中国生物制品学杂志
Chinese Journal of Biologicals 중국생물제품학잡지
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
- 影响因子： 0.41
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1004-5503
- 国内刊号： 22-1197/Q
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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人表皮生长因子受体显性负性突变体对胃癌细胞体外生长能力的影响
目的 探讨人表皮生长因子受体显性负性突变体(dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR)对人胃癌细胞体外生长能力的影响及其分子机制.方法 用质粒pEGFPN1-DNEGFR转染人胃癌NCI-N87和SGC-7901细胞,并筛选稳定转染细胞株;采用MTT法检测人胃癌细胞体外生长能力,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记[terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) mediated deoxyuridine triphosphate(dUTP) nick-end labeling,TUNEL]法检测细胞凋亡情况,ELISA法检测胞浆中活性caspase-3蛋白水平,Western blot法检测ser 9位点磷酸化糖原合成激酶-3β[phosphorylated glycogen synthase kinase-3 beta,pGSK-3β(ser 9)]蛋白表达水平.结果 成功筛选出4株稳定转染细胞株;质粒pEGFPN1-DNEGFR分别转染的NCI-N87和SGC-790细胞体外生长能力均降低,凋亡指数(apoptotic index,AI)均升高,胞浆中活性caspase-3蛋白水平均升高,pGSK-3β(ser 9)蛋白水平均降低,与对应的空质粒转染组及未转染组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 DNEGFR通过caspase相关的凋亡信号转导通路及糖原合成激酶-3β(GSK-3β)促凋亡作用诱导胃癌细胞凋亡,使其体外生长能力明显降低,为DNEGFR在胃癌生物治疗中的深入研究提供了部分理论依据,为胃癌的生物治疗提供了新思路.
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TF-CTP-OD2-HA融合蛋白的原核表达及纯化
目的 构建pCold-TF-CTP-OD2-HA原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白.方法 以前期构建的质粒p32a(+)CTP-OD-HA为模板,PCR扩增寡聚化结构域(Oligomerization domain,OD)中起关键作用的OD2基因序列,与胞浆转导肽(Cytoplasmic transduction peptide,CTP)和流感病毒血凝素抗原表位(Hemagglutinin,HA)连接后,克隆至pCold-TF-DNA质粒中,构建质粒pCold-TF-CTP-ODrHA,同时构建质粒pCold-TF-CTP-HA作为对照.将两种质粒分别转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 质粒pCold-TF-CTP-OD2-HA和pCold-TF-CTP-HA经PCR、双酶切和测序鉴定构建正确;表达的融合蛋白TF-CTP-OD2-HA和TF-CTP-HA相对分子质量分别约为63 000和58 000,两种融合蛋白均主要存在于破菌上清中,表达量分别约占菌体总蛋白的32％和25％,破菌沉淀中有少量表达;纯化的融合蛋白纯度均达95％以上,均可与鼠抗HA-tag多克隆抗体特异性结合.结论 成功构建了pCold-TF-CTP-OD2-HA原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化了融合蛋白,为后续研究其在CML中的作用机制奠定了基础.
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microRNA-143阻遏乳腺癌细胞免疫抑制的作用及其机制
目的 探讨microRNA-143(miR-143)阻遏乳腺癌细胞免疫抑制的作用及其分子机制.方法 采用MTT法检测乳腺细胞HBL-100和乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、BT549补体依赖的细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC);在脂质体介导下,将miR-143、miR-143对照物(scramble)和miR-143抑制剂(inhibitor)分别转染MCF-7细胞,将miR-143 scramble和miR-143 inhibitor分别转染HBL-100细胞,采用MTT法检测CDC,RT-PCR法检测细胞中补体调节蛋白CD46基因mRNA的转录水平,Western blot法检测CD46蛋白的表达水平.结果 乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、BT-549的A570值与正常乳腺细胞HBL-100相比,均明显升高(P＜0.01);与miR-143 scramble转染的MCF-7细胞的A570值相比,miR-143转染组的A570值明显下降(P＜0.001),与miR-143 scramble转染的HBL-100细胞的A570值相比,miR-143 inhibitor转染的HBL-100细胞的A570值明显上升(P＜0.001);与HBL-100细胞相比,CD46蛋白在MCF-7、MDA-MB-231和BT-549细胞中表达均上调,且与抑制CDC的作用呈正相关;在HBL-100细胞中过表达miR-143 inhibitor能上调CD46蛋白的表达水平,而不影响CD46基因mRNA的转录水平;在MCF-7细胞中过表达miR-143能明显抑制CD46蛋白的表达水平.结论 CD46在乳腺癌细胞中的上调导致了癌细胞对CDC的抵抗作用,是产生免疫抑制的机制之一;miR-143通过抑制CD46蛋白的表达水平,使细胞对CDC的作用更为敏感,提高了补体系统对乳腺癌细胞的杀伤作用,降低了其免疫抑制能力.
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毕赤酵母组成型表达载体的构建及报告蛋白表达评价
目的 构建毕赤酵母(Pichia pastoris)组成型分泌表达载体,并表达报告蛋白葡萄球菌核酸酶(staphylococcus nuclease,SNase,NucA),以评价其表达外源蛋白的能力.方法 从巴斯德毕赤酵母GS115基因组中PCR扩增毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter,pGAP)片段,克隆至载体pPIC9K中,构建组成型分泌表达载体pGHKα;从金黄色葡萄球菌基因组中PCR扩增编码报告蛋白金黄色葡萄球菌NucA成熟肽的序列nucA,克隆至载体pGHKα中,构建重组表达质粒pGHKα-nucA,经Sac Ⅰ和BglⅡ依次酶切线性化后,电转化至毕赤酵母GS115中;PCR及TB-D平板法筛选阳性重组酵母菌;Tricine-SDS-PAGE检测表达产物;琼脂扩散法检测重组酵母菌表达上清液的核酸酶活性.结果 组成型分泌表达载体pGHKα经PCR鉴定,证明构建正确;重组表达质粒pGHKα-nucA经PCR及测序鉴定,证明nucA基因片段正确插入载体pGHKα中;重组酵母菌GS115/pGHKα-nucA经PCR及TB-D平板法检测证明构建成功;表达的目的蛋白相对分子质量约为17 000,表达量约占上清总蛋白的42％,且具有显著的核酸酶活性.结论 成功构建了毕赤酵母组成型分泌表达载体pGHKα,其能正确表达报告蛋白NucA,且表达的蛋白能分泌到细胞外,表达效率高,为异源蛋白在毕赤酵母中的安全高效表达奠定了基础.
