地龙脱氧核糖核酸酶的部分性质研究及作用初探

目的 研究地龙体内两种新型脱氧核糖核酸酶(LDs)的部分生化性质,并对其作用进行初步探索.方法 采用Sephacryl-200柱层析、毛细管等电聚焦电泳法、琼脂糖凝胶电泳等方法.结果 初步得出LD1、LD2分子量为126、62 kDa;确定了等电点分别为6.12、6.05.LD1、LD2对细菌质粒DNA、λDNA均有分解作用.结论 地龙中的LDs是一种新型的脱氧核糖核酸酶.明确LDs的分子量、等电点有助于优化LDs的提取工艺以及LDs的进一步研究.对细菌质粒DNA、λDNA的降解提示LDs有可能对抗细菌的耐药性.

系统性红斑狼疮患者血清脱氧核糖核酸酶活性检测的临床意义

检测系统性红斑狼疮(SLE)患者血清脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性,探讨其在判断SLE疾病活动及狼疮肾炎(LN)中的临床意义.采集116例SLE患者、30例疾病对照者和30名健康体检者(对照组)的血清,用ELISA法定量检测血清DNase活性.结果表明:SLE患者血清DNase活性明显低于疾病对照组和健康对照组(P<0.01),且疾病活动期低于缓解期(P<0.01);DNase活性与SLE疾病活动程度呈负相关(P<0.01);狼疮肾炎组DNase活性低于SLE非狼疮肾炎组,两组比较有统计学意义(P<0.05).DNase活性下降可能是促进SLE及LN发生、发展的重要因素之一.血清DNase活性检测可用于判断SLE及其疾病活动程度的指标之一,同时也可作为判断LN的危险因素之一.

抗DNA酶B抗体检测对急性链球菌感染后肾小球肾炎的临床诊断价值

目的 评价抗DNA酶B抗体(anti-deoxyribonuclease B,ADNase B)在急性链球菌感染后肾小球肾炎(acute poststreptococcal glomemlonephritis,APSGN)诊断中的临床应用价值.方法 分别检测80例符合APSGN临床诊断患儿和50例近期无感染临床表现儿童的ADNase B、抗链球菌素O(anti-streptolysin O,ASO)滴度.同时记录APSGN患儿标本采集距前趋感染的时间及感染类型.58例APSGN患儿出院后,于前驱感染后2～6个月,再次取血检测ADNase B、ASO滴度.结果 APSGN病例组ADNase B阳性率(81.3%)显著高于ASO的阳性率(73.8%),P=0.008.二者联合检测阳性率达到90.0%.ADNase B ROC曲线下面积(0.90+0.04)显著大于ASO的曲线下面积(0.77±0.06).P=0.000.上感组及皮损组ADNase B阳性率(80.9%、83.3%)均高于ASO的阳性率(77.9%、50.0%),P＜0.05.距前驱感染2～6个月时复查患儿ADNase B及ASO,二者阳性率均有下降.但ADNase B阳性率(73.5%)明显高于ASO的阳性率(42.6%).P<0.01.各组联合检测阳性率均较单独检测明显提高.结论 ADNase B对于APSGN的诊断效能高于ASO.特别是对于前驱皮损感染及感染后2～6个月患儿的诊断优势更加明显.二者联合检测可明显提高阳性率.ADNase B对A族链球菌(group A streptococcus,GAS)感染相关疾病的诊断具有较高的临床应用价值.

糖尿病患者血浆D-二聚体水平与肾功能关系的临床研究

糖尿病的发病率在全球范围内正呈逐渐增高的趋势,已成为许多国家的常见病和多发病,其病死率已居肿瘤、心血管疾病之后的第3位.糖尿病的并发症可以累及各个系统,包括大血管和微血管的损害,如脑卒中、冠心病、视网膜病变和肾病等.糖尿病的并发症中,血栓性疾病尤其严重,其危害性大,致残致死率高.D-二聚体是交朕纤维蛋白(Fb)特异的降解产物,它的生成或增高反映了凝血和纤溶系统的激活,在各种血栓形成性疾病以及生理性高凝状态时均有升高.本研究旨在探讨D-二聚体与糖尿病,尤其是与糖尿病肾病的关系.

蚯蚓脱氧核糖核酸酶的底物特异性及降解产物的特性

目的 研究蚯蚓组织中一种新型脱氧核糖核酸酶(EWD)的底物特异性及降解产物的特性.方法 采用ZOR-BAX-Oligo柱-HPLC、琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法等技术,分析EWD对环状质粒DNA、线状λ-DNA、大肠杆菌基因组的降解作用,及对真核鲱精DNA、单链DNA等的降解中间产物和终产物的特性,并观察其对RNA的降解作用.结果 EWD对这几种DNA均有降解作用,降解产物为较均一的、小于18bp的寡核苷酸.但EWD对RNA无降解作用.结论 EWD为脱氧核糖核酸内切酶类.

