论:B7-1与CD40L疫苗对淋巴瘤具有治疗效应,两者联合治疗的效果优于单一治疗.质粒载体瘤内注射可作为一种安全有效的肿瘤疫苗作用方式.

Id4基因甲基化在恶性淋巴瘤中的检测意义

本研究探讨id4基因启动子区甲基化状态在非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者中的检测意义.采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)对正常人和初诊NHL患者骨髓进行id4基因启动子区甲基化状况进行检测,同时进行骨髓穿刺和骨髓活检,并对患者进行随访.结果表明:id4基因在正常骨髓中呈完全性非甲基化状态.18例初治NHL患者中1例经骨髓活检证实有淋巴瘤骨髓受累,4例发现有id4基因甲基化.14例id4基因非甲基化的NHL患者在8个月随访期内病情稳定,再次检测骨髓未发现淋巴瘤骨髓受累,而1例id4基因甲基化伴骨髓受累的NHL患者在随访期间转变为白血病,3例id4基因甲基化伴无骨髓受累的NHL患者中2例在随访期间复查发现有骨髓受累.结论:在骨髓检查正常的NHL患者中检出id4基因甲基化可能提示淋巴瘤骨髓微量受累.

CD271及CD133用于阳性分选富集骨髓间充质干细胞的比较

本研究旨在通过对03271(低亲和性神经生长因子受体,low affinity nerve growth factor receptor,LNGFR)及CD133免疫磁珠阳性分选富集骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的比较,选出一种相对理想的从骨髓中富集间充质干细胞的免疫磁珠分选方法.采用免疫磁珠的方法得到骨髓单个核细胞中的CD271+细胞及CD133+细胞;将得到的细胞分别进行培养,14天后计数成纤维细胞集落形成单位(colony forming unit-fibro blast,CFU-F);对每个传代细胞进行计数,绘制细胞增殖曲线;取两种方法得到的细胞培养至3代以后,流式细胞术检测细胞表面抗原,通过细胞形态及免疫化学染色鉴定比较成骨及成脂肪定向诱导分化.结果表明:CD271阳性分选纯度为(89.50 4±0.98)%,CD133阳性分选纯度为(88.03±3.06)%;1×104 个 CD271+ 细胞培养后产生的CFU-F数目是1×104 个CD133+细胞培养后形成CFU-F数目的2倍,CD271-细胞培养后无CFU-F形成,而CD133-细胞培养后可形成少量的CFU-F;两种方法得到的细胞培养至第3代后表型基本一致,即CD34-、CD14-、CD45-、CD90+、CD29+、CD44+、CD105+、CD73+;CD271+细胞的增殖能力比CD133+细胞的高出3倍,而且具有更强的成骨、成脂肪分化潜能.结论:虽然CD271及CD133阳性分选都可以得到间充质干细胞,但相比之下,CD271阳性分选得到的间充质干细胞有更强的增殖和分化能力,因而CD271阳性分选是一种相对理想的从骨髓中富集间充质干细胞的免疫磁珠分选方法.

人类ermap基因在脐血单个核细胞向红细胞系分化发育过程中表达的研究

为探讨人类红细胞膜相关蛋白(erythroid membrane associated protein,ERMAP)基因在红细胞分化发育过程中的作用,本研究以SCF、IL-3和EPO体外诱导脐血单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)向红系细胞方向分化,在此过程中用光学显微镜观察细胞形态,用联苯胺染色计数细胞阳性率,流式细胞术检测CD36+/CD235a-、CD36+/CD235a+、CD36-/CD235a+细胞的比例,同时以荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)检测人类ermap基因表达量的变化.结果表明,SCF、IL-3和EPO可诱导脐血MNCs向红系方向分化,在此过程中人类ermap基因的表达量不断增加.结论:人类ermap基因与红细胞分化发育密切相关.