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结核分枝杆菌ATP依赖的丝氨酸蛋白酶调节亚基C2基因原核表达质粒的构建及表达
目的 构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)ATP依赖的丝氨酸蛋白酶调节亚基C2(ATP-dependent Clp regulatory subunit C2,ClpC2)基因的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达重组蛋白.方法 以MTBH37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增ClpC2基因,插入表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-ClpC2,经双酶切及测序鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果 重组表达质粒经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约46 000,可与鼠抗组氨酸单克隆抗体特异性结合.结论 已成功构建了重组表达质粒pET32a(+)-ClpC2,并在大肠埃希菌中表达了重组蛋白,为进一步研究ClpC2蛋白的生物学功能奠定了基础.
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SCAP-SREBP-1c-ACC1在内质网应激状态下肝细胞脂肪变性中的作用
目的 探讨SCAP-SREBP-1c-ACC1信号通路在内质网应激状态下肝细胞脂肪变性中的作用.方法 以人肝细胞L02及人肝肿瘤细胞HepG2为研究对象,利用1μmol/L毒胡萝卜素(Thapsigargin)诱导肝细胞建立内质网应激模型,设未处理细胞作为对照;采用酶比色法检测细胞内甘油三酯含量,Real-time PCR法检测固醇调节元件结合蛋白-1c裂解激活蛋白[sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c) cleavage-activating protein,SCAP]基因mRNA水平,Western blot法检测葡萄糖调节蛋白-78(glucose-regulated protein-78,GRP-78)、SCAP、SREBP-1c、乙酰辅酶A羧化酶1(acetyl-CoA carboxylase 1,ACC1)蛋白的表达水平.结果 在内质网应激状态下,实验组两种细胞中甘油三酯水平、SCAP基因mRNA水平以及GRP-78、SCAP、SREBP-1c、ACC1蛋白的表达水平较对照组均明显增加(P均＜0.01).结论 已成功建立内质网应激脂肪变性细胞模型.SCAP-SREBP-1 c-ACC1信号通路可能介导内质网应激状态下肝细胞脂肪变性.
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肝X受体激动剂对大鼠肝移植缺血再灌注损伤的保护作用
目的 观察肝X受体(liver X receptor,LXR)激动剂GW3965预处理对大鼠肝移植缺血再灌注损伤(ischemiareperfution injury,IRI)的影响及其对肝功能的保护作用.方法 将雄性SD大鼠随机分为2组,GW3965预处理组于供体大鼠尾静脉注射LXR激动剂GW3965,0.3 mg/kg;对照组于相同部位注射相同剂量的生理盐水.参照改进的Kamada两袖套法建立大鼠原位肝移植模型,分别于肝移植术后3、6、24 h,采用全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)含量,ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量,Western blot法测定移植肝脏组织中白细胞介素-1受体相关激酶-4(interleukin-1 receptor-associated kinase-4,IRAK-4)、干扰素调节因子3(interferon-regulator 3,IRF3)蛋白的表达,凝胶迁移试验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)测定核因子-kappa B(nuclear factor-κB,NF-κB)的相对活性度,并观察肝脏组织的病理学变化.结果 与对照组比较,GW3965预处理组血清中ALT、TNF-α含量在各时间点均明显降低(P＜0.05),肝脏组织中IRAK-4、IRF3蛋白的表达以及NF-κB相对活性度也明显降低(P＜0.05);GW3965预处理组各时间点肝组织的损伤均较对照组明显减轻.结论 LXR激动剂GW3965可抑制TLR4信号通路中的IRAK-4、IRF3蛋白的表达水平和NF-κB的活化,从而减轻肝移植IRI,在肝脏移植IRI中起到保护作用.
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钙调神经磷酸酶对金黄色葡萄球菌肠毒素C2超抗原活性的作用
目的 探讨钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)对金黄色葡萄球菌肠毒素C2(staphylococcal enterotoxin C2,SEC2)发挥超抗原活性的作用.方法 以终浓度为0.5、1、2、3和4μg/ml的重组野生型rSEC2及其增强型突变体蛋白mSEC2(T20L/G22E/H118A/H122A)刺激SD大鼠脾淋巴细胞,MTT法检测大鼠脾淋巴细胞增殖水平;检测终浓度为1 μg/ml的rSEC2和mSEC2在诱导大鼠脾淋巴细胞增殖过程中CaN活性的变化、终浓度为0.1、0.5、1、2和3μg/ml的CaN特异性抑制剂环孢菌素A(cyclosporine A,CsA)对该过程的影响,以及CaN3个亚基CaN Aα、CaN Aβ、CaN B在mRNA水平上的变化.结果 在低浓度rSEC2和mSEC2刺激下,大鼠脾淋巴细胞增殖指数(proliferation index,PI)与给药浓度成正比,高浓度刺激下,可明显抑制大鼠脾淋巴细胞的增殖,1μg/ml浓度增殖效果好;CsA对大鼠脾淋巴细胞增殖具有较强的抑制作用,呈明显的剂量依赖性,当CsA浓度为0.5～1 μg/ml时,rSEC2和mSEC2的刺激作用即被完全抑制;CaN的活性及其相关亚基(CaN Aβ和CaN B)mRNA水平与其超抗原的刺激增殖活性具有明显相关性.结论 CaN对SEC2发挥超抗原活性具有重要作用,为提高SEC2的临床应用价值及规避毒副作用奠定了理论基础.
