中国生物制品学杂志
Chinese Journal of Biologicals 중국생물제품학잡지
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
- 影响因子： 0.41
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1004-5503
- 国内刊号： 22-1197/Q
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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肺炎链球菌热休克蛋白ClpE多克隆抗体的制备及其亚细胞定位
目的 制备肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)热休克蛋白(heat shock protein,HSP)ClpE多克隆抗体,并确定ClpE在S.pn表面的亚细胞定位.方法 应用PCR法从S.pn D39中扩增coE基因全长片段,克降入原核表达载体pET28a,转化E coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经亲和层析纯化重组蛋白.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价,Western blot法鉴定抗体的特异性.ELISA法分析ClpE在S.pn表面的亚细胞定位.结果 重组表达质粒经PCR、双酶切和测序证实构建正确;表达的重组ClpE蛋白相对分子质量约83 000,表达量约占全菌总蛋白的60％,主要以可溶性上清形式存在;纯化的重组蛋白纯度达90％;制备的ClpE多克隆抗体效价达1∶4 096 000,可与S.pn D39全菌发生特异性反应,S.pn D39在正常生长时可表达ClpE蛋白;ClpE在S.pn表面有表达.结论 成功制备了高效价和特异性的ClpE多克隆抗体,ClpE在S.pn表面可正常表达,为表面蛋白.
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染料木黄酮对光老化成纤维细胞增殖作用的影响
目的 探讨染料木黄酮对光老化成纤维细胞增殖作用的影响.方法 经酶消化法分离培养真皮成纤维细胞,并进行细胞传代,免疫细胞化学鉴定细胞.实验分为3组:正常细胞对照组:未经处理的真皮成纤维细胞;8-甲氧补骨脂素(8-methoxypsoralan,8-MOP)/长波紫外线(ultraviolet A,UVA)对照组:用含50 ng/ ml 8-MOP的培养基避光孵育细胞24h,再以9J/cm2 UVA照射;8-MOP/UVA+染料木黄酮(0、1.25、2.5、5、10、20 μg/ml)组:用含50 ng/ ml8-MOP及各浓度染料木黄酮的培养基共同孵育细胞24 h,再以9 J/cm2 UVA照射24h.MTr法检测各组细胞增殖活力,流式细胞术检测各组细胞细胞周期,光镜下观察各组细胞分裂和分裂后表型,实时荧光定量PCR法检测各组细胞中基质金属蛋白酶-1、3水平.结果 皮肤成纤维细胞阳性率达99％以上;8-MOP/UVA+染料木黄酮1.25、2.5 μg/ml组细胞增殖率分别为8-MOP/UVA对照组的112.6％(P＞0.05)和146.6％(P＜0.05),染料木黄酮的光保护作用随浓度的升高而增强,然而随着浓度的继续升高,细胞增值率逐渐降低,当浓度达20 μg/ml时,细胞增殖率仅为8-MOP/UVA对照组的19.4％(P＜0.01),选择染料木黄酮的佳保护浓度为2.5μg/ml;8-MOP/UVA对照组细胞细胞周期阻滞于S期,而8-MOP/UVA+染料木黄酮2.5 μg/ml组细胞细胞周期则由S期进入G2/M期;正常细胞对照组、8-MOP/UVA组及8-MOP/UVA+染料木黄酮2.5μg/ml组分裂细胞表型占总细胞数目的比率分别为(99.7±0.58)％、(7.7±1.15)％、(57.7±3.51)％,各组间差异有统计学意义(P＜0.01);8-MOP/UVA+染料木黄酮2.5 μg/ml组细胞基质金属蛋白酶-1、3水平均明显低于8-MOP/UVA对照组,而高于正常细胞对照组,各组间差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 染料木黄酮可在一定程度上解除8-MOP/UVA所致光老化成纤维细胞的生长抑制作用.
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实验性自身免疫性脑脊髓炎发病过程中淋巴细胞相关因子及转录因子的表达
目的 探讨实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)发病过程中淋巴细胞相关因子及转录因子的表达情况.方法 将C56BL/6小鼠分为免疫髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55 (myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55,MOG35-55)特异性免疫乳剂的EAE组与免疫未加MOG35-55多肽的免疫乳剂的CFA组,每组16只,分别取100μl免疫乳剂,经腋窝皮下免疫小鼠,于免疫当天及第2天经小鼠尾静脉注射200 ng百日咳毒素(pertussis toxin,PT),建立实验动物模型,并于免疫后进行临床评分;分别于免疫后第7、14和21天取小鼠的淋巴结和脾脏,RT-PCR法检测淋巴细胞相关因子及转录因子IL-17、IFNγ、RAR相关孤核受体γ(RAR-relatedorphan receptor gamma,RORγ)和T盒子转录因子bet(T-box transcription factor bet,T-bet)基因mRNA转录水平的变化.结果 成功建立EAE模型,从免疫后第7天起出现临床症状,EAE组临床评分明显高于CFA组(P均＜0.05);免疫后第7、14和21天,EAE组淋巴结和脾脏淋巴细胞中IL-17、IFNγ、RORγ、T-bet基因mRNA转录水平均明显高于CFA组.结论 IL-17、IFNγ、RORγ和T-bet参与EAE疾病的发生发展,且表达量的增加与疾病加重有相关性.
