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木聚糖酶的急性毒性和致突变性研究
木聚糖是一类广泛存在于植物体内的半纤维素,约占细胞干重的35%[1].木聚糖酶可将木聚糖降解成低聚糖和木糖.低聚糖的特点与功能是:具有难消化性,低卡而不会导致肥胖;有很高的双歧菌增殖活性,是肠内双歧菌的活化增殖因子;是难发酵性糖,不易造成龋齿.另外,低聚糖可代替葡萄糖作为糖尿病人的疗效食品[2].因此,木聚糖酶在食品行业的应用方面有着巨大的潜力.为了解其安全性,我们对木聚糖酶进行了急性毒性和致突变实验.
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产木聚糖酶芽胞菌Y-12的筛选及产酶条件的研究
利用透明圈平板培养和木聚糖发酵试验,筛选出1株高产木聚糖酶的芽胞杆菌,并对该菌株的酶学特性和适宜发酵条件进行研究.结果表明,此菌对秸秆和麦麸的分解率分别为43.3%和63.4%.产酶较高的适培养条件,即大豆蛋白胨2%、胰蛋白胨3%、酵母粉0.1%和葡萄糖2%.适宜反应温度和pH分别为37℃和7.采用10 L发酵罐发酵,培养48 h后,酶活达3024 U/ml,比三角瓶发酵(酶活达2185 U/ml)提高了38%.
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西门塔尔牛瘤胃木聚糖酶基因的克隆及相关序列分析
目的 克隆西门塔尔牛(Simmental)瘤胃木聚糖酶基冈Rua11A,并进行相关序列分析.方法 采用巢式PCR及单侧PCR技术从西门塔尔牛瘤胃微生物宏基因组DNA内直接克隆木聚糖酶基因Rua11A,并利用生物信息学软件对该基因序列及其编码氨基酸序列进行预测和分析.结果 拼接后获得了1 278 bp的Rua11A编码区DNA序列,包括762 bp的木聚糖酶编码区、102 bp的连接序列编码区和411 bp的碳水化合物结合域(carbohydrate binding module,CBM)编码区,共编码425个氨基酸.氨基酸序列N-末端有1处富含疏水性氨基酸,不存在跨膜结构域;包含31个氨基酸的信号肽(signal peptide)及394个氨基酸的成熟肽(mature peptide),且理化性质稳定;预测的Rua11A空间结构具有11家族木聚糖酶的典型特征,属于CBM第四家族;含有11家族木聚糖酶高度保守的氨基酸片段及催化活性中心(catalytic active center).结论 成功克隆了西门塔尔牛瘤胃木聚糖酶基因Rua11A,并进行了相关序列分析,为Rua11A的异源高效表达及分子改造奠定了基础.
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人溶菌酶-木聚糖酶融合基因在毕赤酵母中的表达
目的 在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)-木聚糖酶(Xylanases,Xyn Ⅱ)融合基因.方法 通过PCR技术将hLY基因与Xyn Ⅱ基因连接,中间插人肠激酶识别位点序列;将其克隆至载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-Xyn Ⅱ-EKsite-hLY,经Sac Ⅰ线性化后,电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选得到高拷贝转化子,PCH鉴定为阳性的克隆用甲醉进行诱导;表达的融合蛋白经Sephadex G-75凝胶柱层析纯化后,用肠激酶酶切,分别采用改良舒加法和DNS法测定hLY和Xyn Ⅱ的活性.结果 获得的融合基因序列与理论序列完全一致;重组表达质粒构建正确;融合蛋白的hLY和Xyn Ⅱ活性分别为170和158 U/ml,经肠激酶酶切后,hLY的活性为520 U/ml,Xyn Ⅱ的活性达244 U/ml.结论 已在毕赤酵母中成功表达了Xyn Ⅱ-EKsite-hLY融合基因,经肠激酶酶切后的目的蛋白活性均有较大提高.