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重组人锰超氧化物歧化酶的胃蛋白酶酶解特性及其稳定性
目的 探讨重组人锰超氧化物歧化酶(rhMn-SOD)的胃蛋白酶酶解特性及其稳定性.方法 在37℃条件下,用模拟胃液(0.084 mol/L HCl,35 mmol/L NaCl,pH 2.0,4 000 U胃蛋白酶)处理rhMn-SOD不同时间,SDS-PAGE分析酶解效果;使用总SOD测定试剂盒检测rhMn-SOD在不同温度(25、37、45、55、65、75℃)下保存不同时间(10、20、30、40、50、60 min)、不同pH(4.0～10.0)、不同化合物(氯仿、甘油、DMSO、10％ SDS、β-巯基乙醇、苯酚、30％H2O2)处理后及日光和紫外照射后的相对活力.结果 rhMn-SOD在模拟胃液中处理2 min即可完全酶解.在25～55℃范围内,rhMn-SOD具有较好的热稳定性,在65～ 75 ℃范围内,rhMn-SOD的热稳定性较差;在pH6.0～8.0范围内,rhMn-SOD具有较好的稳定性;rhMn-SOD对甘油和氯仿不敏感,经DMSO、SDS处理后,活力大幅下降,经β-巯基乙醇、苯酚、30％ H2O2处理后,基本失活;rhMn-SOD经日光和紫外照射3h,活力基本不变.结论 分析了rhMn-SOD的胃蛋白酶酶解特性、热稳定性、pH稳定性、对不同化合物的敏感性以及光稳定性,为其广泛应用于化妆品、药品、食品添加剂等领域奠定了基础.
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枯草芽孢杆菌耐热丝氨酸蛋白酶基因的克隆与表达
目的 克隆、表达枯草芽孢杆菌耐热丝氨酸蛋白酶基因,并检测其酶学性质.方法 从枯草芽孢杆菌染色DNA中,PCR扩增枯草芽孢杆菌耐热丝氨酸蛋白酶基因Sapr,插入载体pET-28a(+)中,构建重组分泌型表达质粒pET-28a-Sapr,热激转化大肠埃希菌(E.coli)BL21 (DE3),25及37℃条件下,IPTG诱导重组蛋白表达,表达的重组蛋白经10％ SDS-PAGE分析,并采用Folin法测定酶活性.结果 重组表达质粒经双酶切及PCR鉴定,证明构建正确,测序结果表明与GenBank中登录的序列同源性达100％;表达的重组蛋白相对分子质量约39 600,佳诱导温度为25℃,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的12％;重组菌发酵产物酶活性为322 U/ml.结论 在大肠埃希菌中成功表达的特异蛋白具有生物学活性,为进一步研究改性分离蛋白的功能特性奠定了基础.
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朊病毒病相关miRNA在不同发病脏器和细胞中表达的变化
目的 利用Real-time PCR法检测朊病毒病相关miRNA在不同发病脏器和细胞中的表达变化.方法 提取羊痒病因子22L毒株感染的BALB/c小鼠大脑、海马、延髓、脾脏以及羊痒病因子22L毒株感染的鼠神经瘤ScN2a细胞总RNA,通过特殊设计的茎环结构的反转录引物进行反转录,应用ABI step one plus system定量PCR仪进行定量检测;对Real-time PCR进行特异性和重复性验证;采用SYBR Green荧光染料法,以U6 RNA作为内参照,2-△△Q法进行miRNA表达相对定量分析,检测小鼠发病脏器中和细胞中miR-7a、miR-128、miR-135a、miR-146a、miR-152、miR-24-2*、miR-380-3p、miR-448-5p的表达.结果 Real-time PCR法检测朊病毒病相关miRNA特异性和重复性良好.各组中miRNA改变5倍以上的有发病终末期小鼠大脑中的miR-146a,海马中的miR-128、miR-135a、miR-152,延髓中的miR-448-5p,ScN2a细胞中的miR-146a,脾脏中的miR-152,其中脾脏中的miR-152显著上调,为18.98倍.结论 朊病毒病中这些上调或下调的miRNA能调控细胞内多种代谢和信号传导途径发生异常,引起细胞及组织器官发生病理学变化.
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重组质粒pcDNA3.1-Her2-hsp70的构建及其表达
目的 构建重组表达质粒pcDNA3.1-Her2-hsp 70,并筛选稳定表达Her2蛋白的细胞株.方法 采用RT-PCR法扩增人乳腺癌SKBR-3细胞中Her2和hsp70基因,插入质粒pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Her2、pcDNA3.1-hsp70,经双酶切后,回收hsp70基因,连接人质粒pcDNA3.1-Her2的N-末端,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Her2-hsp 70.将质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1-Her2-hsp70分别转染小鼠乳腺癌4T-1细胞,采用Westernblot法检测Her2蛋白的表达.结果 重组表达质粒pcDNA3.1-Her2、pcDNA3.1-hsp70及pcDNA3.1-Her2-hsp70经双酶切鉴定,证明构建;转染质粒pcDNA3.1-Her2-hsp70的4T-1细胞中可见相对分子质量约65 000的Her2蛋白的表达.结论 已成功构建了重组质粒pcDNA3.1-Her2、pcDNA3.1-hsp70及pcDNA3.1-Her2-hsp70,并获得了稳定表达Her2蛋白的小鼠乳腺癌4T-1细胞,为进一步探讨佐剂辅助异种抗原产生的抗肿瘤免疫效应奠定了基础.
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重组人脂蛋白相关磷脂酶A2的原核表达及其纯化
目的 原核表达并纯化重组人脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2,LP-PLA2),并初步确定其保存条件.方法 将重组表达菌pCold TF-LP-PLA2-BL21 (DE3)和pET28-HRV 3C-BL21 (DE3)分别经IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经SDS-PAGE鉴定后,经Ni-Sepharose 6FF金属螯合层析粗提重组蛋白,经HRV 3C蛋白酶酶切去除融合标签后,用Blue Sepharose(R)6 Fast Flow(蓝胶)染料亲和层析及HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR分子筛进行分离纯化;通过人LP-PLA2临床检测金标准ELISA试剂盒验证重组蛋白;将重组LP-PLA2置于含10 mmol/L CHAPS和0.5 mmol/L PMSF的PBS溶液中,分别于4℃、室温、37℃保存1周以及-20、-80℃冻存4个月后,确立重组蛋白的保存条件.结果 重组LP-PLA2相对分子质量约100 000,以可溶性形式表达,包涵体无表达;纯化后的重组LP-PLA2蛋白含量为3.68 mg/ml,蛋白回收率为21％,纯度可达95％,可被ELISA试剂盒识别,且具有良好的线性关系(R2=0.996 4);重组LP-PLA2于4℃保存1周,-20、-80 ℃冻存4个月,均无降解现象.结论 成功表达、纯化了重组LP-PLA2,并初步确定了其保存条件.