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β-catenin对骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化的影响
目的 探讨经典Wnt信号通路关键节点β-catenin对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化的影响.方法 用重组腺病毒介导BMP9在C3H10T1/2细胞中过表达,联用β-catenin重组腺病毒上调β-catenin的表达,并通过RNA干扰抑制β-catenin的表达.分析C3H10T1/2细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的变化;RT-PCR检测细胞成骨分化相关基因骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨钙蛋白(osteocalcin,OC)基因mRNA的转录水平;茜素红S染色检测细胞的钙盐沉积.结果 BMP9单独作用能诱导C3H10T1/2细胞向成骨方向分化,并增强细胞ALP活性;单独的β-catenin无成骨诱导作用,但可剂量依赖性地增强BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性,并促进BMP9诱导的细胞OPN和OC基因mRNA的转录水平及钙盐沉积;抑制β-catenin表达可显著降低BMP9诱导的C3H1OT1/2细胞的ALP活性(P＜0.05),下调OPN和OC基因mRNA的转录水平,并抑制钙盐沉积.结论 经典Wnt信号通路可能通过β-catenin协 同BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化,且BMP9诱导的成骨分化可能需要通过Wnt/ β-catenin途径来实现.
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犬攻毒用狂犬病街毒株BD06的特性
目的 对狂犬病街毒株BD06进行了毒株特异性分析,并评价其对犬的攻毒效果.方法 将BD06株病毒于比格犬脑内传至第10代,参照《中国兽药典》三部(2010版)进行外源病毒(犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、Ⅰ型和Ⅱ型腺病毒)、支原体检测和无菌检验;提取传至第10代的犬脑组织总RNA,进行RT-PCR扩增反应,并进行全基因序列测序;经小鼠脑内传代后,测定小鼠的半数致死量(MICLD50);用2×104、5×104和10×104 MICLD50/ml的鼠脑悬液,分别采用后肢肌注法和咬肌注射法进行犬攻毒试验.结果 BD06株病毒在犬脑中传至第10代,无外源病毒、支原体和细菌污染,基因序列未发生变化;经鼠脑传代1次后,MICLD50达105.32/ml;经咬肌注射5×104 MICLD50/ml的BD06株病毒悬液可获得佳犬攻毒效果.结论 BD06株病毒传代简单,对犬致病性强,可作为我国犬攻毒用狂犬病病毒的候选株.
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单-ADP-核糖基转移酶3过表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、凋亡及侵袭的影响
目的 探讨单-ADP-核糖基转移酶3(mono-ADP-ribosyltransferase 3,ART3)过表达对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及侵袭的影响.方法 在Lipofectamine 2000的介导下,将ART3基因重组真核表达质粒pCMV-ART3-myc-tag转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231,用G418进行稳定转染细胞株的筛选,同时设未转染组对照.Western blot法检测稳定转染细胞中ART3-myc-tag蛋白的表达,MTT法、流式细胞术和TransweU试验分别检测ART3对MDA-MB-231细胞增殖活力、凋亡及侵袭能力的影响.结果 ART3可在MDA-MB-231细胞中稳定过表达;ART3转染组细胞的增殖活力和侵袭能力均明显高于未转染组(P＜0.05);ART3转染组细胞的凋亡率明显低于未转染组(P＜0.05).结论 过表达ART3能促进乳腺癌细胞增殖、侵袭,并抑制其凋亡,本实验为进一步研究ART3基因在乳腺癌发生发展中的作用及其机制奠定了基础.
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骨形态发生蛋白9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞溶骨性骨转移的抑制作用
目的 探讨骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞溶骨性骨转移的抑制作用及其可能的机制.方法 将人乳腺癌MDA-MB-231细胞分为试验组(感染BMP9腺病毒)、空白对照组(未感染)及GFP对照组(感染GFP腺病毒),RT-PCR法检测各组细胞中骨保护素(osteoprotegerin,OPG)基因mRNA的转录水平,Western blot法分别检测各组细胞中BMP9及OPG蛋白的表达水平.将BALB/c裸鼠分为空白对照组(注射空白对照细胞)、GFP对照组(注射GFP对照组细胞)及试验组(注射试验组细胞),每组5只,均经胫骨贴骨注射,1×106个/(0.3μl·只),X片成像技术分析各组裸鼠溶骨区域变化,免疫组化法检测各组裸鼠瘤体组织中OPG蛋白的表达.结果 试验组MDA-MB-231细胞中OPG基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均明显高于空白对照组和GFP对照组(P＜ 0.05),仅试验组细胞中有BMP9的表达.试验组裸鼠胫骨瘤体直径及溶骨区域均明显小于GFP对照组和空白对照组(P＜0.05),试验组裸鼠瘤体组织中OPG的表达量明显高于GFP对照组(P＜0.05).结论 BMP9可抑制MDA-MB-231细胞溶骨性骨转移,可能是通过上调OPG/RANKL/RANK系统中OPG的表达而发挥作用.本实验为探讨BMP9在肿瘤骨转移微环境中的作用机制奠定了基础.