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糖苷水解酶第10家族真菌木聚糖酶保守区及进化关系的分析
目的 对糖苷水解酶第10家族(glucoside hydrolase family 10,GHF10)真菌木聚糖酶保守区及进化关系进行分析.方法 应用CLUSTALW2软件对41条GHF10真菌木聚糖酶氨基酸序列进行多序列比对分析,获得完全保守的氨基酸位点;应用Block Maker和Consensus软件对CLUSTALW2比对结果进一步分析,确定第10家族真菌木聚糖酶共有的保守区及保守氨基酸位点;应用Pymol软件对源于GenBank中登录的6种10家族木聚糖酶进行比对,并找到这41条序列中共有的β折叠和α螺旋;利用MEGA 4.0软件对CLUSTALW2比对结果构建系统进化树,并根据进化树进行分组.结果 41条序列长度虽然不等,但均包含E270和E405两个谷氨酸催化位点.通过序列比对,得到第10家族真菌木聚糖酶的5个高度保守区TPENSMK、RGHTLVWHSQLPSWV、WDVVEN、AKLYINDYYNL、TELDI以及20个完全保守的氨基酸位点,这些保守区和保守位点多数分布在木聚糖催化区域以及(β/α)8折叠桶的内壁上.根据木聚糖酶的亲缘关系,可将第10家族真菌木聚糖酶分为3个大组,其中第1和第3组的木聚糖酶分别有12和27种,且均来源于子囊菌门;第2组仅包含2种木聚糖酶序列,来源于Neocallimastigomycota和担子菌门.结论 分析了GHF10真菌木聚糖酶的保守区及进化关系,为木聚糖酶的工程改造奠定了基础.
关键词： 糖苷水解酶第10家族 真菌 木聚糖酶 保守区 进化 -
宇佐美曲霉阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同作用降解小麦麸皮制备阿魏酸
目的 利用宇佐美曲霉(A spergillus usamii)阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同降解小麦麸皮,制备阿魏酸(ferulic acid,FA).方法 将工程酵母菌P.pastoris GS115/AusfaeA和GS115/Ausxyn11A经甲醇诱导发酵,分别获得重组阿魏酸酯酶和木聚糖酶.在pH5.0、40℃、料液比1∶60(g∶ ml)、水解10h的条件下,探讨木聚糖酶添加量、阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同作用对阿魏酸酯酶水解去淀粉麦麸(destarched wheat bran,DSWB),释放FA的影响,并检测酶解产物FA的体外抗氧化活性.结果 在0.5 g DSWB中单独加入56U阿魏酸酯酶f寸,FA的释放率为碱提等量麸皮总FA含量的19.48％;在此基础上添加木聚糖酶,能促进阿魏酸酯酶进一步释放FA,当木聚糖酶添加量为300 U时,FA的释放率从19.48％上升至70.10％;木聚糖酶单独作用于DSWB未检测到FA的释放;在反应体系中先添加木聚糖酶,能释放1.23 mgFA,比先添加阿魏酸酯酶提高了0.3 mg;随着FA浓度的增加,FA的还原能力及其对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力均呈稳定增长,各浓度FA对羟基自由基的清除能力均高于对DPPH自由基的清除能力.结论 阿魏酸酯酶与木聚糖酶之间存在协同作用,双酶共同作用,有利于小麦麸皮的降解,提高FA的释放率.
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微波诱变法筛选木聚糖酶高产球毛壳霉菌株
目的 微波诱变法筛选遗传稳定的木聚糖酶高产球毛壳霉菌株.方法 活化球毛壳霉菌种,制备孢子悬液,在不同功率条件下对其进行辐照处理60s,选择致死率在80％左右的辐照功率,在此功率条件下对其进行不同时间的微波诱变,经初筛和复筛后,采用DNS法测定木聚糖酶活性,筛选木聚糖酶高产菌株,并分析其传代稳定性.结果 在微波辐射时间80 s,功率240 W条件下处理的球毛壳霉孢子,致死率为89.5％；经诱变及菌种筛选,获得1株木聚糖酶高产菌株W80-8,其酶活力为7520U/ml,比出发菌株提高了124％;经6次传代培养,W80-8株木聚糖酶活力未见明显降低,未发生原位回复突变.结论 成功筛选获得1株遗传稳定的木聚糖酶高产球毛壳霉菌株.
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毕赤酵母产重组木聚糖酶发酵条件的优化及其酶学性质
目的 优化毕赤酵母工程菌GS115/xynlIA产重组木聚糖酶的发酵条件,并检测其酶学性质.方法 采用单因素试验和L9(34)正交试验考察摇瓶发酵条件下培养基起始pH值、诱导剂甲醇添加量、诱导温度及诱导时间对产酶活性的影响；并分析重组木聚糖酶的酶学性质.结果 影响重组毕赤酵母产酶的因素重要性依次为:培养基起始pH值＞诱导时间＞诱导温度＞甲醇添加量,重组酵母产酶佳条件为:起始pH值7.5,甲醇添加量1.5％,32℃诱导96 h,在此条件下进行诱导表达重组木聚糖酶的酶活性可达228.35IU/ml;酶的适反应温度为50℃,适反应pH值为5.5,在低于40℃和pH4.5～7.5的范围内较稳定.结论 优化了毕赤酵母产重组木聚糖酶的发酵条件,为木聚糖酶的工业化生产及应用提供了依据.