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血管紧张素转换酶2过表达对大鼠急性心肌梗死后心室重构的影响及其分子机制
目的 探讨血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)过表达对大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后心室重构的影响及其可能的分子机制.方法 采用开胸结扎冠状动脉法建立SD大鼠AMI模型,将模型大鼠随机分为MI、MI+(NS)、MI+ AdEGFP、MI+ AdACE2组,另设SHAM(假手术)组,每组15只,MI+ NS、MI+ AdEGFP和MI+ AdACE2组沿心肌梗死周边区选取5个点,通过直接心肌内注射方式分别注射NS、AdEGFP和AdACE2,SHAM和MI组不注射.术后4周末,采用Western blot法检测大鼠心肌梗死周边区心肌组织中ACE2、α-SMA、MKP-1、ERK1/2、p-ERK1/2、P38、TGF-β1蛋白的表达;HE染色后于普通显微镜下观察心肌组织结构及细胞炎症变化,天狼猩红-饱和苦味酸染色后于普通显微镜及偏振光显微镜下分别观察心肌胶原表达分布情况;SP免疫组化染色法检测大鼠心肌梗死周边区心肌组织中AngⅡ、Ang(1-7)、α-SMA蛋白的表达,同时采用ELISA法检测Ang(1-7)蛋白的表达;使用羟脯氨酸试剂盒检测大鼠心肌梗死周边区心肌组织中羟脯氨酸含量.结果 术后4周末,MI+ AdACE2组大鼠心肌梗死周边区心肌组织中ACE2蛋白的表达量显著高于其他各组,同时Ang(1-7)蛋白的表达量也显著升高(P＜0.05);与SHAM组相比,MI、MI+ NS、MI+ AdEGFP组大鼠心肌梗死周边区心肌组织中AngⅡ、Ang(1-7)、α-SMA蛋白的表达量显著升高(P＜0.05),MI+AdACE2组与MI、MI+NS、MI+AdEGFP组相比,AngⅡ、α-SMA蛋白表达水平降低,Ang(1-7)蛋白表达水平升高更显著;与MI、MI+ NS、MI+ AdEGFP各组相比,MI+ AdACE2组大鼠心肌梗死周边区心肌组织中MKP-1蛋白的表达水平明显增加(P＜0.05),p-ERK、P38、TGF-β1蛋白的表达水平降低,羟脯氨酸含量显著降低(P＜0.05);HE染色和天狼猩红-饱和苦味酸染色证实,ACE2对AMI后梗死周边区的炎症反应和胶原重塑均有明显的改善作用.结论 ACE2在心肌过表达能有效改善大鼠AMI后心肌梗死周边区心肌纤维化进程,缓解心室重构,其机制可能与ACE2调节肾素-血管紧张素系统(rennin-angiotensin system,RAS)、平衡丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)活性相关.
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绿脓杆菌外毒素A受体结合亚基-结核分枝杆菌热休克蛋白65融合蛋白的表达及纯化
目的 在大肠埃希菌中融合表达绿脓杆菌外毒素A(pseudomonas exotoxin A,PEA)受体结合亚基-结核分枝杆菌热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65),并进行纯化.方法 从含PEA的质粒中扩增PEA受体结合区亚基PEA Ⅰ,克隆至pET-28a-HSP65质粒中,构建重组表达质粒pET-28a-HSP65-PEA Ⅰ,转化大肠埃希菌(E.coil)BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE分析;利用抗PEA受体结合区单抗杂交瘤细胞制备抗PEA受体结合亚基单抗,偶联免疫亲和层析介质,将表达的重组蛋白经DEAE Sepharose 4FF阴离子交换层析、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析和免疫亲和层析进行纯化.结果 重组质粒经PCR鉴定及测序,证明构建正确;表达的重组HSP65-PEA Ⅰ蛋白相对分子质量约93 000,主要以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的30％以上;抗PEA受体结合亚基单抗效价可达1∶10000.纯化的重组HSP65-PEA Ⅰ蛋白纯度达90％以上.结论 已成功在大肠埃希菌中表达并纯化了重组融合蛋白HSP65-PEA Ⅰ,为防止PA感染后多器官衰竭综合征的免疫制剂的研究奠定了基础.
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人凝血因子Ⅷ中试纯化工艺的质量控制
目的 对以PEG沉淀结合离子交换层析制备的人凝血因子Ⅷ(human coagulation factorⅧ,FⅧ)的中试纯化工艺进行全程质量控制.方法 收集FⅧ中试纯化工艺的样品,采用凝固法检测FⅧ凝固活性、BCA法检测总蛋白含量,计算比活性;采用免疫浊度法检测白蛋白(albumin,ALB)、IgG、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)及纤维连接蛋白(fibronectin,FNC)含量;采用双抗体夹心ELISA法检测FⅧ及von Willebrand因子(von Willebrand factor,vWF)抗原含量;采用SDS-PAGE及Western blot法分析FⅧ特异性;参考《中国药典》(三部)2010版检测成品中PEG、Tween 80及磷酸三丁酯[tri(n-butyl) phosphate,TNBP]残留量.结果 层析去掉了大部分杂蛋白,层析后比活性提高了近20倍,原液比活性达到66.92 IU/mg.PEG沉淀和DEAE层析纯化,基本去除了ALB、IgG、FIB和FNC,仅有少量FⅧ抗原及活性损失,原液主要成分为FⅧ和vWF.DEAE层析洗脱峰样品在相对分子质量约95 000和72 000之间可见一条特异性条带,与FⅧ轻链(相对分子质量80000)及冻干FⅧ国家标准品条带位置相符.PEG、Tween 80及TNBP残留量均符合《中国药典》(三部)2010版规定的FⅧ质量标准.结论 本中试纯化工艺可制备出高纯度、高比活性的FⅧ.
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生物反应器培养分泌重组人干扰素β 1a的CHO细胞工艺的建立
目的 建立生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a(IFNβ1a)的CHO细胞的工艺,探讨CHO细胞表达分泌IFNβ1a的反应动力学规律.方法 应用15L生物反应器悬浮微载体方式培养CHO工程细胞,比较不同时期细胞的生长形态、数量、生物活性、灌流量、葡萄糖消耗量及其他物理参数的变化规律.结果 15L生物反应器中在初始pH 6.86～7.20,溶氧30％～ 70％,温度36.8 ～ 37.2℃,微载体4 g/L,罐流量6.5 L/h的条件下连续培养40 d,CHO工程细胞的密度维持在5×105个/ml之间,收获的细胞液中重组人IFNβ1a的生物活性为2.5×104～4.0×105 IU/ml,葡萄糖消耗量在0.5～2.5 mg/ml之间.结论 初步建立了15 L生物反应器培养分泌重组人IFNβ1a的CHO细胞的工艺,为进一步建立工业化生产工艺奠定了基础.