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糖苷水解酶第10家族真菌木聚糖酶保守区及进化关系的分析
目的 对糖苷水解酶第10家族(glucoside hydrolase family 10,GHF10)真菌木聚糖酶保守区及进化关系进行分析.方法 应用CLUSTALW2软件对41条GHF10真菌木聚糖酶氨基酸序列进行多序列比对分析,获得完全保守的氨基酸位点;应用Block Maker和Consensus软件对CLUSTALW2比对结果进一步分析,确定第10家族真菌木聚糖酶共有的保守区及保守氨基酸位点;应用Pymol软件对源于GenBank中登录的6种10家族木聚糖酶进行比对,并找到这41条序列中共有的β折叠和α螺旋;利用MEGA 4.0软件对CLUSTALW2比对结果构建系统进化树,并根据进化树进行分组.结果 41条序列长度虽然不等,但均包含E270和E405两个谷氨酸催化位点.通过序列比对,得到第10家族真菌木聚糖酶的5个高度保守区TPENSMK、RGHTLVWHSQLPSWV、WDVVEN、AKLYINDYYNL、TELDI以及20个完全保守的氨基酸位点,这些保守区和保守位点多数分布在木聚糖催化区域以及(β/α)8折叠桶的内壁上.根据木聚糖酶的亲缘关系,可将第10家族真菌木聚糖酶分为3个大组,其中第1和第3组的木聚糖酶分别有12和27种,且均来源于子囊菌门;第2组仅包含2种木聚糖酶序列,来源于Neocallimastigomycota和担子菌门.结论 分析了GHF10真菌木聚糖酶的保守区及进化关系,为木聚糖酶的工程改造奠定了基础.
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乳腺癌Ⅳ期患者血清黏蛋白1抗体的中和作用
目的 探讨乳腺癌Ⅳ期患者血清黏蛋白1 (mucin 1,MUC1)抗体与MUC1抗原的结合反应,阐明MUC1抗体在乳腺癌Ⅳ期的中和作用.方法 分别采用斑点杂交及抑制试验、血清中和试验检测MUC1蛋白与乳腺癌Ⅳ期患者血清的特异性结合反应.结果 乳腺癌Ⅳ期患者血清MUC1抗体与MUC1蛋白的反应可被MUC1数目可变串联重复序列(variable number of tandem repeats,VNTR)核心肽鼠抗人单克隆抗体阻断,而不能被乙型肝炎表面抗原鼠抗人单克隆抗体阻断;经M UC1蛋白中和后,乳腺癌Ⅳ期患者血清中MUC1抗体水平降低.结论 乳腺癌Ⅳ期患者血清MUC1抗体可中和MUC1抗原,可能具有抗肿瘤作用.
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人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体单链可变区片段噬菌体文库的初建
目的 构建人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体单链可变区片段(scFv)噬菌体文库.方法 采用Trizol试剂提取尖吻蝮蛇咬伤后恢复期患者的外周血淋巴细胞的总RNA,用Oligotex@mRNA Mini Kits纯化获得总mRNA,逆转录合成总cDNA,针对人抗体轻链和重链可变区基因设计一系列特异性引物,以合成的总cDNA为模板,扩增得到抗体轻链和重链可变区基因库,再通过重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)将轻链和重链拼接得到scFv文库;将scFv基因双酶切后,插入T7噬菌体骨架进行包装,以尖吻蝮蛇蛇毒蛋白抗原进行4轮淘选,建立蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库,采用噬斑法检测scFv噬菌体文库滴度并进行PCR及测序鉴定.结果 成功地将轻链和重链可变区基因库混合拼接得到scFv文库;经4轮淘选,蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库滴度为6.0×1014PFU/ml,抗体基因在噬菌体中表达的阳性率达50％以上,表达的scFv片段均为轻链和重链的杂合体,可较好的重现可变区的多样性.结论 已成功构建了人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库,为下一步噬菌体文库的克隆构建和筛选奠定了基础.