蚯蚓组织脱氧核糖核酸酶EWD3的生化性质

目的 研究赤子爱胜蚓组织中1种脱氧核糖核酸酶(EWD3)的主要生化性质.方法 采用Lowry法测定酶的蛋白含量,SDS-PAGE和MALDI-TOF方法测定相对分子质量,毛细管等点聚焦电泳法测定等电点,并测定EWD3酶的酸、碱稳定性、温度稳定性、激动剂和抑制剂对酶活性的影响及酶促反应米氏常数Km值.结果 EWD3酶的蛋白含量为2.1 mg/ml,相对分子质量为63 460,等电点为6.20,Km值为1.52 mg/ml,适pH值为4.4～5.2,不耐高温.Mg2+、Ca2+、Mn2+、10和20 mmnol/L EDTA对EWD3酶活性有抑制作用.这些参数与已发现的各种DNases相比有明显差异.结论 蚯蚓组织中已发现的脱氧核糖核酸酶EWD3具有特殊的酶学特征.

杨树菇中一种脱氧核糖核酸酶的纯化及其性质

目的 分离纯化杨树菇子实体中脱氧核糖核酸酶,并对其性质进行分析.方法 通过80%饱和(NH4)2SO4沉淀、Blue Sepharose 6 Fast Flow、DEAE-Sepharose Fast Flow和SP-Sepharose Fast Flow层析方法 ,从杨树菇子实体中分离纯化一种脱氧核糖核酸酶.SDS-PAGE和活性SDS-PAGE测定相对分子质量,采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法分析其酶学性质,并检测pH、温度、Mg2+和EDTA浓度对酶活性的影响.结果 经纯化得到了一种脱氧核糖核酸酶,其相对分子质量为31 000.该酶对超螺旋质粒DNA、λDNA、ssDNA和dsDNA均具有降解活性,对dsDNA的降解活性略高于ssDNA,且酶活性依赖于二价金属阳离子.该酶的适pH值范围为7.5～9.6,50℃时相对酶活性高.结论从杨树菇子实体中纯化的脱氧核糖核酸酶属于一种非限制性脱氧核糖核酸内切酶.

抗DNA酶B在小儿急性肾小球肾炎及风湿热诊断中的应用

脱氧核糖核酸酶B(抗DNA酶B)为A组溶血性链球菌(GAS)感染所致的急性肾小球肾炎(AGN)及风湿热(RF)的病原学诊断检测方法,在抗体动力学方面,其高峰期在4周～6周,抗体高滴度状态可持续3月～6月.而国内通常用的抗溶血素(ASO)因其高峰期在3周～5周,2个月大多降到正常,故其阳性率偏低.我们采用抗DNA酶B微量法及ASO对照对患儿进行GAS感染测定,现报道如下.

血清高迁移率组蛋白B1、可溶性晚期糖基化终末产物受体、脱氧核糖核酸酶与TACE早期疗效相关性研究

目的 探讨原发性肝癌患者血清高迁移率组蛋白B1(HMGBl)、人可溶性晚期糖基化终末产物(sRAGE)、脱氧核糖核酸酶(DNase)对TACE近期疗效的评估价值.方法 对收住的42例患者(共计56次TACE治疗)分别在TACE术前、术后24h采集外周静脉血标本,用ELISA法检测外周血清中HMGB1、sRAGE、DNase的表达水平.根据mRECIST标准进行TACE术后疗效评估,将完全缓解+部分缓解+疾病稳定的病例归为获益组,疾病进展者归为无效组.比较TACE术前、术后,获益组及无效组之间的血清HMGB1、sRAGE、Dnase的表达水平,并进行统计学分析.结果 TACE术前与术后24 h血清HMGB1、sRAGE、DNase表达水平比较差异有显著统计学意义(P=0.003,P=000,P=0.001),且术后较术前呈升高趋势.56例次TACE中,24例次为稳定(SD),2例次部分缓解(PR),30例次为肿瘤进展(PD),将SD和PR患者归为获益组(n=26),PD患者为无效组(n=30).在TACE术前,获益组与无效组血清HMGB1、DNase表达水平比较差异无统计意义(P=0.395,P=0.091);在TACE术后24 h,血清HMGB1、DNase在获益组和无效组对比差异也无统计学意义(P=0.354,P=0.182).而sRAGE在获益组与无效组之间的表达水平在术前差异无统计学意义(P=0.143),而在术后24h,两组间sRAGE表达水平差异有统计学意义(P=0.030).结论 ①TACE术后血清HMGB1、sRAGE、DNase表达水平较术前升高;②中晚期肝癌患者外周血清中sRAGE与TACE疗效相关,可以作为TACE治疗肝癌疗效早期评估的指标.