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肉毒梭菌培养液澄清过滤工艺的优化
目的 优化肉毒梭菌培养液的澄清过滤工艺,并对过滤效果进行验证.方法 选择不同型号的过滤器组合对A型肉毒梭菌培养液进行一级、二级澄清过滤,筛选佳过滤器组合;用佳过滤器组合对扩大培养批量的A、B、E、F型肉毒梭菌培养液进行澄清过滤.结果 P700K+ 50P过滤器组合对A型肉毒梭菌培养液进行一级、二级澄清过滤的效果佳;用该过滤器组合对扩大培养批量的A、B、E、F型肉毒梭菌培养液进行澄清过滤,各型均可达到预期的试验目标.结论 筛选出P700K+ 50P为A、B、E、F型肉毒梭菌培养液澄清过滤的佳过滤器组合,为肉毒梭菌培养液澄清过滤工艺的进一步优化提供了实验依据.
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检测人凝血因子Ⅷ蛋白质含量的BCA法的优化及验证
目的 优化检测人凝血因子Ⅷ(FⅧ)蛋白质含量的BCA法,并进行验证.方法 对BCA法检测人FⅧ的蛋白质含量进行优化:模拟试管法进行化学反应,微量板法进行读数和计算;对优化后的BCA法的耐用性、标准曲线的线性和范围、准确性、重复性、中间精密性进行验证,并与传统的钨酸沉淀法、免疫散射比浊法和优化的凯氏定氮法的检测结果进行比较.结果 BCA法检测人血白蛋白(human serum albumin,HSA)蛋白质含量的可信区间为100～800 μg/ml.甘氨酸和赖氨酸的浓度小于125 mmol/L时,对BCA法检测结果无干扰;以HSA作为标准品绘制的标准曲线的可信区间为62.5 ～1 000 μg/ml,人FⅧ工艺样品在以HAS和BSA作为标准品绘制的两种标准曲线下的检测值差异无统计学意义(P＞0.05);BCA法的准确性、重复性、中间精密性均符合验证要求;BCA法检测结果与优化后的凯氏定氮法相关性良好.结论 优化了检测人FⅧ蛋白质含量的BCA方法,该法用于人FⅧ生产工艺中间品的质量控制是可行的.
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治疗用质粒DNA CTAB纯化工艺的优化
目的 优化治疗用质粒DNA十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)纯化工艺,为其规模化生产奠定基础.方法 采用碱裂解法裂解含质粒pEGFP的大肠埃希菌(E.coli)DH5α菌种,在碱裂解液中加入不同终浓度的CTAB及不同终浓度的NaCl、KAc、LiCl、CaCl2、MgCl2溶液,确定CTAB纯化质粒DNA的佳浓度,并分析盐对质粒DNA选择性释放的影响.分别采用BCA蛋白浓度测定试剂盒、内毒素检测试剂盒和Real time-PCR法检测纯化的质粒DNA中宿主蛋白含量、内毒素含量和细菌基因组DNA含量;通过A549细胞及动物转染试验检测纯化质粒DNA的体外和体内生物活性.结果 CTAB纯化质粒DNA的佳浓度为0.004％;用NaCl、KAc或LiCl提取的质粒DNA中,RNA均未完全去除,而用CaCl2或MgCl2提取的质粒DNA中,RNA含量(RNA/nucleic acid)均小于1％,CaCl2佳终浓度范围为0.4～0.5 mol/L,MgCl2佳浓度范围为0.3～0.4 mol/L;使用0.4 mol/LMgCl2的CTAB法纯化的质粒pEGFP的杂蛋白质、细菌基因组DNA、内毒素和RNA含量均符合FDA对治疗用质粒DNA的要求;纯化的质粒pEGFP DNA回收率达80％以上,且体外生物活性显著高于市售试剂盒纯化的质粒(P＜0.05),而体内生物活性与试剂盒纯化的质粒相当(P＞0.05).结论 优化了CTAB法纯化质粒DNA的工艺,该方法操作简便,经济高效,纯化得到的质粒DNA各项指标均符合FDA质量标准,且转染基因表达效率较高,质量可靠,适用于质粒DNA的大规模纯化生产.
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基因治疗用pUC118-ski质粒DNA纯化工艺的建立及其质量控制
目的 建立基因治疗用pUC 118-ski质粒DNA的纯化工艺,并进行质量鉴定.方法 采用碱裂解法粗提质粒,PEG/MgCl2沉淀法初步纯化后,依次通过Sepharose 6 FF分子筛层析、PlasmidSelect Xtra亲和层析和SOURCE30Q离子交换层析纯化质粒DNA.纯化的质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳分析超螺旋质粒的比例;紫外分光光度计测定质粒的A260和A280值,以A260/A280比值评价其纯度;CCK-8法检测质粒促原代培养的大鼠皮肤成纤维细胞的增殖活性;BCA法和鲎试剂凝胶法分别检测质粒DNA中残留的蛋白质和内毒素含量;PCR法检测质粒中细菌基因组DNA的含量.结果 经Sepharose 6 FF分子筛层析可有效去除质粒DNA中的RNA,经PlasmidSelect Xtra亲和层析能将超螺旋质粒DNA(scDNA)与开环质粒DNA(ocDNA)有效分离,经SOURCE30Q离子交换层析获得的质粒DNA纯度很高,但出现了少量ocDNA.获得的质粒DNA纯品中超螺旋质粒所占比例大于90.5％;纯度(A260/A280)为1.83;促原代培养的大鼠成纤维细胞的增殖活性与空载体组相比提高了22.9％ (P＜0.05),与纯化前的质粒促细胞增殖活性一致;内毒素含量小于50 Eu/mg;几乎检测不到蛋白质残留;细菌基因组DNA残留量小于1.2μg/mg.结论 建立了基因治疗用pUC 118-ski质粒DNA的纯化工艺,纯化产品的质量指标均符合国家食品药品监督管理局(SFDA)的标准,为申请该基因药物的临床试验及大规模制备质粒DNA奠定了基础.