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木聚糖酶热稳定性分子改造的研究进展
木聚糖酶广泛应用于食品加工、生物制药、酒的澄清及纸浆漂白等行业.热稳定性对于木聚糖酶在工业领域中的应用起着至关重要的作用.根据催化结构域的氨基酸组成不同,木聚糖酶主要分为F/10和G/ll两大家族.本文主要就这两大家族木聚糖酶热稳定性分子改造的技术和方法作一综述,为进一步提高木聚糖酶的热稳定性提供参考.
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木聚糖酶基因克隆和表达的研究进展
半纤维素分解微生物在自然界的物质循环过程中起着重要作用,半纤维素是植物多糖的重要成分之一,而木聚糖则是半纤维素的主要成分.木聚糖酶(xylanase)可催化木聚糖的水解,在各种生物体内均发现木聚糖酶.在过去几十年中,已有上百种木聚糖酶基因被克隆至同源或异源宿主内来表达木聚糖酶,以期改变宿主特性并适于商业应用.本文综述了木聚糖酶基因的克隆和表达,并对基因工程技术在木聚糖酶上的应用前景进行了展望.
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重组毕赤酵母工程菌合成木聚糖酶的条件优化
为提高木聚糖酶在重组毕赤酵母工程菌中的表达量,优化了工程菌发酵的种龄、接种量、诱导时间、诱导用甲醇浓度、pH等条件.结果显示:种龄16 h,接种量4%,生长期间发酵液pH 4.8,诱导期间发酵液pH 5.0,甲醇浓度1%,诱导时间96 h,摇瓶发酵酶活力大于4 550 u/ml.
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金针菇固态发酵产木聚糖酶的纯化及其性质研究
摘要金针菇固态发酵产生木聚糖酶经硫酸铵盐析、透析、浓缩、Sephadex G-75分子筛层析等分离与纯化步骤,得到了一种相对分子质量约为59.7k的电泳纯木聚糖酶,其终的活性收率为23.3％,纯化倍数为9.4.该木聚糖酶在pH值为6.0,50℃下的酶解效果佳.酶的pH稳定性及热稳定性都比较好,在pH 4.0～8.0时基本稳定,80℃时相对酶活力仍保持在55.81％.Ca2+、Zn2+对该酶活性有一定的激活作用,而Hg2+、Cu2+则有较强的抑制作用.
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利用反向胶束技术从微紫青霉菌中提取木聚糖酶的初步研究
目的 利用反向胶束技术从微紫青霉菌中提取木聚糖酶.方法 采用双-2-乙基己基硫代琥珀酸钠(AOT)异辛烷反胶束溶液萃取和反萃取由微紫青霉菌产生的木聚糖酶,探讨水相pH值、离子强度、AOT浓度等因素对分离效率的影响.结果 当AOT浓度为0.6 mol/L,萃取pH 6.0,NaCl浓度为0.1mol/L,反萃取pH 8.0,NaCl浓度为0.5 mol/L,15％乙醇时,该体系从微紫青霉菌澄清发酵液中提取木聚糖酶,萃取率接近100％,反萃取率也在80％以上.木聚糖酶酶比活从27 U/mg提高到208 U/mg,提高了6.7倍,且粗酶纯化后的比活在200U/mg以上.结论 采用此体系提取木聚糖酶具有较好的工业前景.
关键词： 木聚糖酶 反胶束 萃取 反萃取 双-2-乙基己基硫代琥珀酸钠 -
耐热耐碱木聚糖酶在大肠杆菌中的高效分泌表达及酶学性质研究
目的 研究枯草芽孢杆菌来源的木聚糖酶基因在大肠杆菌BL2l中的高效分泌表达并对其产木聚糖酶进行酶学性质分析.方法 全基因合成枯草芽孢杆菌木聚糖酶基因序列并进行密码子优化,经大肠杆菌BL2l表达后获得基因工程菌株,通过SDS-PAGE电泳检测、硫酸铵分级沉淀和AKTA系统分离纯化,分析表达产物的酶学性质.结果 重组木聚糖酶为胞外分泌性表达,相对分子质量约43×103;酶促反应适温度为65 ℃,适pH为10.0,适条件下酶活高可达1201.5 IU/ml.结论 成功获得高效分泌表达重组木聚糖酶的基因工程菌株,该木聚糖酶具较好的耐热性和耐碱性.