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基于结构的HIV-1整合酶抑制剂的虚拟筛选
目的 虚拟筛选基于结构的HIV-1整合酶抑制剂.方法 从PDB (Protein Data Bank)下载HIV-1整合酶催化核心结构域与LEDGF/p75整合酶结合结构域(integrase binding domain,IBD)的晶体结构(PDB ID:2B4J),通过AutoDockTools对结构进行处理;从ZINC数据库下载化合物结构,用PyRx处理和转换成pdbqt格式,建立一个处理后的化合物数据库;以HIV整合酶为靶点,通过新的虚拟筛选工具PyRx运行AutoDock Vina,对ZINC数据库的化合物进行虚拟筛选;分析得到的小分子抑制剂与整合酶之间的结合情况,并用PyMol对小分子抑制剂与整合酶的结合模式进行3D建模.结果 经3轮筛选,发现5个高活性的HIV-1整合酶抑制剂ZINC9486894、ZINC47636331、ZINC57383520、ZINC68964708、ZINC73549421;5个小分子抑制剂与整合酶之间的结合主要是氢键结合力和疏水相互作用.结论 通过PyRx运行AutoDock Vina,从ZINC数据库的化合物中筛选出5个新的HIV-1整合酶抑制剂.
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铜绿假单胞菌外毒素A基因突变体的构建及其在大肠埃希菌中的表达
目的 将铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)基因突变为无毒性的ntPE基因,并在大肠埃希菌中进行表达.方法 利用Primer Premier 5.0软件设计PEA基因引物及PEA基因第553位氨基酸缺失的突变引物,以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)基因组DNA为模板,PCR扩增PEA基因,插入pGEM-T载体中,构建重组克隆质粒pGEM-PEA,以其为模板,利用突变引物,扩增ntPE基因(无毒性PEA),插入pET-30a载体中,构建原核表达质粒pET-ntPE,转化大肠埃希菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westem blot分析.结果 测序结果证明已成功获得突变基因;原核表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约69 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30％,可被小鼠抗PEA单克隆抗体特异性识别,具有较好的抗原性.结论 已成功获得无毒性的PEA突变基因,为构建以PEA为蛋白佐剂的融合蛋白疫苗奠定了基础.
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靶向G偶联蛋白受体87基因shRNA重组表达质粒的构建及鉴定
目的 构建靶向G偶联蛋白受体(G protein-coupled receptor,GPR)87基因的shRNA重组表达质粒,并进行鉴定.方法 根据NCBI基因数据库中的GPR87基因mRNA序列设计并合成3对靶向GPR87基因的shRNA,同时设阴性对照GPR87-HK序列,分别与线性化质粒pGenesil-.1连接,构建靶向GPR87基因的shRNA重组表达质粒GPR87-1、GPR87-2、GPR87-3及GPR87-HK,在Lipofectamine 2000介导下,分别转染BIU87膀胱癌细胞,通过RTPCR和Western blot法检测各组细胞中GPR87基因mRNA转录和蛋白表达水平,并计算表达抑制率.结果 3种重组质粒经单酶切及测序鉴定,证明构建正确;转染BIU87膀胱癌细胞48 h后,镜下观察均可见绿色荧光;GPR87-1组、GPR87-2组和GPR87-3组细胞中GPR87基因和蛋白表达水平均显著低于GPR87-HK组(P＜0.01),mRNA表达抑制率分别为76％、52％和50％,蛋白表达抑制率分别为90％、45％和41％.结论 成功构建了靶向GPR87基因的shRNA重组表达质粒,为后续研究GPR87基因对膀胱癌细胞的增殖、凋亡及耐药的影响奠定了基础.
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microRNA-125a-5p对巨噬细胞THP-1泡沫化过程的影响及其机制
目的 探讨microRNA-125a-5p(miR-125a-5p)对巨噬细胞THP-1泡沫化过程的影响及其机制.方法 在Lipao2000的介导下,将miR-125a-5p的增强剂(mimics)/抑制剂(inhibition)(终浓度均为50 nmol/L)分别转染THP-1细胞24 h后,加入终浓度为100 mg/L的低密度脂蛋白(oxygenized-low density lipoprotein,ox-LDL),继续培养48 h,同时设空白对照组(未转染)及ox-LDL组(仅加入终浓度为100 mg/L的ox-LDL).采用油红O染色和脂质染色的半定量分析法检测miR-125a-5p对THP-1细胞泡沫化的影响;Cholesterol/Cholesteryl Ester Quantitation Kit检测miR-125a-5p对THP-1细胞泡沫化过程中脂质蓄积的影响;Real-time PCR和Western blot法检测miR-125a-5p对THP-1细胞中酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶-1(acyl-coenzyme A:cholesterol acyhrasferase-1,ACAT-1)、ATP结合盒转运体A1(ATPbindingcasstte transporterA1,ABCA1)及细胞清道夫受体-A1(scavenger receptor-A1,SR-A1)mRNA及蛋白表达水平的影响.结果 与ox-LDL组比较,ox-LDL+ mimics组巨噬细胞泡沫化程度及脂质蓄积量均明显下降(P均＜0.05),ox-LDL+inhibition组均明显增加(P均＜0.05);ox-LDL+mimics组ACAT-1和SR-A1 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P均＜0.05),而ABCA1 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P均＜0.05);ox-LDL+inhibition组ACAT-1和SR-A1 mRNA及蛋白表达水平明显增加(P均＜0.05),而ABCA1 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P均＜0.05).结论 miR-125a-5p可通过调解ACAT-1、ABCA1和SR-A1的表达水平,减少巨噬细胞内脂质类的堆积,抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化,从而发挥抗动脉粥样硬化(atheroscler-osis,As)的作用.