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响应面法优化14型肺炎链球菌荚膜多糖的超滤工艺
目的 利用响应面法优化14型肺炎链球菌荚膜多糖的超滤工艺.方法 选择跨膜压力、切向流量及多糖浓度为自变量,膜包处理能力为响应值,采用Box-Behnken设计分析各自变量及其交互作用对膜包处理能力的影响;利用Design Expert软件对数据进行回归分析,得到回归方程的预测模型,取3批14型肺炎链球菌荚膜多糖水溶液,对优化的工艺参数进行验证;按照佳超滤工艺对3批14型肺炎链球菌荚膜多糖水溶液进行等体积透析,确定超滤终点;并对纯化的荚膜多糖进行各项检定.结果 优化的14型肺炎链球菌荚膜多糖超滤工艺为:跨膜压力12.8 Psi,切向流量66 L/h,多糖浓度0.86 g/L,适透析倍数为5倍,在该条件下,膜包处理能力的理论值为91.7 g/(h·m2),实际值为91.9g/(h·m2).3批纯化的14型肺炎链球菌荚膜多糖水溶液的多糖组分均符合《欧洲药典》7.0版相关规定,均未检出残余脱氧胆酸钠和乙醇,3批多糖的相对分子质量均大于420 000,抗原性良好,且抗原物质成分无差异.结论 响应面法优化的14型肺炎链球菌荚膜多糖超滤工艺显著提高了工作效率,降低了生产成本,为14型肺炎链球菌荚膜多糖的规模化生产提供了实验依据.
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酵母多糖的提取、水解及组分分析
目的 对啤酒酵母多糖进行提取和水解,并对获得的酵母多糖组分进行分析.方法 采用碱法-酶法提取啤酒酵母多糖,并进行提纯,采用苯酚-硫酸法测定所提取多糖中的总糖含量,并计算多糖收率,凯氏定氮法测定蛋白含量.用三氟乙酸法(trifluoroacetic acid,TFA)水解多糖,采用Waters suger park-1色谱柱和蒸发光检测器进行液相检测,以确定不同酵母多糖的组分.结果 获得的3种酵母多糖成分DT1、DT2、DT3的总糖含量分别为94.61％、95.89％、94.56％,收率分别为9.3％、3.6％、23.4％,各多糖的蛋白含量分别为2.98％、1.89％、3.34％.用2 mol/L的TFA,于110 ℃下水解6h,对标准葡聚糖的水解率可达95％,且对3种酵母多糖均有较好的水解效果.通过碱法-酶法可获得甘露聚糖DT1;可溶性葡聚糖DT2,葡聚糖含量占总糖含量的90.6％;不溶性葡聚糖DT3,葡聚糖含量占总糖含量的98％以上;3种多糖均含有少量的蛋白质.结论 碱法-酶法提取酵母可获得3种高纯度的酵母多糖,2 mol/L的TFA在110 ℃下对酵母多糖水解6h,适于多糖组分的分离分析.
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基于RIG-I的狂犬病病毒免疫逃逸机制
狂犬病是重要的人兽共患疾病,在我国,每年约有2000 ～ 3000人死于狂犬病.固有免疫是机体针对病毒等病原的第一道非特异的防线,同时,也对特异性的获得性免疫应答产生影响.目前,固有免疫中RIG-I通路及其抗病毒作用机制研究深入广泛.狂犬病病毒进化中获得诸多针对宿主特别是固有免疫应答的逃逸机制,针对该机制的研究对于狂犬病的预防、诊断及治疗具有重要意义,同时,也为其他病毒的免疫逃逸相关研究奠定基础.
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层析技术在胸腺肽α 1生产中的应用
胸腺肽α1 (thymosin α1,Tα1)是从胸腺素组分5(thymosin fraction 5,TF5)中分离纯化的热稳定酸性多肽,具有较高的免疫增强活性及刺激血管内皮细胞迁移、促进血管生成和伤口愈合等作用,已用于乙型肝炎、丙型肝炎、恶性肿瘤以及免疫缺陷疾病等的临床治疗和研究中.本文对层析技术在3种Tα1生产方法(生物提取法、化学合成法、基因工程法)中的应用作一综述,以期为提高Tα1的生产水平提供参考.
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一次性培养瓶在水痘减毒活疫苗生产中的应用
目的 比较一次性培养瓶与方瓶培养人二倍体细胞2BS株的效果.方法 接种相同浓度的人二倍体细胞2BS株至一次性培养瓶和小方瓶中,(37±0.5)℃静置培养3d,于显微镜下观察细胞生长状态,并进行细胞计数.用0.025 ～0.05 MOI水痘-带状疱疹病毒Oka株感染2BS细胞,(35±0.5)℃静置培养3d,待细胞病变达70％以上时,收获病变细胞,制备冻干水痘减毒活疫苗,并参考水痘减毒活疫苗注册标准及《中国药典》(三部)2010版,进行各项指标检定.结果 在接种2BS细胞浓度相同的情况下,与方瓶相比,一次性培养瓶可增加一定的细胞培养面积,细胞总数相对较高;一次性培养瓶培养的2BS细胞贴壁速度较快,呈梭形,密度高,方向性好,轮廓清晰,分布均匀,胞质饱满,而方瓶培养的2BS细胞贴壁速度较慢,生长不均匀;使用一次性培养瓶及方瓶培养2BS细胞生产的水痘减毒活疫苗,各项检定指标结果均符合《中国药典》(三部)2010版相关要求,在病毒滴度无明显差异的情况下,使用一次性培养瓶可使水痘疫苗产量大幅度增加.结论 使用一次性培养瓶培养人二倍体细胞2BS株生产的水痘减毒活疫苗疫苗产量较方瓶有较大幅度的提高.
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不同抗原剂量的亚单位疫苗对小鼠的免疫效果
目的 研究不同抗原剂量的亚单位疫苗对小鼠的免疫效果.方法 将重组LTB-VP1和BSA蛋白分别用氢氧化铝吸附后,制备成不同浓度的亚单位疫苗,以100、50、20、10、5和1μg/只的剂量免疫昆明小鼠,共免疫3次.于初次免疫后第14、28、42、56天断尾采血,分离血清,采用间接ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平和特异性IgG1/IgG2a比率,并采用尿素变性法检测小鼠血清中抗体相对亲合力指数(abidity index,AI).结果 LTB-VP1和BSA抗原激发的抗体水平随免疫次数的增加而不断升高,与抗原剂量呈非线性关系,不同抗原的合适使用剂量也不相同.LTB-VP1抗原以20 μg/只剂量产生的抗体水平和抗体的AI值高;IgG1/IgG2a平均值为1.04,各剂量组Th1/Th2型免疫反应处在一种平衡状态.BSA抗原在5和100 μg/只剂量时激发的抗体水平相近,抗体的AI值差异有统计学意义(P＜0.05);IgG1/IgG2a平均值为2.4,各剂量组以Th2型免疫反应为主.结论 抗体水平不随抗原剂量的增加而增加,低剂量抗原即可产生较好的免疫效果,为兽用疫苗的临床使用提供了数据参考.