再生障碍性贫血IFN-γ基因+874位点的单核苷酸多态性

本研究采用扩增不应突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)-PCR对51名健康者和54例再生障性贫血患者IFN-γ基因+874位点单核苷酸多态性进行检测,旨在探讨再生障碍性贫血患者的遗传易感因素.结果表明,再生障碍性贫血患者IFN-γ+874位点TT基因型及T等位基因分布频率分别为42.6%与65.7%,显著高于健康对照组中的17.6%与39.2%(χ2=13.780,p=0.01;χ2=14.811,p<0.001).结论:IFN-χ+874A/T基因多态性可能与再生障碍性贫血患者的遗传易感性相关.IFN-γ+874位点单核苷酸多态性与再生障碍性贫血的病情严重程度没有相关性.

脐血来源的两种内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

为了建立从人脐血分离培养两种内皮祖细胞的方法和培养体系,从脐血分离单个核细胞,在含有内皮细胞条件培养液的体系中培养得到两种细胞,利用摄取乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low-density lipoprotein,DiI Ac-LDL)和结合欧洲荆豆凝集素(Ulex European Agglutinin 1,UEA-1)进行鉴定,并进一步用免疫细胞化学、RT PCR、流式细胞术对它们进行内皮细胞相关的表型检测.结果表明,这两种细胞均能摄取DiI-Ac-LDL和结合UEA-1,表达内皮细胞的标志如CD31、CD144和血管假性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF),有CD31、酪氨酸激酶受体(kinase tyrosine insert domain receptor,KDR)、CD144和内皮一氧化氮合成酶(endothelial NO synthase,ENOS)的基因转录.但是,它们的增殖能力明显不同,分别称为循环成血管细胞和高增殖潜能内皮祖细胞.流式细胞计数结果显示,这两种细胞在一些表面标志表达方面也存在明显的差异.结论:利用含内皮细胞条件培养液的培养体系,成功地从脐血分离的单个核细胞中培养得到了两种内皮祖细胞.

RNA干扰法对内皮细胞基质金属蛋白酶-2功能研究

本研究运用RNA干扰(RNAi)技术将内皮细胞MMP-2进行基因沉默,揭示MMP-2在内皮细胞增殖、迁移、侵袭、血管形成以及细胞周期等方面的作用.采用脂质体法将MMP-2小干扰RNA(siRNA)转化内皮细胞EAhy926,通过RT-PCR及流式细胞术分别在基因和蛋白水平验证转化的效率.应用MTT比色法测定经MMP-2 siRNA干扰不同时间EAhy926细胞的增殖能力;虎红染色测定光密度法观察干扰48小时后内皮细胞在两种趋化因子作用下的迁移及侵袭能力的变化;Matrigel胶三维培养法观察干扰48小时后内皮细胞血管形成能力的改变;流式细胞术及半定量RT-PCR法测定内皮细胞周期和相关基因的变化.结果表明:干扰因素施加后48小时MMP-2基因表达水平降低至谷底,较正常对照下降约82%;流式细胞术分析表明,干扰因素施加后60小时MMP-2蛋白表达水平降低至谷底,较对照下降约60%.MTT法检测显示干扰前后内皮细胞增殖无明显变化.内皮细胞经MMP-2 siRNA干扰48小时后在两种趋化因子作用下的迁移能力均受到抑制,且时COL Ⅳ的抑制作用强于Fn(Fn 未干扰组0.581±0.012,干扰组0.261±0.002;COL Ⅳ未干扰组对干扰组为0.467±0.009 vs 0.110±0.010,p<0.01).侵袭实验也有相似的结果(Fn未干扰组对干扰组为0.365 4±0.012 vs 0.101±0.002;COL Ⅳ未干扰组对干扰组为0.317±0.009 vs 0.102±0.010,p<0.01).内皮细胞体外的血管形成能力在经siRNA干扰48小时后下降至正常的58.9%.内皮细胞经MMP-2 siRNA干扰48小时及72小时后,有丝分裂后期细胞比例(G1)分别由对照组[(65.9±2.53)%;(63.2±1.89)%]上升至[(83.9 4±2.53)%,(89.2 4±1.24)%](p<0.01);DNA复制期(S)和有丝分裂前期(G2)期细胞比例分别由对照组[(32.7±1.91)%,(37.1±2.65)%]下降至[(18.1±1.49)%,(10.2±0.85)%](p<0.01).半定量RT-PCR分析结果显示,内皮细胞Rb、cyclin D1以及PCNA基因表达量分别下降至未干扰者的35%,51%和22%.结论:MMP-2的表达与内皮细胞的增殖无明显相关性,但在内皮细胞迁移、侵袭和血管形成等方面发挥重要作用,同时还通过Rb、cyclinD1以及PCNA等基因参与内皮细胞周期的调控.