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疏水层析在去除复合干扰素聚集体中的应用
干扰素(interferon,IFN)是一种具有广泛生物活性的调节蛋白质,临床上主要用于抑制病毒的增殖.重组复合干扰素(consensus interferon,cIFN)是一种完全由人工设计的重组干扰素,是通过对14种天然亚型IFN序列的扫描,利用重组DNA技术,将这些亚型IFN蛋白质结构中每一位点上常见的氨基酸序列排列成一复合序列,再通过基因重组技术在大肠埃希菌中进行表达.
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淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体多重荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用
目的 建立淋病奈瑟菌(Neisseria agonorrhoeae,NG)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)、细小脲原体(Ureaplasma parvum,UP)多重荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)检测方法.方法 选择NG保守基因porA、解脲支原体(Ureaplasma urealytieum,UU)保守基因ure及CT保守基因trp作为目标检测基因,设计引物及TaqMan探针,制备重组质粒标准品,绘制标准曲线,建立多重FQ-PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性.用建立的方法对203份泌尿生殖道感染NG、CT、UP的临床样本进行同步检测,并与单重FQ-PCR法、常规PCR法及基因测序结果进行比较.结果 重组质粒标准品经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;建立的标准曲线起始DNA拷贝数与Ct值之间的线性关系良好,相关系数为0.998 ～ 1.000;该方法检测NG、CT和UP的灵敏度均可达102 copies/ml,检测范围可达109 ～ 102 copies/ml,相关系数分别为1.000、0.999和0.995;不与生殖道其他菌群如阴道霉菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、人型支原体、单纯疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型及人乳头瘤病毒(16/18型)发生交叉反应;检测的203份样本中,多重FQ-PCR检测NG、CT、UP的阳性检出率分别为34.48％、30.54％、18.71％,与单重FQ-PCR法、基因测序法比较,差异无统计学意义(P＞0.05),3种方法阳性检出率均高于常规PCR法;与基因测序法相比,多重FQ-PCR法灵敏度为100％,3种病原体检测特异性均高于98.50％.结论 已成功建立NG、CT、UP多重FQ-PCR检测方法,该法检测时间短,特异性强,灵敏性高,适合于临床快速诊断.
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高效阴离子交换色谱法测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量
目的 采用高效阴离子交换色谱法测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量.方法 高效阴离子交换色谱法色谱条件:色谱柱:IonPac AS1 1-HC离子交换柱(4 mm× 250 mm);流动相:20 mmol/L的NaOH溶液,等度洗脱20 min,流速:1.0 ml/min;抑制器:ASRS 4 mm阴离子抑制器,抑制电流120 mA;检测器:电导检测器,检测池温度30℃,进样量:25μl.对建立的方法进行线性范围、检测限的确定以及准确性、精密性验证,并进行初步应用.结果 枸橼酸离子浓度在0.1～2.0 μg/ml范围内,对照品色谱峰面积与枸橼酸离子浓度呈良好的线性关系,r=0.9990,按信噪比(S/N)为3确定方法的检测限为0.01 μg/ml;准确性试验枸橼酸离子的总平均回收率为97.80％,RSD为0.69％;1份加样人凝血因子Ⅷ溶液连续测定6次峰面积的RSD为0.08％;高效阴离子交换色谱法、比色法及阳离子交换色谱法测定3批人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子含量的结果基本一致,均符合《中国药典》 三部(2010版)规定.结论 高效阴离子交换色谱法可用于测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量,且该方法操作简便、快速,准确性、精密性高.
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5种病毒性脑炎相关RNA病毒多重RT-PCR检测方法的初步建立
目的 建立肠道病毒、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的多重RT-PCR检测方法.方法 根据GenBank中登录的肠道病毒、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒基因组序列,分别设计肠道病毒5'UTR基因、乙型脑炎病毒E基因、麻疹病毒M基因、风疹病毒E基因和腮腺炎病毒M基因的特异性引物,建立多重RT-PCR检测方法,并进行敏感性验证.结果 应用5种引物可分别扩增脊髓灰质炎病毒、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的152、429、111、352和274 bp特异基因条带.对脊髓灰质炎病毒、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的的敏感度分别为62.5 CCID50/ml、250 PFU/ml、125 CCID50/ml、125 CCID50/ml和125 CCID50/ml.结论 初步建立了5种脑炎RNA病毒多重RT-PCR检测方法,该法敏感性良好,可用于5种脑炎相关RNA病毒的快速检测.
