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甲基营养菌MP688甲醛脱氢酶的表达、纯化及酶活性质
目的 克隆甲基营养菌MP688甲醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase)基因adhA,在大肠杆菌中表达、纯化,并研究其酶学性质.方法 PCR扩增甲醛脱氢酶基因adhA,构建表达载体pTIG-AdhA,在BL21(DE3)中诱导表达,经Ni+亲和层析纯化,利用AHMT法进行体外酶学性质分析.结果 成功构建甲醛脱氢酶表达载体,在大肠杆菌中AdhA表达量达总蛋白的50%以上,其中大部分表达产物可溶,纯化得到纯度为95%的甲醛脱氢酶.甲醛脱氢酶能以甲醛为底物,适pH为7.0,适反应温度为30℃,室温保存6 d后酶活约保留60%.结论 在大肠杆菌中实现了甲基营养菌甲醛脱氢酶的可溶表达,在所考察的底物中,甲醛为该酶的适底物.
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钝齿棒杆菌argR基因克隆、表达及其重组菌发酵产精氨酸的探讨
目的 探讨N-乙酰鸟氨酸的转氨酶于钝齿棒杆菌当中,其精氨酸合成环节所起到的作用,并验证其酶学性质,从而为优化提高培养基的成分,以及发酵过程的工艺条件,和精氨酸的产量提供理论及实验依据.方法 于精氨酸的高产菌株中,使其钝齿棒杆菌的染色体(SYPA5-5)扩增,从而获取ACOAT的编码基因-argD,其全长为1176bp,编码氨基酸为390个,均于C.crenatum SYPA与Escherichia coli BL21(DE3)上成功表达.选择Ni柱进行亲和层析并纯化后,能够得到重组的蛋白比酶活可达到108.2U/g,并研究其酶学性质.再构建重组的钝齿棒杆菌,以加强其精氨酸的合成途径中ACOAT的蛋白表达量,同时对重组的菌产精氨酸予以发酵分析.结果 重组的钝齿棒杆菌同出发菌株进行对比,其胞内的ACOAT的酶活得到增强；并且重组菌中CCD1其精氨酸的平均产量达到了39.7g/L,其产酸终提高了14.7％.结论 通过研究,不仅对高产精氨酸其重组基因菌工程的构建提供以理论依据,而且还具有非常重要的指导意义.
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一株高产淀粉酶的解淀粉芽胞杆菌的分离鉴定及其产酶条件优化
目的 从土壤中分离产淀粉酶相对较高的菌株,并对其产酶条件进行优化,以期获得更经济、易得的高活力淀粉酶.方法 用平板稀释涂布法分别从温州及其周边地区多个淀粉含量高的土壤、污水中采集的样品中筛选产淀粉酶菌株,通过菌落形态、生理生化反应和16S rDNA序列比对对菌株进行鉴定;并从碳源、氮源、离子浓度及紫外诱变等产酶条件对高产淀粉酶菌株进行优化;利用碘-淀粉法等对粗酶液酶学性质进行初步研究.结果 从采集到的26个样品中共筛选到19株酶活较高、产酶稳定的野生型菌株.其中编号为Z19的菌株酶活高,达到351.78 U/mL.经形态和生理生化鉴定,结合16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为解淀粉芽胞杆菌.对菌株Z19的液体发酵条件研究表明,佳条件为玉米粉1.0%,明胶1.5%,淀粉含量0.5%,NaCl 0.5%,pH 7.0,发酵温度37 ℃,72 h,酶活达到1 360.92 U/mL;在固体培养基上,直接用麸皮,接种量为0.1%,含水量为60%,pH 7.0,120 h时,酶活达到1 504.2 U/mL.其适酶反应pH为6.5,反应温度55～60 ℃,底物浓度为0.5%.结论 从土壤中分离得到了产淀粉酶相对较高的解淀粉芽胞杆菌Z19菌株,产酶条件适用于工业生产,具有一定的应用前景.