二甲亚砜、吐温80对小鼠骨髓来源细胞体外生长和活力影响的量效关系分析

本研究观察二甲基亚砜、吐温80对小鼠骨髓基质细胞(BMSC)、粒-巨噬系祖细胞(CFU-GM)和内皮细胞系细胞(BMEC)体外生长和活力的影响,并分析其量效关系.分别设置不同终体积分数二甲亚砜与吐温80的细胞培养体系及其对照,检测成纤维细胞形成单位(CFU-F)和CFU-GM的集落生成率,用MTT比色法和台盼蓝排斥试验测定BMSC和BMEC的细胞活力和活细胞百分率.结果表明:二甲亚砜为2%、吐温80为0.005%-0.01%时,CFU-F、CFU-GM集落产率与对照组相比显著降低(p<0.05或<0.01).二甲亚砜为0.5%-1.0%、吐温80为0.002%-0.005%时,BMSC和BMEC的细胞活力和活细胞率与对照组相比显著减低(P<0.05或<0.01).随着二甲亚砜、吐温80在上述体积分数上增加,各相应检测指标的减低率递增.结论:二甲亚砜,吐温80在细胞培养体系中达一定含量时,对小鼠骨髓BMSC、CFU-GM和BMEC细胞具有明显的生长抑制作用和(或)细胞毒性作用,含量增高则效应更显著.

IL-21单独或联合IL-15/IL-2对G-CSF动员人外周血单个核细胞体外增殖和抗肿瘤活性作用研究

本研究探讨IL-21单独或联合IL-15/IL-2对G-CSF动员的人外周血单个核细胞(G-PBMNC)体外增殖和抗瘤活性的影响,评价IL-21及相关细胞因子组合在肿瘤免疫治疗方面的可行性.应用IL-21单独或联合IL-15/IL-2体外培养G-PBMNC,用CCK-8法进行细胞增殖分析;以白血病细胞株K562为靶细胞,用CFSE/PI流式双染法检测其对肿瘤的杀伤作用;用流式细胞术分析免疫细胞表型.结果显示:培养72小时后单独IL-21因子组对靶细胞杀伤活性与IL-2结果相近;当效靶比为25:1时IL21+IL15/IL 21+IL15+IL2组与IL21+IL2组相比杀伤能力有显著增强(p<0.05);效靶比50:1时,细胞因子联合应用组均显著高于细胞因子单独应用组(p<0.05),以IL21+IL15+IL2诱导效果佳.复苏冻存的G-PBMNC处理结果与新鲜的G-PBMNC结果基本一致.细胞因子组和对照组相比CD3、CD4和CD8抗原表达有所增加,以IL21+IL15组的CIM、CD3-56+和CD3+56+抗原表达增加为显著(p<0.05).结论:IL-21可增强G-PBMNC的体外杀伤活性,联合IL-15可更显著提高G-PBMNC的抗瘤活性.