一种新型蚯蚓脱氧核糖核酸酶酶学性质的研究

目的 研究蚯蚓组织中1种新型脱氧核糖核酸酶(EWD1)的主要酶学性质.方法 用S DS-PAGE凝胶电泳、质谱分析、毛细管等点聚焦电泳法和酶活性测定等方法.结果 EWD1的相对分子质量约为157 000.Mn2+、Ca2+是该酶的抑制剂,Mg2+对酶的活性基本上没有影响.该酶的适温度为37℃,适pH值为 5.2,等电点为6.12.以小牛胸腺DNA为底物,测得Km为1.58 mg/mL,Vmax为5.36 mg/(m L·min).结论 蚯蚓组织中发现的此种脱氧核糖核酸酶EWD 1具有特殊的酶学性质,明显区别于已知的脱氧核糖核酸酶类.

军团菌胞外酶研究进展

军团菌作为一种细菌性呼吸道传染病，为流行性肺炎的重要病因之一，从其被发现以来[1]，人类就一直致力研究其致病机理，以期寻找出有效防治措施。军团菌经呼吸道吸入肺泡后，侵入人的巨噬细胞不被杀灭且能在其中繁殖[2～6]。因此，军团菌与巨噬细胞之间的相互作用，成为研究军团菌致病机制的焦点之一，而该菌胞外蛋白作为巨噬细胞首先接触的抗原，更引起许多研究者的兴趣。本文试图就多年来对军团菌胞外酶的研究情况作一回顾。嗜肺军团菌的所有菌株都产生可检测得到的细胞外蛋白酶、脂酶、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶，β－丙酰氨酶和微弱的淀粉酶活性磷脂酶C，军团菌溶素，磷酸酶，蛋白激酶等也有文献报导[7-11]。1 蛋白酶(PROTEASE)许多研究表明[12～16]’嗜肺军团中培养上清液存在蛋白裂解活性物质或纯化出蛋白酶，注射豚鼠皮下，可引起出血性和坏死性的病理，较纯的嗜肺军团菌蛋白酶经鼻内或气管投入后，豚鼠肺的病理表现与实验性军团肺炎极为相似。Willian等[17]发现，在肺泡损伤有关部位，发现蛋白酶和大量细菌。用胶体金标记的抗蛋白酶抗体显示，蛋白酶主要局限在吞噬细胞内，呈弥散分布〔18〕。以上的研究提示，在军团菌自然感染中产生的这种蛋白酶，对引起肺泡组织细胞的裂解和损伤起着主要的作用。大量存在于嗜肺军团菌培养上清液中的蛋白酶被称之为嗜肺军团菌的主要分泌蛋白(MSP)，因Zn2+能恢复其被EDTA所抑制的活性，故又称之为含锌离子金属蛋白酶〔19,20〕。

脱氧核糖核酸酶在呼吸系统感染中的应用进展

脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase)是一种特异性DNA水解酶,在 Ca2+和Mg2+等二价金属离子存在的中性pH值条件下水解双链DNA,使DNA碎片化.几十年来,DNase常被应用于囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)患者,用于分解脓液中游离的未解螺旋DNA,以增强的痰液清除率.痰栓导致的肺不张患者,经常规抗感染、雾化吸入等治疗仍无法好转的,DNase 的局部灌注治疗也显示了较好的临床疗效.此外,一些研究亦显示肺炎旁胸腔积液尤其是复杂肺炎旁胸腔积液(parapneumonic effusion,PPE)患者,局部注射DNase是安全及有效的一种治疗方法.

地龙祛痰组份的纯化效率及其溶菌作用

目的 了解地龙祛痰组份的纯化效率,检测其对不同类型核酸的降解作用、溶菌酶活性以及EDTA对其溶菌活性的影响.方法 酸、碱变性沉淀及丙酮沉淀法制备祛痰组份粗提物,Bradford法检测蛋白含量,Yasuda法检测比活力,紫外光吸收法、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测对不同类型核酸的降解作用,比浊法检测地龙祛痰组份对溶壁微球菌的降解作用,将所得数据用多因素方差分析,比较EDTA对酶比活力的影响.结果 1000g鲜地龙纯化出4.12g粗提物,比活力纯化倍数为69.对环状、线状双链和单链DNA均有降解作用.对RNA无降解作用.含和不合EDTA的反应体系中,溶菌酶样比活力分别为400U/mg和410U/mg;EDTA对溶菌酶样作用没有差异(P＞0.05).结论 地龙祛痰组份纯化后蛋白含量减少,脱氧核糖核酸酶样活性提高,对不同类型的DNA具有降解作用,不能降RNA,具有溶菌酶样活性.EDTA不影响其溶菌酶样活性.