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豆乳凝固酶产生菌LD30的研究
目的 从土壤中分离产豆乳凝固酶菌株,并研究其发酵条件和酶学性质.方法 采用常规土壤分离方法和培养基.结果 从广东、敦煌、吐鲁番等地得到的12份土壤样品中分离得到1株产豆乳凝固酶的菌株芽孢杆菌LD30.在给定的发酵条件下,豆乳凝固酶的产率达到600 U·L-1.酶学性质表明:该酶的适反应温度为70 ℃,60 ℃保温1 h,残余酶活力为50%.在pH6.0～7.0内,酶活力稳定,适酶反应的pH值为5.9.结论 筛选到的产豆乳凝固酶菌株芽孢杆菌LD30具有较高的产酶活性,值得进一步深入研究.
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酵母SOD分离纯化及其酶学性质的研究
目的发酵培养Y12酵母菌分离制备酵母SOD并研究其部分酶学性质.方法用已筛选出的一株Y12酵母菌对其在优化培养条件下发酵培养得到湿菌体,破壁抽提得SOD粗酶液,采用硫铵盐析、丙酮沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤和QAE-Sephadex A-50离子交换柱层析,分离得到酵母SOD并测定其部分酶学性质.结果 Y12酵母菌SOD产量达1 263 u·g-1湿菌体,分离得到酵母SOD,该酶属Cu、Zn-SOD,比活力为1 073.5 u·mg-1,活力回收率为54.1 %,紫外吸收峰在 257.2 nm,分子质量为32 456 u,亚基分子质量为16 227 u.结论此酵母SOD与文献中报道的动物血红细胞Cu、Zn-SOD基本相近.
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日本刺沙蚕纤溶酶的酶学性质及其分类
目的:探讨日本刺沙蚕纤溶酶(NJF)的适反应温度和适反应pH 值以及金属阳离子和蛋白酶抑制剂对酶活性的影响,确定NJF的酶学分类.方法:采用偶氮酪蛋白(azocasein)水解法测定NJF的适温度及适pH 值;利用10种金属阳离子(Na+、K+、Cu2+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Al3+和Hg2+)确定金属离子对NJF酶活性的影响;采用9种蛋白酶抑制剂(PMSF、EDTA、EGTA、β-巯基乙醇、苯甲脒、碘乙酸、抑肽酶、胃酶抑素A和大豆胰蛋白酶抑制剂)确定NJF的蛋白酶分类.结果:NJF具有较宽的热稳定性及pH稳定性范围,在40～80℃及pH7～11范围内有较好的稳定性,NJF酶适温度为60℃,适pH值为9;Hg2+能够强烈地抑制NJF的酶活性,Cu2+具有较弱的抑制作用,而其他金属阳离子对酶活性无明显抑制作用;NJF的酶活性能被典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF完全抑制.结论:NJF是一种典型的丝氨酸蛋白酶.
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沙蚕消化道产蛋白酶菌D2株的筛选及其酶学性质
目的 从海洋生物双齿围沙蚕消化道筛选产蛋白酶菌株,并对其胞外蛋白酶的性质进行分析.方法 用脱脂奶粉平板溶圈法及改良Lowry法进行产蛋白酶菌株的筛选和蛋白酶活力测定;Bradford法测定蛋白含量;UVP GDS8000型凝胶成像系统和VisionWorks、Bandscan4.03软件进行相对分子质量和纯度分析,并对酶的各项性质进行检测.结果 筛选出高蛋白水解活性菌株D2,其胞外蛋白酶比活性为156.0 U/mg,相对分子质量约为42 000,纯度大于97%,适作用温度印℃,适pH为9,在pH 6～10及0～55℃具有较好的稳定性.结论 D2株分泌的胞外蛋白酶有望成为一种新型的海洋微生物蛋白酶资源.