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一株产耐热耐碱木聚糖酶菌株的筛选及酶学性质研究
目的 对分离得到的一株产耐热耐碱木聚糖酶细菌ZH-07进行鉴定,并对其产木聚糖酶进行酶学性质分析.方法 根据培养基上透明圈大小筛选产酶量高的菌株,通过菌落形态、生理生化特征及16S rDNA序列同源性比对等分析鉴定菌株种属.并通过一系列单因素试验、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和薄层色谱(TLC)进行酶学性质研究.结果 ZH-07菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).该菌能以农业废弃物玉米芯为碳源,液体发酵产耐热耐碱木聚糖酶,50℃培养36 h,木聚糖酶的高酶活性达1664.9 U/mL;木聚糖酶的相对分子质量(Mr)约24×103,无纤维素酶活性;酶促反应适温度为70℃,适pH 10,70℃、pH 10处理3 h仍保持64.7%的活性.结论 Bacillus subtilis ZH-07产木聚糖酶有较好的热稳定性和碱稳定性,在低聚木糖工业生产中有巨大应用潜力.
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不同来源木聚糖酶酶学性质研究
目的 研究比较4种不同来源木聚糖酶的酶学性质,为各酶在不同领域应用提供理论依据.方法 通过摇瓶发酵获得源自4种菌株的木聚糖酶粗酶液,用二硝基水杨酸(DNS)法测定各木聚糖酶的酶活性,并研究酶学性质.结果 嗜热棉毛菌、绿色木霉、泡盛曲霉和橄榄绿链霉菌来源的木聚糖酶的适温度分别为70,60,50和60℃;适pH分别为6,4,4和6.嗜热棉毛菌来源的木聚糖酶耐热性强,高温60℃下,酶活性高于85％,70℃仍保持60％以上的酶活性,且在pH4～11的范围内能保持较高稳定性.另外3种来源的木聚糖酶则有较强的耐酸性.结论 嗜热棉毛菌来源的木聚糖酶有饲料添加剂方面的应用优势.另外3种来源的木聚糖酶可根据不同行业对木聚糖酶的要求,应用于食品、医药、能源、环境等领域.
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木聚糖酶产生菌的筛选
目的 从土壤中筛选木聚糖酶产量高的菌株,并研究其产酶的初步条件.方法 根据培养基上水解圈的大小和摇瓶培养后木聚糖酶的酶活性,筛选产酶量高的菌株.通过一系列单因素试验,研究影响产酶的碳源、氮源和无机盐.结果 筛选到1株产木聚糖酶的菌株,其产酶的较优碳源、氮源和无机盐为麸皮(30 g/L)、牛肉膏(10 g/L)和磷酸氢二钾(1.0 g/L).结论 筛选到的菌株具有生产木聚糖酶的潜力.
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木聚糖酶产生菌的筛选
目的 从土壤中筛选木聚糖酶产量高的菌株,并研究其产酶的初步条件.方法 根据培养基上水解圈的大小和摇瓶培养后木聚糖酶的酶活性,筛选产酶量高的菌株.通过一系列单因素试验,研究影响产酶的碳源、氮源和无机盐.结果 筛选到1株产木聚糖酶的菌株,其产酶的较优碳源、氮源和无机盐为麸皮(30 g/L)、牛肉膏(10g/L)和磷酸氢二钾(1.0 g/L).结论 筛选到的菌株具有生产木聚糖酶的潜力.
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木聚糖酶在提高馒头品质中的应用
介绍了食品级木聚糖酶在提高馒头品质中的应用.对比了1种国产食品级木聚糖酶与2种进口食品级木聚糖酶作用的效果,证明国产木聚糖酶用于主食馒头加工具有独特的优势,可以替代国外同类进口产品.
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木聚糖酶毒性的初步研究
[目的]研究木聚糖酶的急性毒性、遗传毒性和亚急性毒性.[方法]小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验.[结果]木聚糖酶雌、雄小鼠LD50均大于10.0 g/kg,属实际无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用.[结论]在本次实验条件下,木聚糖酶为实际无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性.
