人睫状神经营养因子基因克隆、表达、纯化及其生物活性

目的克隆人睫状神经营养因子(hCNTF)基因,在大肠杆菌宿主系统中高效表达并纯化,获得具有生物活性的hCNTF蛋白.方法以人染色体DNA为模板,经PCR扩增到编码CNTF成熟蛋白的cDNA序列,并克隆进原核表达载体pBV220,在大肠杆菌BL21(Gold)中进行表达,产物经CM-Sepharose FF柱纯化后,以体外培养的鸡胚背根神经节(DRG)测定生物活性.结果重组表达质粒pBV220-CNTF在大肠杆菌BL21(Gold)中获得了非融合的稳定、高效表达,目的蛋白占细胞总蛋白的45%左右,以可溶性和包涵体两种形式存在,表达上清及包涵体复性后经CM柱一步纯化纯度达90%以上;表达的重组hCNTF能促进培养的鸡胚背根神经节神经突起的生长.结论基因工程rhCNTF的获得为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定基础.

抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)在CHO细胞表达

目的开展基因重组AT-Ⅲ的研究,试将人AT-ⅢcDNA在CHO细胞中进行表达.方法将携带AT-Ⅲ基因的表达载体转染CHO细胞,用G418筛选抗性克隆,SDS-PAGE与Western Blot检测其表达产物;并采用生化法测定AT-Ⅲ的表达量,采用凝血酶空斑法测定表达产物的活性.结果 Western Blot分析发现转移至膜上的表达产物能与抗AT-Ⅲ单克隆抗体结合,分子量与人血浆中AT-Ⅲ一致,证明在CHO细胞中成功地表达了AT-Ⅲ,并具有天然AT-Ⅲ的生物活性.结论获得了表达AT-Ⅲ CHO细胞株.

肾综合征出血热疫苗Z37病毒株全基因组序列分析

目的测定Z37株的全基因组序列,了解我国肾综合征出血热疫苗株分子基础,分析其遗传学差异,为疫苗生产提供分子依据.方法设计出针对各片段的特异性引物,用PCR方法从Z37病毒感染的细胞提取总RNA,逆转录扩增产物克隆T载体纯化后测序,应用DNASTAR软件比较分析.结果 Z37株全基因组由L片段6530个,M3651个和S1754个核苷酸组成,分别编码2151、1133和429个氨基酸,与同型病毒间同源率高达95.2%～99.5%,绘出了3个片段的核苷酸和氨基酸的系统发生树.结论为研究疫苗毒株的生物学特性和致病机理等提供了分子基础.

流感病毒的裂解、纯化及抗原性研究

目的研究适于大规模生产的流感病毒裂解剂、裂解和纯化方法.方法使用不同表面活性剂(Triton X100和去氧胆酸钠)、不同浓度和时间进行裂解,通过电镜进行裂解效果观察.裂解后经密度梯度离心纯化,并进行抗原性试验.结果 Triton X100的裂解效果优于去氧胆酸钠,应用1.0% Triton X100裂解90min效果较好.裂解率达90%以上.裂解后纯化的样品抗原性与进口疫苗类似.结论该工艺适于流感裂解疫苗大规模生产.

重组生长抑素(SS)大肠杆菌疫苗促进动物生长的效果

目的验证重组SS大肠杆菌疫苗促进动物生长的效果.方法由SS融合蛋白与弗氏不完全佐剂制成实验用疫苗,皮下注射BALB/c小鼠、去势仔公猪、妊娠初产母猪和羔羊等动物,并观察体重变化.结果与Vector Vaccine相比,Vaccine-1和Vaccine-2可分别使雌性小鼠提高增重10.28%和15.63%;对雄性小鼠的作用不明显.用SS融合蛋白疫苗免疫去势仔公猪,免疫后89天提高增重7.2%;免疫初产母猪,所产28日龄仔猪可比载体对照组仔猪提高增重11.81%,比44日龄仔猪提高增重17.95%;免疫母羔羊58天可比载体对照组提高增重15.64%,90天提高增重28.2%;免疫公羔羊变化不明显.用SS融合蛋白疫苗免疫小鼠,其血清中抗SS抗体阳性率为75%.结论重组SS大肠杆菌疫苗能促进雌性小鼠、去势仔公猪、妊娠初产母猪所产仔猪和母羔羊增重,但对雄性小鼠和公羔羊无作用.