不同时相移植人骨髓间充质干细胞对人脐血CD34+细胞植入NOD/SCID小鼠的影响

为了观察不同时相移植人骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血(UCB)CD34+细胞移植的NOD/SCID小鼠造血重建的影响,明确佳的移植时机,将体外培养扩增的人骨髓MSC分别于UCB CD34+细胞移植同时、移植前48小时及移植后48小时输入经60 Co γ射线照射的NOD/SCID小鼠,观察共移植后42天内小鼠外周血白细胞和血小板变化,并于移植后42天处死小鼠,用FACS检测外周血、骨髓和脾脏人源细胞含量.结果表明:(1)MSC和UCBCD34+细胞同时输注可明显降低外周血白细胞和血小板下降幅度,缩短白细胞和血小板恢复时间;二者不同时输注均不降低白细胞和血小板下降幅度,且输注UCB CD34+细胞后48小时输注MSC时外周血血小板恢复时间明显晚于同时输注者.(2)与单纯UCB CD34+细胞移植相比较,不同时相输注MSC均可促进UCB CD34+细胞的植入,三个共输注组间促进骨髓各系造血植入效应无明显差异.结论:人骨髓MSC与UCB CD34+细胞共移植时,以同时移植效果佳,此结果为MSC的临床应用提供了实验依据.

非清髓性外周血干细胞移植治疗慢性髓系白血病慢性期及加速期的疗效观察

本研究观察非清髓造血干细胞移植对慢性髓系白血病慢性期(CML-CP)、慢性髓系白血病加速期(CML-AP)的疗效.用福达华(F)30 mg/m2×6天,白消安(B)4 mg/kg×2天,环磷酰胺(CTX)350 mg/(m2?d)×2天,伍用或不伍用阿糖胞苷(Ara-C)对24例HLA全相合及1个位点不合者进行预处理,并对其造血恢复等指标进行动态观察.结果表明,24例患者造血顺利恢复,ANC>0.5×109/L的中位时间平均为移植后13天,BPC>20x109/L的中位时间平均为移植后11.5天.移植后30天经短串重复系列(STR-PCR)检测其中12例植活患者,结果9例为完全嵌合状态(CDC),3例为混合嵌合体.移植后180天时所有存活的18例患者均为CDC.中位随访24个月(4-48月),18例患者无病存活,2例患者死于严重aGVHD,1例死于cGVHD,2例死于间质性肺炎,1例死于复发.结论:非清髓造血干细胞移植是CML慢性期的有效治疗手段,对于加速期患者亦有良效.

蛋白质芯片技术检测异基因造血干细胞移植患者血浆IL-4和IL-6含量变化及其与aGVHD关系探讨

本研究旨在通过动态观察异基因造血千细胞移植患者血浆中IL-4和IL-6含量的变化,探讨其变化与急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生的关系.采用蛋白芯片方法时32例行异基因外周血造血干细胞移植的住院患者的外周血细胞因子IL-4和IL-6的含量进行10周的动态观察.结果发现:IL-4含量在aGVHD组患者移植后第1周迅速增加,显著高于无aGVHD组(p<0.05);而在无aGVHD组,在移植后的第7周,血浆IL-4含量大幅增加,显著高于aGVHD组(p<0.01).IL-6含量在移植前两组患者即存在显著差异(P<0.05).在移植后的第1周,aGVHD组患者血浆IL-6上升达到高水平,显著高于无aGVHD组(p<0.01),而在无aGVHD组,在移植后的第4周IL-6含量非常显著高于aGVHD组(p<0.01),在移植后的第5周,IL-6显著高于aGVHD组(p<0.05).结论:IL-4和IL-6在异基因造血干细胞移植后含量突然升高提示即将发生aGVHD;移植前高水平的IL-6可能是移植后aGVHD高发的危险因素;无aGVHD的患者,如果血浆IL-4含量增高,提示可能有相对延迟的aGVHD出现.通过对IL-4和IL-6含量的动态观察以预测aGVHD发生,这一技术可能是一个颇具前景的研究方向.

ABO血型不合异基因造血干细胞移植后并发纯红系再生障碍

为了研究ABO血型不合异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后并发纯红细胞再生障碍(pure red cell aplasia,PRCA)的发病情况及危险因素,对本医院以往血型不合异基因造血干细胞移植进行回顾性分析,探讨移植后患者PRCA的发病危险因素.研究结果表明,72例ABO血型不合allo-HSCT患者中,4例发生PRCA,其中A供O 3例,A供B 1例.PRCA的发生不影响急性移植物抗宿主病(GVHD)或巨细胞病毒(CMV)感染的发生.PRCA患者红系恢复的时间显著长于未PRCA发生患者.结论:PRCA是ABO血型不合移植的主要并发症.A供O可能是ABO血型不合allo-HSCT后并发PRCA的危险因素.