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产朊假丝酵母尿酸酶脂质体的酶学性质及其免疫原性
目的 研究脂质体介导的产朊假丝酵母尿酸酶(Uricase,UC)的酶学性质及其免疫原性.方法 采用逆向蒸发法制备UC脂质体,测定UC脂质体和UC的适反应温度、适pH值、酸碱稳定性以及部分金属离子和有机化合物对酶活力的影响;并以其为抗原免疫SD大鼠,制备抗血清,通过间接ELISA法检测血清抗体效价.结果 UC脂质体和UC的适反应温度均为40℃;适反应pH值分别为8.0和8.5;UC脂质体的稳定性明显高于UC;UC脂质体和UC的血清抗体效价分别为1:500和1:8 000.结论 产朊假丝酵母UC脂质体的酶学性质明显优于UC,免疫原性明显低于UC,为该酶的临床应用提供了实验依据.
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超氧化物歧化酶的固定化及其酶学性质
目的 制备同定化超氧化物歧化酶(SOD),并分析其酶学性质.方法 以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂,制备固定化超氧化物歧化酶.以邻苯三酚自氧化法分别测定溶液酶与固定化酶的活力,并计算回收率.对固定化酶的温度和pH稳定性、半衰期、重复使用的回收率及米氏常数(Km)进行测定.结果 固定化超氧化物歧化酶活力为333 U/g,酶活回收率为86.32%,半衰期为43.8 d;固定化酶室温保存5 d后,相对酶活力仍保持在80%以上,适反应温度为45℃,使用一次后回收率为70.12%.重复使用两次后回收率为51.72%;固定化酶与溶液酶在pH 6时活性强,Km分别为0.18 mmol/L和0.16 mmol/L.结论 该固定化酶较溶液酶的稳定性得到提高.便于贮存,在食品、药品、日用品等领域有良好的应用前景.
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Photobacterium sp.QH氨肽酶的基因克隆及其序列、酶学性质分析
目的 克隆盐湖菌株Photobacterium sp.QH(Ps sp.QH)氨肽酶的基因,并对其进行序列及酶学性质分析.方法 从青海盐湖采集水样,筛选Ps sp.QH菌株,进行16S rRNA分子生物学测定.通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析法从筛选菌株的发酵液中纯化氨肽酶,同时对其进行质谱分析,基因克隆及酶学性质分析.结果 获得的菌株Ps sp.QH与Photobacterium halotolerans为同一属.该菌株分泌的氨肽酶属于金属螯合氨肽酶M28家族,全基因序列长1 527 bp,共编码508个氨基酸,预测其全酶分子相对分子质量为55 900,氨基酸序列与Photobacterium halotolerans氨肽酶(KKC99795.1)同源性达98％.该氨肽酶在50℃时酶活高,40～50℃及pH 8.5时稳定性较好;Co2+对其有激活作用,Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+及Cu2+对其有不同程度的抑制作用;该酶在1～3 mol/L的NaCl溶液中仍保持较高活性.结论 Ps sp.QH分泌的氨肽酶对高盐有一定的耐受性,具有潜在的工业应用价值.
关键词： Photobacterium sp.QH 氨肽酶 基因克隆 酶学性质 质谱分析 -
杨树菇中一种脱氧核糖核酸酶的纯化及其性质
目的 分离纯化杨树菇子实体中脱氧核糖核酸酶,并对其性质进行分析.方法 通过80%饱和(NH4)2SO4沉淀、Blue Sepharose 6 Fast Flow、DEAE-Sepharose Fast Flow和SP-Sepharose Fast Flow层析方法 ,从杨树菇子实体中分离纯化一种脱氧核糖核酸酶.SDS-PAGE和活性SDS-PAGE测定相对分子质量,采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法分析其酶学性质,并检测pH、温度、Mg2+和EDTA浓度对酶活性的影响.结果 经纯化得到了一种脱氧核糖核酸酶,其相对分子质量为31 000.该酶对超螺旋质粒DNA、λDNA、ssDNA和dsDNA均具有降解活性,对dsDNA的降解活性略高于ssDNA,且酶活性依赖于二价金属阳离子.该酶的适pH值范围为7.5～9.6,50℃时相对酶活性高.结论从杨树菇子实体中纯化的脱氧核糖核酸酶属于一种非限制性脱氧核糖核酸内切酶.