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小刺猴头菌发酵浸膏寡糖的制备及其对肠道菌群体外生长的影响
目的 制备小刺猴头菌发酵浸膏寡糖,并检测其对肠道菌群体外生长的影响.方法采用酶降解、酸降解两种方法 制备小刺猴头菌发酵浸膏寡糖,通过葡聚糖凝胶层析法与荧光辅助糖电泳法(fluorophore assisted carbohydrateelectrophoresis,FACE)进行分离分析,并观察不同降解条件产物对大肠埃希菌和鼠李糖乳杆菌体外生长的影响.结果 佳酶降解反应条件为料液比1∶45,反应温度50℃,反应时间5h,选取还原糖得率低(21.67％)、中(32.33％)、高(36.11％)3组寡糖产物,分别命名为HFP-M1、HFP-M2、HFP-M3;佳酸降解反应条件为反应温度25℃,pH 3,反应时间1h,选取还原糖得率低(39.72％)、中(44.93％)、高(48.25％)3组寡糖产物,分别命名为HFP-S1、HFP-S2、HFP-S3;层析结果显示,酸降解寡糖比酶降解寡糖相对分子质量小;FACE分析显示,在32％的凝胶浓度下,酶降解寡糖可分离出较明显的条带,而酸降解寡糖条带不太清晰;两种方法降解获得的6种寡糖均能显著抑制大肠埃希菌的繁殖,促进鼠李糖乳杆菌的生长,且效果优于小刺猴头菌发酵浸膏多糖.结论 采用酶降解和酸降解两种方法制备的小刺猴头菌发酵发酵浸膏寡糖对大肠埃希菌的繁殖具有抑制作用,对鼠李糖乳杆菌的生长均有促进作用.本实验为大分子小刺猴头菌发酵浸膏多糖及其降解产物应用于医药保健或功能性食品的开发提供了实验依据.
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离子色谱法测定脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗的高碘酸钠含量
目的 建立脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中残余高碘酸钠含量的检测方法.方法 通过抗坏血酸将高碘酸根还原成碘离子,采用IonPac AS11-HC阴离子交换分析柱(4 mm×250 mm),上样量25μl,以50 mmol/LNaOH淋洗液等度洗脱,流速1.5 ml/min,电化学检测器测定还原出的I-,用Chromeleon色谱工作站记录并分析数据.对建立的方法进行专属性、准确性、重复性验证,确定该方法的低检出限和小定量限,并进行初步应用.结果 等浓度的抗坏血酸和高碘酸钠的反应比例为4∶1时,高碘酸根可完全还原为I-.对照品I-在10 μg/L～1 mg/L范围内,I-浓度和色谱峰面积呈良好的线性关系,r均大于0.999,回收率为91.66％～110.20％,RSD为0.2％ ～2.3％,小检出限为1 μg/L(信噪比3∶1),小定量限为5μg/L(信噪比10∶1).用建立的方法检测A群、C群、Y群和W135群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物各2批,均未检测出高碘酸钠.结论 离子色谱法可检测脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中的高碘酸钠含量,该方法操作简便、灵敏、快速,干扰小,重现性好,适用于对疫苗生产过程中的质量控制.
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一种新型疫苗递送系统DepoVaxTM的研究进展
DepoVaxTM是一种新型疫苗递送系统,可以作为佐剂,与不同抗原作用,制备多种疫苗,用于肿瘤治疗及多种传染性疾病的预防.DepoVaxTM已被证明能够产生独特的贮存效应,且可吸引抗原提呈细胞至注射位点,从而刺激机体产生更为快速强大的免疫反应.本文就DepoVaxTM的结构和成分、作用机制及应用作一综述.
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细菌免疫球蛋白结合分子特性及应用的研究进展
免疫球蛋白结合蛋白[Immunoglobulin(Ig)-binding protein,IBP]是多种病原体产生的以非抗原形式与免疫球蛋白结合的蛋白,在病原体致病中发挥重要作用.这些蛋白各自具有独特的结构特征及结合特性,赋予其抗体纯化、抗体检测和抗体吸附的应用潜能,已广泛应用于科研、病原体感染抗体特异诊断、抗体药物纯化及临床免疫吸附治疗.应用重组技术所构建的融合IBP较好地保留了母体分子的结合特性,并很好地弥补了各自对不同IgG结合的不足,显著提升了在抗体纯化和免疫沉淀方面的应用优势.应用分子进化技术所获得的由不同IBP单结合结构域组合而成的新型进化免疫球蛋白结合分子(novel evolved immunoglobulin-binding molecule,NEIBM),具有母体IBP所没有的新的Ig结合模式,其中对Ig Fab κ轻链和VH3重链的双位点协同结合大大提高了与IgM的结合能力,并显示出在病原体特异性抗体检测中的应用优势.本文对主要的天然IBP、重组IBP和NEIBM的结构特征、结合特性及其应用作一综述.