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柯萨奇病毒A组16型免疫原性及毒株间交叉保护能力的比较分析
目的 对柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus groups A type 16,CoxA 16)4个毒株进行免疫原性及毒株间交叉保护能力的比较分析.方法 提取CoxA 16 G20、KM/M08、MY08和KM208病毒RNA,PCR扩增VP1基因,并进行测序;利用MEGA4.0软件中Bootstrap Test of phylogeny→Neighbor-joining方法对13株CoxA16基于VP1基因全序列构建CoxA 16种系进化树并进行基因分型,使用DNAMAN软件对4个毒株VP1核苷酸序列的同源性及其蛋白质氨基酸序列差异位点进行分析.分别用纯化灭活后的4株CoxA16免疫BALB/c小鼠,于初次免疫和二次免疫后的第14、28天采血,分离血清,Westem blot法检测G20毒株免疫的小鼠血清中抗体的的特异性;微量中和试验法检测血清中和抗体效价并进行交叉中和试验.结果 G20、MY08和KM208毒株属于B2b基因型,而KM/M08毒株属于B2a基因型;4个毒株间VP1基因核苷酸序列的同源性为91.8％～99.0％;MY08与其他3个毒株相比,在VP1的第102位(N→D)、241位(E→K)和248位(T→A)上存在3个差异氨基酸位点.G20毒株的抗血清可特异识别CoxA16的VP1和VP2蛋白,具有良好的免疫原性;各实验组二次免疫后第28天中和抗体效价均高于其他检测时期,其中MY08组中和抗体效价明显低于其他3组,差异有统计学意义(P＜0.01);G20、KM/M08、和KM208毒株间的交叉保护能力优于MY08毒株对G20、KM/M08和KM208毒株的交叉保护能力,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 4株CoxA 16灭活后均能诱导机体产生相应的中和抗体和交叉保护能力,其中G20、KM/M08和KM208毒株在灭活后,显示了更好的免疫原性和毒株间交叉保护能力.
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卡介苗生产用菌株的遗传稳定性研究
目的 观察我国生产用卡介苗上海D2PB302菌株(以下简称卡介苗上海D2株)的遗传稳定性.方法 提取卡介苗上海D2株工作种子批4、7、10、13、15代单批培养物基因组DNA,以其为模板,PCR扩增16S核糖体RNA(16Sribosomal RNA,16S rRNA)基因,并进行测序鉴定;对卡介苗上海D2株缺失区RD1、RD2、RD8、RD14、RD16及双组分系统操纵子SenX3-RegX3串联重复序列进行多重PCR检测;对卡介苗上海D2株缺失区RD1及Esat6基因进行多重PCR检测;并对基因座SenX3-RegX3进行序列分析.结果 卡介苗上海D2株工作种子批4、7、10、13、15代单批培养物的16S rRNA序列均未发生变异,与GenBank中登录的Pasteur 1173P2株序列(AM408590.1)相似性为100％;卡介苗上海D2株工作种子批各代次特征性凝胶电泳图谱显示条带位置均相同,其基因座SenX3-RegX3有3个串联重复序列,每个串联重复序列均以ATG起始,TG结尾,且前后重叠连接在一起;卡介苗上海D2株工作种子批各代次中均缺少编码毒力的Esat6基因.结论 卡介苗上海D2株与国际常用卡介菌亚株相比具有其特征性的遗传学特性,在传代15代次以内,分子遗传学特性稳定.在《中国药典》三部(2010版)规定的12代次内制备疫苗,卡介苗遗传特性一致.
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丹皮酚对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响及其可能的机制
目的 探讨丹皮酚对人卵巢癌SKOV3细胞的促凋亡作用及其可能的机制.方法 用25、50、100、200、400 μg/ml丹皮酚处理SKOV3细胞,设未经丹皮酚处理的细胞为对照组,24 h后,采用MTF法检测细胞增殖情况;用50、100、200μg/ml丹皮酚处理SKOV3细胞,设未经丹皮酚处理的细胞为对照组,24 h后,采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)、Hoechst染色法检测细胞凋亡情况,Western blot法检测caspase3及survivin蛋白的表达情况.结果 与对照组相比,各浓度丹皮酚对SKOV3细胞的增殖均有明显的抑制作用,呈浓度依赖性(P＜0.05),IC50值为200.06 μg/ml; 100、200 μg/ml浓度组中SKOV3细胞凋亡率分别为(35.33±1.32)％、(39.56±1.27)％,与对照组[(9.01±1.21)％]相比明显增加(P＜0.05);丹皮酚100、200 μg/ml浓度组中发生凋亡的细胞数量较对照组多;丹皮酚处理后细胞凋亡相关蛋白survivin表达降低,而caspase3表达增加,高浓度组与低浓度组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 丹皮酚能显著抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能与其调控凋亡相关蛋白survivin、caspase3表达变化有关.
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苦参碱对人急性红白血病细胞株TF-1 SALL4基因及Wnt/ β-catenin信号通路下游靶基因表达的影响
目的 探讨苦参碱对人急性红白血病细胞株TF-1 SALL4基因及Wnt/p-catenin信号通路下游靶基因表达的影响.方法 用不同浓度的苦参碱(0.5、1.0、2.0 g/L)处理TF-1细胞,另设对照组(不加苦参碱).苦参碱作用48 h后,采用实时荧光定量PCR法检测各组TF-1细胞中SALL4基因及Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因β-catenin、C-myc、Cyclin DI的表达水平,并分析SALL4基因与β-catenin、C-myc及Cyclin DI表达的相关性;Western blot法检测各组TF-1细胞中SALL4蛋白的表达水平.结果 经不同浓度苦参碱处理48 h后,TF-1细胞中SALL4、β-catenin、C-myc、Cyclin DI基因的表达水平及SALL4蛋白的表达水平与对照组相比,均明显下降,且呈浓度依赖性(P＜0.05);SALL4基因与p-catenin、C-myc、Cyclin DI基因的表达明显相关(rs值分别为0.912、0.818和0.832,P均＜0.o1).结论 苦参碱对TF-1细胞中SALL4基因和蛋白表达及Wnt/p-catenin信号通路下游靶基因β-catenin、C-myc、Cyclin DI的抑制可能在抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡过程中起重要作用.