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木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化及性质研究
目的建立简单有效的木瓜凝乳蛋白酶分离纯化方法,并研究其酶学性质.方法采用离子交换层析直接将木瓜凝乳蛋白酶分离纯化,通过温度、葡萄糖、盐酸胍及其他因素研究酶学性质.结果木瓜凝乳蛋白酶有较高的热稳定性,盐酸胍对其有抑制作用,葡萄糖对其有激活作用.结论离子交换层析是简单有效的分离纯化木瓜凝乳蛋白酶的方法,木瓜凝乳蛋白酶值得进一步开发利用.
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嗜热菌Anoxybacillus sp.DL3产蛋白酶条件及其酶学性质研究
目的:对Anoxybacillus sp.DL3的产蛋白酶条件及其酶学性质进行研究,为下一步进行蛋白酶基因的克隆、表达提供依据.方法:应用常规方法液体培养细菌,研究温度、pH、培养基中碳源、氮源对菌株产蛋白酶的影响,硫酸铵盐析的方法提取酶液,并采用Folin法测酶活性.用紫外分光光度计在OD680 nm测吸光值.并对提取的蛋白酶液进行酶的适温度、pH以及酶的热稳定性和pH稳定性研究,向酶液中添加金属离子和EDTA、PMSF,研究其对酶活性的影响.结果:在培养基初始pH是6.5,培养温度为40℃时菌株产酶酶活性大;培养基中以乳糖为碳源,酵母膏和硫酸铵为氮源,碳源与氮源的比例为1:2时,酶活大.酶学性质研究结果显示:该酶的适反应温度是55℃,适反应pH是7.0;在50℃保温20 min～80min内,酶活力下降幅度较小.60℃保温60min后,仍保持约60％的酶活.70℃保温60 min后,残余酶活为30％.该酶在pH为6.0～8.0范围内,相对酶活差别不是很大,下降趋势大致相同.在强碱条件下,相对酶活下降很明显.Fe2+、Cu2+和Hg2+对酶活性有明显的抑制作用;Ca2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对酶活性有明显的促进作用;乙二胺四乙酸(EDTA)和苯甲基磺酰氟(PMSF)对酶活性也有一定抑制作用.结论:Anoxybacillus sp.DL3所产的蛋白酶为嗜热中性蛋白酶,此酶具有较好的热稳定性和pH耐受性,该菌株具有进一步开发、利用的价值.
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乙酰短杆菌中核苷磷酸化酶的性质研究
目的:以乙酰短杆菌完整细胞为酶源,研究不同条件下核苷磷酸化酶的性质.方法:将乙酰短杆菌湿菌体置于不同保藏温度及在不同种类缓冲溶液中考察其稳定性；在有或无核保护下核苷磷酸化酶对热的稳定性；并设计核苷的磷酸解反应或合成反应,测定核苷磷酸化酶的活力及酶促反应的表观米氏常数.结果:乙酰短杆菌中的核苷磷酸化酶经低温保藏可以保持较长时间的稳定性；菌体在60℃处理l小时即失去核苷磷酸化酶的活力,但是添加胸腺嘧啶有明显的保护作用；菌体中核苷磷酸化酶的合成能力明显大于磷酸解能力；对尿苷和5-甲基尿苷的表观米氏常数和大反应速率分别为16.7、11.4 mmol/L,0.0063、0.0041mmol/L.min.结论:含核苷磷酸化酶的乙酰短杆菌完整细胞作为酶源,在低温下可以长时间保藏,反应中的碱基对核苷磷酸化酶的抗热性有益,该菌种可以作为工业上核苷磷酸化酶的来源.