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Benzonase酶降解Vero细胞DNA的狂犬病疫苗动物安全性评价
目的 对Benzonase非限制性核酸内切酶降解Vero细胞DNA的狂犬病疫苗进行动物安全性评价.方法 依据《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》,对经Benzonase酶处理的冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)进行豚鼠全身主动过敏性试验、体外溶血性试验、大鼠急性毒性试验和家兔肌肉刺激试验,评价疫苗的安全性.结果 狂犬病疫苗豚鼠过敏反应发生率为50％,5 min后恢复正常;体外溶血结果为阴性;大鼠急性毒性试验未见异常;家兔肌肉刺激性试验在注射部位肌肉局部出现了极轻度到轻度的间质炎性细胞浸润、肌肉组织变性坏死及间质纤维组织增生,给药后2周,上述病变程度明显缓解.结论 利用Benzonase非限制性核酸内切酶降解Vero细胞DNA的狂犬病疫苗(酶残留量低于0.2 ng/ml)安全性良好,不影响其临床使用.
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F株鸡毒支原体疫苗对肉鸡生产性能的影响
目的 探讨F株鸡毒支原体(F-strain Mycoplasma gallisepticum,FMG)疫苗对商品肉鸡和父母代肉种鸡生产性能的影响.方法 将200羽岭南黄商品肉鸡平均分为4组:免疫攻毒组[免疫FMG疫苗,并用MG强毒株VMG的标准株(R株,RMG)攻毒]、未免疫攻毒组(不免疫FMG疫苗,用RMG攻毒)、免疫未攻毒组(只免疫FMG疫苗,不用RMG攻毒)和对照组(不免疫FMG疫苗,且不用RMG攻毒);将3 000羽父母代肉种鸡平均分为2组:免疫组(免疫FMG疫苗)和对照组(不免疫FMG疫苗).再按照养殖场常用免疫程序,商品肉鸡于7日龄免疫新城疫(Newcastledisease,ND)疫苗,父母代肉种鸡于8日龄免疫ND疫苗.采用双重PCR检测两种鸡FMG和VMG,半自动型生化分析仪分析商品肉鸡部分血液指标,测定两种鸡的生长性能指标和血清ND免疫抗体滴度.结果 在商品肉鸡和父母代肉种鸡中,FMG疫苗免疫鸡群的VMG检出率和料重比均显著低于未免疫鸡群,总增重和ND免疫抗体滴度均显著高于未免疫鸡群(P＜0.05).相同日龄的各组商品肉鸡血清中SCA、SCHOL、TP、SUN的含量差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 FMG疫苗能有效降低MG感染带来的风险,促进肉鸡生产性能的提升,增加经济效益.
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肠道病毒71型灭活疫苗的小鼠细胞免疫效果
目的 评价肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗诱导小鼠的细胞免疫效果.方法 分别以不同剂量(1、2.5、5、10 μg/ml,均含铝佐剂1 mg/ml)、不同剂型(含铝佐剂1 mg/ml或不含铝佐剂)、不同免疫剂次(单次免疫或加强免疫)EV71灭活疫苗经腹腔免疫小鼠,0.5 ml/只,均设铝佐剂对照组(仅注射铝佐剂1 mg/ml).采用经典小鼠树突状细胞(dendritic cell,DC)培养方法制备正常小鼠DC,瑞氏染色法检测细胞形态,流式细胞术分析其表型及纯度;免疫磁珠分选法(magnetic activated cell sorting,MACS)分离小鼠脾脏CD4+、CD8q淋巴细胞,流式细胞术检测细胞纯度.ELISPOT法检测各组免疫小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ的水平;细胞因子试剂盒检测小鼠淋巴细胞培养上清及小鼠血清中细胞因子的水平.结果 DC形态不规则,表面树枝状突起形态不同,细胞核较大且不规则;DC纯度为(81.39±9.24)％,可高水平表达MHⅡ(Ⅰ-A/Ⅰ-E)类分子,中度表达CD86和CD40.CD4+、CD8q细胞纯度分别为95.27％和94.08％.随着疫苗免疫剂量的增加,CD4+T细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ及CD8+T细胞分泌IFNγ的SFC显著增加,5μg/ml疫苗组达大值,且明显高于其他组(P均＜0.05);5μg/ml疫苗组淋巴细胞培养上清中IFNγ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-5、TNF-α含量明显高于其他组(P＜0.05);1、2.5、5μg/ml疫苗组血清中IL-10含量明显高于铝佐剂对照组(P＜0.05),1μg/ml疫苗组明显低于2.5及5μg/ml疫苗组(P＜0.05).含铝佐剂疫苗组CD4+T细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ及CD8+T细胞分泌IFNγ的SFC、淋巴细胞培养上清中IL-2、IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α水平及血清中IL-10含量均明显高于无铝佐剂疫苗组(P均＜0.05).加强免疫组CD4+T细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ及CD8+T细胞分泌IFNγ的SFC、淋巴细胞培养上清中IL-2、IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α水平、血清中IL-10含量均明显高于单次免疫组(P均＜0.05).结论 EV71灭活疫苗可诱导小鼠产生特异性细胞免疫反应,本实验为其进一步人体临床试验研究奠定了基础.