重组人白介素11联合粒细胞集落刺激因子动员的自体外周血造血干细胞移植

本研究旨在探索重组人白介素11(rhIL-11)联合重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)动员外周血造血干细胞进行自体外周血干细胞移植的作用.16例预行自体外周血干细胞移植的非霍奇金淋巴瘤及急性髓系白血病患者随机分为实验组(rhIL-11联合rhG-CSF动员)及对照组(rhG-CSF动员),两组均在动员性化疗后血象下降至低值有回升迹象时应用rhIL-11及rhG-CSF;rhG-CSF 5 μg/(kg穌)动员中位时间5.5天,rhIL-11 50 μg/(kg穌)动员中位时间4天;动员后观察外周血白细胞和血小板计数,以及干细胞采集物单个核细胞、CD34+细胞、CFU-GM集落数的变化;按常规进行自体外周血干细胞移植后,观察粒细胞及血小板植活时间及单采血小板输注量.结果显示:实验组及对照组动员后外周血白细胞和血小板计数,以及干细胞采集物单个核细胞、CD34+细胞及CFU-GM集落数无显著性差异(p>0.05).自体外周血干细胞移植后,实验组中性粒细胞数≥0.5×109/L的中位时间为10.5天,对照组中为13天,实验组比对照组提前2.5天(p<0.05).实验组血小板数≥20×109/L的中位时间为11.5天,对照组为13天,实验组比对照组提前1.5天(p<0.05).实验组输注单采血小板中位数为3.5单位,对照组为5单位,实验组比对照组减少1.5单位(p<0.05).实验组使用动员剂的不良反应主要有低热、乏力、感冒样症状、食欲不振、头晕、肌肉酸痛等,对照组仅出现低热,患者对以上症状均可以耐受,停药后症状自行消失.结论:rhIL-11联合rhG-CSF动员外周血造血干细胞安全有效,在自体外周血干细胞移植后造血重建较快,单采血小板输注量少.

体外共培养双份脐血CD34+细胞对各自归巢相关分子表达的影响

本研究探讨脐血CD34+细胞体外混合培养对彼此归巢相关分子表达的影响.从正常人骨髓中分离扩增间充质干细胞,富集传代,加速器照射(12Gy)后作为滋养层细胞,将免疫磁珠分选纯化的两份脐血CD34+细胞混合接种到其表面(其中1份CD34+细胞用CFSE标记),观察各自归巢相关分子(黏附分子)表达的变化.结果表明,脐血CD34+细胞分选富集的纯度为(98.25±0.93)%,实验组在共培养6天后,两份脐血CD34+细胞的比例分别降为(60.4±6.32)%和(60.2±5.12)%,但与对照组比较无统计学差异;实验组各份CD34+细胞的CD44,CD62L,CD184以及CD26的阳性率较培养前均无显著变化.而CD162表达显著下降.CD54在培养3天后有所上升,但培养6天后下降至培养前水平,与对照组比较无统计学差异.结论:将两份脐血的CD34+细胞体外混合培养对彼此归巢相关分子并无明显影响.