应用气相色谱法监测血液制品中乙醇残留量

目的为建立监测血液制品超滤脱醇工艺中乙醇残留量的准确方法.方法以正丁醇作内标,用峰高代替峰面积,采用HP INNOWax毛细管色谱柱,程序升温方法,准确定量膜下水样品中乙醇残存量.结果色谱法优于扩散法,能准确定量,快速灵敏,仅需5分钟.结论可用于实际检测分析.

b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的研制

目的研制b型流感嗜血杆菌(Hib)结合疫苗并考察其稳定性.方法用溴化氰活化提纯Hib荚膜多糖抗原,通过己二酰肼(ADH)与破伤风类毒素(TT)蛋白共价结合,制备b型流感嗜血杆菌结合物,并考察放置在2～8℃及室温9个月和37℃ 3个月后的稳定性.结果用本工艺提取的多糖,合成的多糖衍生物,多糖蛋白结合物的化学组成及结构特性均达到了国外同类产品的质控要求.结合物在2～8℃及室温放置9个月后基本无降解.结论为临床评价Hib结合疫苗的安全性和保护效果及确定效期提供了实验基础.

重组人表皮生长因子生物活性国家标准品的研制

目的建立测定重组人表皮生长因子(rhEGF)活性用国家标准品.方法按WHO有关要求,制备并检测标准品,以EGF国际标准品为标准进行协作标定.结果冻干EGF标准品经外观、无菌、水分检测均符合规定,在-20、4、25和37℃保持33个月生物活性稳定,协作标定几何平均效价为6823IU/支.实验均数的95%可信区间为5958～7812IU/支,单次实验的95%参考值范围为2241～12056IU/支,平均可信限率为14.64%.结论该批EGF标准品可作为国家标准品,效价定为6800IU/支,批号为97/01.

昆明小白鼠自发性肺肿瘤的组织学类型及其发生率

目的了解昆明小白鼠自发性肺肿瘤的发生率、大体形态、组织学类型及生物学特性.方法共解剖本所繁殖的封闭群小鼠1000只,从各肺叶、气管、肺门淋巴结、心、肝、脾和脑等部位取材固定,常规病理切片,并进行组织病理学检查.结果剖检发现,肺部有肿物的56只,确诊为肺肿瘤的35只,其余21只为非肿瘤性病变或转移瘤.自发性原发性肺肿瘤的发生率为3.5%.肿瘤的大体形态多数为圆球形结节状,少数为卵圆形、蕈形、扁圆形、巨块形或略方形.32只为肺腺癌,3只为良性乳头状腺瘤.在32只患肺腺癌小鼠中,乳头状腺癌占多数,腺泡型腺癌及混合癌居中,粘液乳头状腺癌少.在肺肿瘤小鼠中,雄性20只,雌性15只,性别比为4:3.10～14月龄和生育8～12胎次的小鼠肿瘤发生率明显上升.结论小鼠自发性肺肿瘤发生率无明显性别差异,随鼠龄增加而上升.小鼠生育胎次不宜超过7胎.适

冻干甲型肝炎减毒活疫苗的研制

目的研制冻干甲肝减毒活疫苗,提高疫苗的稳定性,便于保存及运输,保证疫苗的接种效果.方法采用CA-9冻干保护剂,制备冻干疫苗,疫苗液与保护剂之比为3.5∶1.结果冻干甲肝减毒活疫苗具有与液体疫苗相同的安全性及免疫原性.在2～8℃保存的有效期较液体疫苗的3～5个月提高到18个月.在室温和37℃保存的稳定性也明显提高.结论冻干甲肝疫苗的稳定性良好,无需低温保存、冷链运输,便于甲肝疫苗的大规模推广应用.

流行性感冒纯化疫苗的研究

目的研制安全有效的流感疫苗.方法将A1、A3和B三株流感病毒分别接种鸡胚,取尿囊液,灭活后,经超滤浓缩再经Sepharose-4FF层析纯化,除菌过滤后制成疫苗.结果该疫苗的主要技术指标:血凝素含量、卵清蛋白含量、总蛋白含量及细菌内毒素均符合WHO规程要求标准[1],人体接种后无副作用,抗体阳转率三株均达99%以上.结论以该纯化工艺制备的流感疫苗安全有效.

大肠杆菌肉碱脱水酶基因的克隆、测序及高效表达

目的克隆并表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因.方法用聚合酶链反应(PCR)从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB,测定其DNA序列,将caiB基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET-28a(+)中,构建表达质粒pETCaiB,转化大肠杆菌BL21(DE3),用1mmol/L异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达.结果克隆得到的肉碱脱水酶编码基因caiB长度为1221bp,与文献报道值相比,DNA序列有26个不同,氨基酸序列只有一个不同,即302位的丙氨酸变为苏氨酸.重组菌经IPTG诱导,可高效表达,SDS-PAGE分析表达蛋白相对分子质量约43000,表达产物含量占菌体总蛋白45%以上.结论得到了高效表达肉碱脱水酶的重组菌,为制备L-肉碱创造了条件.