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赤子爱胜蚓蚓激酶的异源表达及重组酶性质初步研究
利用基因工程技术从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida) cDNA中克隆得到一条全长为738 bp的蚓激酶编码基因Eflk(GenBank登录号KY452025),其编码245个氨基酸,与粉正蚓(Lumbricus rubellus) F-III-2的核苷酸和氨基酸序列同源性高分别为96.21％和97.14％.利用生物信息学方法预测分析蚓激酶EFLK蛋白分子主要由β折叠结构组成,理论等电点(pI)为4.97,其活性中心为Arg15-Phe19-Pro20-Glu66-Asn113”,位于loop结构所形成的隧道结构中.将该基因与pPIC9k载体相连接后电击导入毕赤酵母GS1l5中得到重组表达菌株GS 115-pPIC9K-Eflk,重组菌株经甲醇诱导发酵72 h,发酵液中蚓激酶活力达到224.8u/ml.纯化后重组酶蛋白的比活力为4 545.84 u/mg,相对分子质量为2.7×104.酶学性质研究结果表明该酶的适pH值为8.0,在pH 5.0～9.0范围内催化活力较高;在低于40℃条件下该酶的催化活性较稳定.
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氧化葡萄糖酸杆菌胞内脱氢酶Gox0525的酶学性质研究
将氧化葡萄糖酸杆菌胞内脱氢酶推测基因Gox0525克隆至表达载体pET-28a(+)中,并在大肠杆菌中得到可溶性表达的蛋白,纯化后经HPLC以及SDS-PAGE检测,表明其活性形式为四聚体.重组蛋白Gox0525属于短链脱氢酶家族,选择该家族的催化底物谱测试,结果表明Gox0525具有还原二酮的能力,且专一性利用辅酶NADPH,在pH 9.0、30℃条件下活性较高,适合保存在pH 7.0、4℃条件下.酶反应的发生对金属离子无依赖性,添加Ca2+对酶活力有促进作用,而Fe3+有抑制作用.
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链霉菌磷脂酶D的分离纯化及部分酶学性质
由链霉菌发酵所得的磷脂酶D经过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose 阴离子色谱、Source 30S阳离子色谱和Superdex 75凝胶过滤色谱分离纯化,相对分子质量约为57k.在55℃和pH 7.0时显示高相对酶活力.酶动力学参数Km和Vmax分别为254mmol/L和0.417μmol/min.
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核酸酶P1的分离纯化及部分酶学性质研究
桔青霉发酵液经离心、超滤、硫酸铵盐析、透析和DE-52型树脂柱色谱分离,纯化得到核酸酶P1.比活为28490u/mg,纯化10.5倍,收率为45%.SDS-PAGE电泳显示为单一条带.酶学性质研究结果表明,以酵母RNA为底物时的Km为3.36mmol/L,适作用温度70℃,适pH 5.4.
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松杉灵芝漆酶的分离纯化及酶学性质研究
采用硫酸铵分级沉淀、透析和DEAE-sepharose阴离子交换柱层析对松杉灵芝漆酶进行分离纯化并研究其部分酶学性质.结果表明,纯化漆酶比活力为55.438 7 U/mg,回收率为31.7％,相对分子质量约为52 000.该酶催化底物ABTS的适反应温度和适反应pH值分别为40℃和4.0,在30～40℃及pH 4.0～5.0范围内具有良好的稳定性.以ABTS为底物的米氏常数K为0.909 mmol/L,vm.为454.5 mmol/(Lmin).K+和Fe3+对漆酶具有明显的激活作用;NH+4、Cu2+对漆酶活性影响不大;Fe2+能完全抑制漆酶的活性.
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温敏载体固定化木瓜蛋白酶的特性及其消化HCG抗体的应用
以温敏性材料N-羟基琥珀酰亚胺活化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)为载体制备固定化木瓜蛋白酶,对其酶学性质进行了研究.结果表明:固定化酶的适pH值为7.5,适温度为65 ℃,米氏常数为2.72 mg/mL;经过24次温敏循环操作,剩余相对活力86.6％；在4℃条件下放置60d,剩余相对活力为71.5％.与游离酶相比,固定化酶pH值稳定性、热稳定性、操作稳定性和储存稳定性都有显著提高.将此固定化酶应用于HCG单克隆抗体消化,与纤维素固定化酶相比,水解能力更强,更适合于大分子的酶解,特别是抗体片段的制备.