《中国实验血液学杂志》投稿简则

《中国实验血液学杂志》被收录于国内外的数据库及检索刊物

《中国实验血液学杂志》第6届编辑委员会

骨髓增生异常综合征患者人端粒酶逆转录酶和survivin基因的表达

本研究探讨骨髓增生异常综合征(MDS)患者端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)和凋亡抑制因子survivin的表达及它们之间的关系.以普通RT-PCR方法检测56例MDS患者和27例缺铁性贫血患者骨髓端粒酶逆转录酶hTERT mRNA的表达,以应用Taqman探针的实时定量RT-PCR方法检测55例MDS患者和12例缺铁性贫血患者骨髓survivin mRNA的表达,分析它们在MDS中的表达水平及相互关系.结果表明:RA患者及RAEB患者hTERT的阳性率均显著高于对照组,差异有统计学意义(p<0.005);随着病情的改善,RA患者hTERT表达率下降,与对照组相比无明显差异(P>0.10);按IPSS危险度分组,低危+中危-1组hTERT的表达与中危-2+高危组相比无明显差异(P>0.50);RA患者survivin的表达均明显高于对照组,差异有显著性(P<0.02),而RAEB患者survivin的表达与对照组相比无明显差异(P>0.05);按IPSS危险度分析,低危+中危-1组survivin的表达明显高于对照组,差别有显著性(P<0.02).中危-2+高危组survivin的表达与对照组无明显差异(P>0.10).结论:端粒酶逆转录酶hTERT和凋亡抑制因子survivin可能在MDS恶性克隆细胞逃脱凋亡控制、获得无限增殖能力的过程中发挥作用.

骨髓增生异常综合征患者间充质干细胞对T细胞的免疫抑制作用

本研究比较来源于正常志愿者和骨髓增生异常增生综合症-难治性贫血(MDS-RA)患者骨髓间充质干细胞(MSC)免疫抑制作用的区别.培养12例正常志愿者和12例MDS患者的骨髓MSC,比较两组MSC的形态、细胞表型、细胞因子的表达,通过植物血凝素(PHA)刺激的T细胞增殖试验、混合淋巴细胞反应和T细胞周期检测、T细胞凋亡检测等比较两组MSC对T细胞的抑制作用的区别.结果表明:两组MSC的形态、表型基本相同;MDS患者来源的MSC对PHA和同种异体抗原诱导的T细胞的抑制作用均低于正常志愿者来源的MSC;加入正常志愿者的MSC后有更多的T细胞阻滞在G0/G1期,但MDS来源的MSC的这种作用较弱;MDS来源的MSC抑制T细胞活化的能力也下降,但是抑制T细胞凋亡的能力增强.另外,MDS来源的MSC表达转化生长因子(TGF-β1、3)、FasL较正常志愿者MSC表达的明显减弱,而TGF-β2的表达却增加.结论:虽然MDS来源的MSC在形态、增殖和细胞表型上基本正常,但其对T细胞的抑制作用减弱,其异常是否与MDS的发病机制有关需要进一步的研究.

63例骨髓增生异常综合征患者预后的积分分析

本研究探讨骨髓增生异常综合征(MDS)患者预后的危险因素,重点研究不同积分系统、WHO分型、FAB分型,染色体异常克隆,骨髓学及血液学指标在其预后中的意义,筛选与预后独立相关的因素.收集武汉协和医院近5年63例MDS患者临床资料及实验室检查资料,使用Epi Data3.0建立详细的资料档案,并采用骨髓短期培养和G显带技术对63例MDS患者进行染色体核型分析,同时追踪其临床病情进展情况.对随访结果结合临床资料应用SPSS13.0软件包进行数据处理.统计方法包括:所有生存率采用寿命表法,对各组生存率之闻比较采用Logrank检验,所有生存率函数曲线均采用Kaplan-Meier法,多因素分析采用Cox比例风险模型分析.结果表明:63例MDS患者中位发病年龄为38岁,其中26例患者出现染色体异常核型(41.27%).中位生存期30.63月.截至随访终止33例病例死亡(52.38%).5种预后积分系统不同组别患者的总存活期(overall survival,OS)均具有统计学差异,且以IPSS,Lille和Spanish预后积分系统差异为显著(p<0.0001).经Cox多因素回归分析,对患者OS有重要影响的因素为IPSS(p<0.0001)、Lille积分系统染色体分组(p<0.0001)、骨髓原始细胞比例(P=0.00062)、Spanish积分系统(p=0.00064)及Lille积分系统(p=0.008).63例患者的OS经过WHO分型有显著的统计学差异(p<0.0001),其中RA患者相比较RCMD患者与5q-患者有更长的OS(p=0.003),并且5q-亚型提示非常良好的预后.RAEB-I怠者中位OS高于RAEB-Ⅱ患者.将63例MDS患者重新归类于FAB分型显示低危组(RA/RAS)和高危组(RAEB)的OS也有统计学差异(p=0.00012).结论:骨髓原始细胞比例和染色体核型异常是影响MDS预后的两个重要因素.WHO分型比FAB分型更有提示预后的价值,IPSS能为有染色体结果的MDS患者治疗方案的选择提供重要依据,但众多基层医院由于开展细胞遗传学研究尚存在一定困难,因此Spanish预后积分系统可应用于无染色体结果的患者中.