重组人脱氧核糖核酸酶抑制冻存复苏后脐血造血干细胞凝集

目的 探讨重组人脱氧核糖核酸酶(rhDNase)抑制冻存复苏脐血干细胞微凝集及凝块形成的作用.方法 分别将冻存2周、1个月、2个月、半年、1年及2年的脐血干细胞进行复苏,然后用不同浓度(终浓度分别为0、1、5、8、10、20及50 U/ml)的rhDNase缓冲液进行洗涤,在显微镜下观察凝块及微凝集的形成情况.采用免疫磁珠法分选CD34+细胞,分别经10 U/ml和50 U/ml的rhDNase缓冲液处理,采用免疫荧光直接四色标记和流式细胞术检测CD34+细胞表面CD54、CD11a、CD62L的表达;采用自动血细胞分析仪测定细胞回收率,台盼蓝着色法判断细胞活性,分析10 U/mlrhDNase缓冲液洗涤对复苏脐血细胞回收率、细胞活性及凝集率的影响.结果 复苏的脐血干细胞经0、1、5、8 U/ml的rhDNase缓冲液洗涤后仍有不同程度的凝集;经浓度为10、20、50 U/ml的rhDNase缓冲液处理后,没有出现凝块和微凝集.经10 U/ml及50 U/ml的rhDNase处理后,CD34+细胞表面粘附分子的表达无明显改变,与阴性对照相比,差异无统计学意义.经10 U/ml的rhDNase缓冲液洗涤后,干细胞回收率有所下降(P＜0.05),但对细胞活性无明显影响,未经洗涤的脐血均有凝集,而洗后均无凝集.结论 浓度为10 U/ml的rhDNase足以抑制复苏后脐血干细胞凝块和微凝集的形成,且不影响脐血干细胞的活性及粘附分子的表达.

抗DNA酶B和ASO联合检测在小儿急性肾小球肾炎诊断中的应用

目的探讨抗DNA酶B和ASO联合检测在小儿急性肾小球肾炎(AGN)中的应用价值.方法采用终点散射比浊法分别测定52例AGN患者的抗DNA酶B和ASO,同时以48例健康体检者为对照组.结果抗DNA酶B联合ASO测定可使AGN患者的阳性检出率由单项ASO测定的63.5%提高至88.5%,差异具有显著性(P＜0.05).结论抗DNA酶B和ASO联合测定对临床提高AGN诊断率具有重要价值.

脱氧核糖核酸酶抑制肺炎链球菌青霉素耐药基因转移的研究

目的 探讨脱氧核糖核酸酶(DNase)抑制肺炎链球菌(SP)青霉素耐药基因转移的作用.方法 提取青霉素耐药SP(PRSP)的DNA,并进行相关试验鉴定;用PRSP的DNA转化SP标准菌株,转化后进行Optochin和苯唑西林药敏试验;用DNase抑制PRSP的DNA转化SP标准菌株,抑制转化后进行Optochin和苯唑西林药敏试验.结果 提取DNA阶段,Optochin试验均显示阳性,苯唑西林药敏试验均显示青霉素不敏感,相关DNA检测均阳性;转化实验后,实验组和对照组的Optochin试验均显示阳性,实验组和对照组的苯唑西林药敏纸片抑菌环直径分别为(23.3±2.2)mm和(33.5±3.0)mm,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01);抑制转化实验后,实验组和对照组的Optochin试验均显示阳性,实验组和对照组的苯唑西林药敏纸片抑菌环直径分别为(29.6±4.7)mm和(17.6±9.4)mm,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 DNase具有抑制SP青霉素耐药基因转移的作用.

重组人脱氧核糖核酸酶预防冻存复苏后脐血造血干细胞凝集

自1988年Gluckman等[1]用脐血移植治疗Fanconi贫血患儿并获得成功后,脐血已经作为一种重要的可替代的造血干细胞来源广泛应用于治疗某些恶性及非恶性血液病、某些遗传病、重症免疫缺陷等疾病[1～3].脐血库的建立日益受到重视,如何经济、高效地体外保存造血干细胞,使干细胞的损伤降到低限度,提高脐带血干细胞移植的成功率,一直是人们关注的焦点.许多研究证明脐带血保存前的浓缩,是提高临床移植应用效率的关键,但是复苏过程会造成干细胞的损伤,尤其是冷冻和复苏时粒细胞受损释放的DNA及细胞碎片易形成凝块和微凝集导致干细胞损失从而影响移植效果.Eichler等[4]报道重组人脱氧核糖核酸酶(rhDNase)能特异性裂解DNA.笔者采用不同浓度的rhDNase处理复苏后的脐血干细胞,观察其抑制凝集的效果,并且运用免疫荧光直接四色标记和流式细胞术检测不同浓度rhDNase对相关黏附分子表达的影响,现报道如下.

血清脱氧核糖核酸酶I活性作为急性心肌梗死新早期标记物的诊断价值