口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因的克隆及序列分析

目的对口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因进行PCR扩增、克隆和序列分析,了解FMDV基因型与血清型的相关性及分子免疫机理,便于疫苗株的选择.方法应用RT-PCR方法扩增了CC-1毒株的衣壳蛋白前体P1基因和蛋白酶3C基因,并将其克隆到pGEM-T easy载体上,分别构建含有P1基因和3C基因的两个重组质粒pGEMP1和pGEM3C,并进行核苷酸序列分析.结果 CC-1株与相同血清型毒株P1基因核苷酸序列和氨基酸序列存在较高的同源性,与不同血清型毒株P1基因氨基酸序列的同源性差异显著,而不同血清型毒株的蛋白酶3C基因氨基酸序列的同源性均在90%以上.结论成功地克隆了FMDV P1区基因和蛋白酶3C基因,为选择口蹄疫病毒疫苗株提供了背景材料.

人67KDa层连蛋白受体前体蛋白的基因克隆、表达及其免疫原性

目的克隆、表达人67KDa层连蛋白受体前体蛋白(67KDa laminin receptor precursor,LRP)并检测其免疫原性.方法应用RT-PCR从胃癌细胞SGC7901中扩增编码LRP的cDNA,将其按照T-A克隆法重组入pUCm-T载体并进行DNA序列测定.采用DNA重组技术构建原核表达载体pQE30-LRP;用M15/pQE系统表达6×组氨酸与LRP的融合蛋白,并以SDS-PAGE和Western blot鉴定所获融合蛋白.用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫小鼠,以Western blot检测小鼠血清的抗体活性.结果 DNA测序结果证实所扩增的cDNA片段与LRP的基因序列完全相符.SDS-PAGE检测显示,经IPTG诱导2h后,M15/pQE30-LRP总蛋白中出现一条34KDa的新生蛋白带,Western blot进一步证实该新生蛋白为融合蛋白.其免疫小鼠血清经Western blot检测仅识别SGC7901细胞中一条大小约为42KDa的蛋白带;其血清即使被稀释2000倍,仍然显示与靶蛋白有较强的结合活性.结论成功地克隆、表达了人LRP,并具有良好的免疫原性.

江浙蝮蛇毒出血毒、致死毒及抗毒素标准品的建立

目的以日本标准品标化我所制备的江浙蝮蛇毒标准品出血毒、致死毒及抗毒素的单位及效价.方法经动物试验,通过统计学方法统计计算各项结果.结果我所制备的标准品出血毒为180TD/AMP,致死毒为450TD/AMP,抗出血毒效价为6250IU/AMP,抗致死毒效价为3600U/AMP.结论所制备的标准品可用于江浙蝮蛇毒出血毒、致死毒及抗毒素效价的检测.

抑癌基因CT-GalNAcT转染对结肠癌细胞COLO26的影响

目的了解抑癌基因CT-GalNAcT(N-acetylgalactosamine Transferase)对小鼠结肠癌细胞COLO26的作用.方法将抑癌基因CT-GalNAcT序列构建到带有报道基因FLAG的质粒上,重组质粒pFLAG-CT-GalNAcTDNA在阳离子脂质体Effectene介导下转染,并分别与绿色荧光蛋白基因质粒pcDNA3EGFP和潮霉素抗性基因质粒pCEP4转染结肠癌细胞COLO26,观察瘤细胞的生长状况.裂解细胞提取蛋白进行Western blotting.结果瘤细胞变圆,粘附性下降,细胞生长受到抑制,死亡细胞增多.与pcDNA3EGFP、pCEP4共转染及Western blotting确定CT-GalNAcT已经转染到COLO26细胞内.结论抑癌基因CT-GalNAcT对结肠癌细胞具有生长抑制作用.

HIV-1 Gag蛋白酵母工程菌表达条件的优化

为了探索构建的表达HIV-1核心蛋白Gag酵母工程菌GS115/pPICGAG的佳表达条件,我们将该酵母工程菌分别在不同条件下进行诱导表达,通过ELISA检测培养上清中目的蛋白的表达量来分析佳表达条件,并分析了浓缩上清时适硫酸铵饱和度.

重组酵母乙型肝炎疫苗质量分析

我单位从美国默沙东制药公司引进重组酵母乙型肝炎疫苗工业化大规模生产技术和生产线,按<重组(酵母)乙型肝炎疫苗制造与检定规程>已生产140多批约1.5亿支、5μg HBsAg/支规格的重组酵母乙型肝炎疫苗.为确立该工艺所生产疫苗批内的均质性和批间的一致性,对各批疫苗各项质量指标的批间差异进行了分析.

生物芯片质量控制要点

近年来,国内外芯片技术得到了很快的发展,但其要成为实验室研究或临床可以普遍采用的技术,特别是想进入临床检验诊断市场,仍有一些关键问题亟待解决,如非特异性反应;样品制备方法的复杂性和标记效率不高;检测的灵敏度过多地受限于监测仪器等,这些问题如果不能得到较好的解决,必将限制生物芯片的发展.特别是统一的行业标准、国家质量标准建立,将对生物芯片的产业化进程产生较大的影响.本文将就生物芯片质量控制和标准建立提出自己的看法.

“2002年环境与职业医学学术研讨会”征文通知