凋亡相关基因pnas-2的表达谱分析

为了确定凋亡相关基因pnas-2在正常组织及急性白血病患者组织中的表达谱,应用Northern blot检测了pnas-2在心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、淋巴结、胸腺、白细胞、骨髓和胎肝等组织中的表达,应用实时PCR(real-time PCR)和Northem blot检测了该基因在急性白血病44份初发、9份未缓解、27份缓解、12份复发样本中的表达,并检测了pnas-2在31例恶性肿瘤患者癌组织及正常组织中的表达.结果表明,pnas-2基因除了在胎盘中表达外,在其他检测的组织中均无表达.pnas-2基因在初发,未CR和复发急性白血病患者中的表达显著高于CR和癌肿患者的癌组织及正常组织中的表达.在7例急性白血病患者的自身前后对照中,pnas-2的表达变化与病程演变有关,即初发时高表达,未CR时无明显改变,但在CR时显著下降,复发时表达又上升.结论:pnas-2的高表达在急性白血病中是特异的,可能是一种癌基因,并很可能参与了白血病的发病.

七叶皂苷诱导HL-60细胞凋亡的研究

本研究观察七叶皂苷对髓系白血病HL-60细胞的抑制和诱导凋亡作用.取对教期生长的HL-60细胞经饥饿处理后,加入不同浓度的七叶皂苷观察七叶皂苷抑制细胞生长的指数、形态学变化,用DNA片段凝胶电泳(DNA Ladder)和Annexin V/PI-FITC双标法分析诱导细胞凋亡的作用.结果表明:七叶皂苷抑制HL-60细胞生长,15-120 mg/L的七叶皂苷处理细胞48小时后,存活率为(92.2±0.69)%-(8.2±0.96)%,均明显低于不加药的对照组(99.4±0.31)%(p均<0.05);七叶皂苷15-60 mg/L处理细胞24小时后细胞发生凋亡.Annexin V/PI分析显示,给药组Annexin V 阳性细胞为(12.7±0.58)%-(65.4±1.30)%,明显高于对照组的(0.57±0.03)%(p均<0.01).七叶皂苷处理的细胞DNA琼脂糖凝胶电泳显示典形的凋亡DNA梯形条带.结论:七叶皂苷能特异性地诱导HL-60细胞凋亡,此研究结果为七叶皂苷今后作为治疗白血病的辅助药物提供实验依据.

柚皮素诱导K562细胞凋亡与Caspase-3/Caspase-8酶活性及FAS/FASL蛋白表达的关系

本研究旨在探讨柚皮素(naringenin)在体外诱导K562细胞凋亡及其相关机制.采用体外培养K562细胞,用不同浓度的柚皮素处理;用MTT法测定细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测柚皮素作用后细胞凋亡率;透射电子显微镜观察柚皮素对K562细胞形态学的影响;caspase分光光度计法检测柚皮素作用后细胞内caspase-3和csapare-8活性的改变;细胞免疫化学染色检测柚皮素作用后细胞内FAS和FASL的表达.结果表明:柚皮素对K562细胞具有增殖抑制作用,并呈浓度和时间依赖性(p<0.05);在柚皮素作用下,出现典型亚G1峰,细胞凋亡率随柚皮素浓度的增高而增高(P<0.05);电子显微镜下细胞形态呈现凋亡征象;随着柚皮素浓度的增高,细胞内caspase3和caspase-8酶活性增高(P<0.05),FAS表达上升,FASL表达下降(p<0.05).结论:柚皮素在体外对K562细胞有诱导凋亡作用,而提高FAS的表达,降低FASL的表达,诱导caspase-3和caspase-8活化,可能是其作用机制.