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石菖蒲提取物的抑菌效果及其提取工艺的优化
目的 探讨石菖蒲提取物的抗菌效果,并优化其提取工艺.方法 采用振荡浸提法制备石菖蒲提取物,以番茄灰霉病菌为供试菌,采用菌丝生长速率法测定提取物的抑菌率,筛选佳提取溶剂,并经固体培养基稀释法测定有效抑菌浓度.通过单因素试验优化石菖蒲抑菌成分的提取工艺,并在单因素试验的基础上,通过正交试验确定佳提取工艺组合.结果 石菖蒲佳提取溶剂为乙醇;石菖蒲乙醇提取物对番茄灰霉病菌的小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为0.04 g/ml,小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)为0.06 g/ml;佳提取工艺组合为温度38℃,时间12h,乙醇体积分数100％,料液比1∶12,转速240 r/min.结论 石菖蒲有机提取物对番茄灰霉病菌具有抑制作用;优化了乙醇提取条件,建立了有效的提取工艺,为以石菖蒲为材料研发中药杀菌剂提供了实验依据.
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2012年长春市健康人群流行性脑脊髓膜炎抗体水平调查
目的 调查2012年长春市健康人群流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)抗体水平,预测流脑发病的趋势,为流脑的防控提供科学依据.方法 选择农安县作为监测点,按照《全国流行性脑脊髓膜炎监测方案》规定的采样数量和分组方法,将健康人群分为7个年龄组:＜1岁、1～2岁、3～4岁、5～6岁、7～ 14岁、15～19岁、≥20岁,每组30人,共调查210人.采集静脉血2 ml,分离血清,采用ELISA法检测血清中A群、C群流脑IgG抗体水平,并计算抗体几何平均滴度(GMT),同时调查150名15岁以下儿童流脑多糖疫苗的免疫史.结果 2012年长春市健康人群A群流脑IgG抗体阳性率为85.71％(180/210),GMT为1∶4.420,C群流脑IgG抗体阳性率为71.43 ％(150/210),GMT为1∶2.936,A群流脑抗体阳性率和GMT均明显高于C群(P均＜0.001);不同年龄组之间A群流脑抗体GMT差异无统计学意义(P＞0.05),而阳性率差异有统计学意义(P＜0.05);C群各年龄组人群抗体阳性率差异无统计学意义(P＞0.05),而抗体GMT差异有统计学意义(P＜0.001);男性与女性人群之间A群、C群流脑抗体的阳性率和GMT差异均无统计学意义(P＞0.05);不同年龄组人群A群与A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗接种率差异有统计学意义(P＜0.001),抗体阳性率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 2012年长春市不同年龄组健康人群A群和C群流脑IgG抗体的阳性率维持在较高水平,提示大部分人对A群和C群流脑具有免疫力,但可能存在C群脑膜炎球菌的自然感染危险,应加强流脑疫情监测;在做好6岁以下儿童常规接种的基础上,应开展7～ 14岁儿童A+C流脑疫苗的免疫接种,防止流脑疫情局部暴发.
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鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1蛋白单克隆抗体,并进行鉴定.方法 用差速离心纯化的IBV四川分离株Sczy3免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.利用IBV鼠高免血清建立间接ELISA,筛选杂交瘤细胞.强阳性孔经有限稀释法亚克隆,获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水.用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单抗的亚型,Western blot法分析单抗的反应原性,ELISA法分析单抗的特异性及其与不同IBV毒株的交叉反应性.结果 经连续4次亚克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗IBVSczy3株单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C8C1和2C 10E7,其腹水效价分别为1∶12 800和1∶25 600.2株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgM亚型;均可特异性识别S1蛋白;2株单抗只与IBV发生特异性反应,与新城疫病毒(Newcastle diseasevirus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型和AIV H5抗原均不反应,与其他5种基因型的10株IBV毒株均可产生交叉反应.结论 成功制备了2株IBV S1蛋白单克隆抗体,为IBV的检测、抗原表位筛选及致病机理的研究等提供了材料.
| 年 | 期数 |
| 2019 | 01 02 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 |
| 2000 | 01 02 03 04 |