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潍坊市疑似预防接种异常反应监测分析
目的 分析山东省潍坊市2011 ～ 2012年疑似预防接种异常反应(adverse events following immunization,AEFI)的发生特征,评价AEFI监测系统运转情况及预防接种安全性.方法 通过AEFI监测系统,收集全市2011年1月1日至2012年12月31日报告的AEFI个案数据,采用描述性流行病学方法和卡方检验进行数据分析.结果 2011 ～2012年全市AEFI监测系统共报告AEFI 1 836例,报告发生率为39.75/10万,2012年报告发生率(42.79/10万)高于2011年(36.57/10万),差异有统计学意义(P＜0.01).在1 836例AEFI中,男女性别比为1.34:1;≤1岁占79.63％;病例报告主要集中在8～11月份,占52.67％;报告疫苗以国家免疫规划疫苗(National Immunization Pro-gram,NIP)为主;一般反应占97.50％,报告发生率为38.76/10万,以单纯发热、局部红肿伴有硬结和单纯局部红肿为主,异常反应占2.07％,报告发生率为0.83/10万,以过敏性反应和卡介苗淋巴结炎为主,偶合症占0.33％,报告发生率为0.13/10万,心因性反应和待定分别1例,占0.05％,报告发生率为0.02/10万,大多数病例已痊愈.估算全市NIP不良反应报告发生率为6.45 ～ 109.30/10万.2011 ～ 2012年全市12个县市区均有AEFI个案报告,报告县覆盖率、48 h及时报告率和48 h及时调查率均达到100％.结论 全市AEFI系统的监测灵敏性尚需继续提高,AEFI多发生在低年龄儿童和夏秋季节,疫苗以NIP为主,应重点监测;NIP不良反应报告发生率均在预期发生范围内,安全性良好.
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国产无佐剂Vero细胞狂犬病疫苗接种后的不良反应及免疫持久性观察
目的 观察国产无佐剂Vero细胞狂犬病疫苗全程接种后的不良反应和免疫持久性,为完善再次暴露后疫苗的免疫程序提供依据.方法 将医院犬伤门诊暴露后前来进行狂犬病疫苗接种者分为A、B两组:A组为Ⅱ级咬伤者,全程仅接种国产无佐剂Vero细胞狂犬病疫苗;B组为Ⅲ级咬伤者,接种国产无佐剂Vero细胞狂犬病疫苗加人狂犬病免疫球蛋白.电话调查并记录观察对象接种每剂无佐剂Vero细胞狂犬病疫苗及人狂犬病免疫球蛋白后7d内的不良反应以及随访期间严重不良反应情况;接种前、接种后6周、6月、1年、2年、3年分别采集血清,采用快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)检测狂犬病病毒中和抗体,分析中和抗体≥0.5 IU/ml的有效保护水平以及抗体几何平均滴度(GMT).结果 疫苗接种后7d内和随访期间未发生严重不良反应.疫苗接种后6周、6月、1年、2年、3年有效保护中和抗体(≥0.5 IU/ml)阳性率分别为97.5％、100％、73.9％、21.1％、20％;中和抗体GMT分别为4.584 6、2.226 9、1.1466、0.506 3、0.408 5,中和抗体水平随着时间的延长呈显著下降趋势(P＜0.01);加强免疫后中和抗体水平显著升高,并持续较长时间.结论 国产无佐剂Vero细胞狂犬病疫苗的安全性和耐受性良好,接种后2年抗体水平降至与接种后3年相近的低水平,建议2年后再次暴露者全程接种5剂狂犬病疫苗.
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卵巢癌相关抗原CA125单克隆抗体的制备
目的 制备卵巢癌相关抗原CA125R单克隆抗体,并进行鉴定.方法 将CA125一段串联重复序列(CA125R)基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-l,构建重组表达质粒pGEX-CA125R,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-CA125R融合蛋白.表达的融合蛋白经GST亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备CA125单克隆抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性,单克隆抗体亚类测定试剂盒分析单抗的亚类.腹水诱生法大量制备单抗,SDS-PAGE分析单抗的纯度,间接ELISA法检测单抗的效价.结果 重组原核表达质粒pGEX-CA125R经双酶切及测序,证实构建正确;纯化的GST-CA 125R融合蛋白相对分子质量约44 000,纯度约为95％,可与小鼠抗GST单克隆抗体发生特异性反应;获得1株可稳定分泌抗CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞株3-B2,其分泌的单抗能特异识别GST-CA125R融合蛋白和天然CA125糖蛋白,其抗体亚型为IgG2a型;纯化的腹水单抗纯度约为90％,效价达1×106以上.结论 成功获得1株能特异性识别天然CA125糖蛋白的单克隆抗体细胞株,并经腹水诱生法大量制备了抗体,为CA125临床检测试剂盒的研发奠定了基础.
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鸡传染性支气管炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)M蛋白单克隆抗体,并进行鉴定.方法 利用IBV Sczy3株免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选杂交瘤细胞,强阳性孔经有限稀释法亚克隆,制备抗IBV M蛋白单克隆抗体.对制备的单抗进行单抗亚型、腹水ELISA效价、特异性、交叉反应性鉴定及Western blot分析.结果 获得2株能稳定分泌抗IBV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2C10和7H6,单抗亚型分别为IgM和IgG1;腹水ELISA效价分别为1∶25 600和1∶12 800;2株单抗均只与IBV发生特异性反应,而与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型、AIV H5抗原和鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)均不反应;2株单抗与5种基因型的其他10株IBV均有良好的反应性.结论 制备出2株针对IBV M蛋白的单抗,为今后更深入地研究该蛋白的分子生物学功能、抗原表位的鉴定及抗原捕获ELISA方法的建立等提供了有力的工具.
| 年 | 期数 |
| 2019 | 01 02 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 |
| 2000 | 01 02 03 04 |