人成骨细胞系hFOB1.19生物学特性的研究

本研究以成骨细胞系hFOB1.19(hFOBs)为对象,探讨成骨细胞在造血调控中的作用.采用RT-PCR检测hFOB多能干细胞的标志(Oct-4,Rex-1,hTERT)的表达及体外向脂肪细胞诱导分化程度,以测定其多向分化的能力.用流式细胞术(FCM)检测hFOB的细胞表型,RT-PCR检测细胞因子(SCF,IL-6,IL-11,SDF-1α,GM-CSF及G-CSF)的表达,并和骨髓来源的问充质干细胞(BM-MSC)进行比较.结果表明:hFOBs可表达Oct-4、Rex-1多能干细胞的标志,但不表达hTERT;体外诱导分化实验证实hFOB具有多向分化潜能.FCM发现hFOBs和BM-MSC具有相同的细胞表型,均表达CD44、CD73(SH3)、CD105(SH2)及CD90(Thy-1),但不表达CD34、CD45、HLA-DR等造血细胞标记.RT-PCR检测还发现:hFOBs和BM-MSC均表达SCF,IL-6,IL-11,SDF-1α等细胞因子mRNA,但hFOBs还能表达GM-CSF和G-CSF.结论:人成骨细胞系hFOB1.19可能是处于较早阶段的成骨祖细胞,表达多种造血相关的细胞因子,是研究成骨细胞调控造血的较好的模式系统.

糖基化修饰后人血小板形态、超微结构及功能的研究

经糖基化修饰可使4℃保存的血小板在输入体内后延长其存活.本研究探讨尿苷二磷酸半乳糖(UDP Gal)糖基化修饰对血小板形态、结构、功能以及其膜糖蛋白的影响.实验分为室温对照组、冷藏对照组和修饰组.用荧光标记的特异凝集素(FITC-RCA Ⅰ)检测膜糖蛋白糖残基变化,用扫描、透射电镜观察修饰后血小板形态和超微结构的变化,用比浊法测定血小板聚集率,用流式细胞术检测血小板膜蛋白CD42b、膜表面标志CD62P以及血小板凋亡标志annexin Ⅴ结合率.结果表明,UDP-Gal修饰组RCA Ⅰ结合率显著高于室温对照组和冷藏对照组(p<0.01);与新鲜血小板相比,UDP-Gal处理后的血小板超微结构无明显变化,而冷藏对照组则有伪足延伸等形态学改变;修饰后大聚集率可达新鲜血小板的50%以上;血小板膜蛋白CD42b、膜表面标志CD62P及annexin Ⅴ结合率与室温对照组相比均无明显差异.结论:UDP-Gal可使β-半乳糖有效地结合于链聚糖末端,糖基化血小板仍然具有较强的聚集活性和相对完整的超微结构,功能基本正常.

Jak2v617f点突变与原发性血小板增多症的临床相关性研究

为探讨iak2v617f点突变与原发性血小板增多症(primary thrombocythemia,PT)的临床相关性,回顾性统计66例PT患者的临床及实验室检查资料,应用等位基因特异性-聚合酶链反应(AS-PCR)检测jak2v617f点突变,分析比较iak2v617f点突变阳性与阴性两组患者的临床及实验室指标.结果显示:66例PT患者中27例存在jak2v617f点突变,突变率为41%.jak2v617f点突变阳性和阴性两组患者初诊时骨髓红系百分比为(26.9 4±9.4)%和(16.3±8.7)%(p<0.05),粒红比为2.9±1.8和5.2±2.9(p<0.05),初诊及随访过程中微血管障碍发生率为29.6%和5.1%(p<0.05),差异有统计学意义;骨髓粒系百分比、外周血白细胞计数、血红蛋白、血小板计数及血栓事件发生率均无统计学差异.结论:AS-PCR检测原发性血小板增多症患者中jak2v617f点突变阳性率为41%,jak2v617f点突变阳性的原发性血小板增多症患者初诊时骨髓红系增生明显活跃.