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漆酶在药物生产中的应用进展
漆酶是一种底物范围十分广泛的多酚氧化酶,可催化多种有机物发生氧化反应.本文综述了漆酶在中药有效成分提取及新型有机药物合成中的应用.
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在大肠杆菌中表达重组CotA蛋白的培养条件优化
为了提高大肠杆菌对重组CotA蛋白的表达量,对本实验室构建的含CotA基因表达载体的工程菌株的培养条件进行优化.通过单因素试验及正交试验L18(37)优化了产酶的佳培养条件为:摇床转速为180 r/min、装液量为100 mL /500 mL锥形瓶、接种量为5%、诱导温度25℃、诱导剂IPTG浓度为1.0 mmol/L、诱导时间为12 h,以及加诱导剂时菌体OD600值为1.0,其中诱导剂IPTG浓度和菌体OD600值对CotA蛋白表达影响显著.
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多酚氧化酶在食品和中药领域中的应用
多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)是自然界中分布极为广泛的一种金属蛋白酶,普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中,甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的存在.本文通过对多酚氧化酶广义上所分三大类的了解,一一阐述了多酚氧化酶这三大类别分别在食品和中药领域中的应用.
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泰山赤灵芝复合降解酶提取白花丹参须根有效成分的研究
目的:研究泰山赤灵芝复合降解酶在白花丹参须根有效成分提取中的应用.方法:采用木质纤维素复合降解酶来提取丹参须根中的有效成分,通过正交试验法优化酶解参数.结果:利用优化酶解工艺所得到的丹参须根提取液中总丹参酮和总丹酚酸的提取率可达11.923％,12.465％,比常规非酶法提取提高了62.794％,56.086％.结论:采用木质纤维素复合降解酶酶解法可以充分提取出丹参须根中的有效成分,为中药废弃物的再次利用提供了一条新途径.
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食用菌病毒脱毒方法的比较
应用dsRNA技术从平菇天达300(Pleurotus ostreatusTD300)菌丝中提取到4条dsRNA条带,大小分别是8.2、2.5、2.1和1.1kb.采用菌丝尖端脱毒法、原生质体再生法、冷冻真空干燥法和单孢杂交法进行脱毒,各得到一株脱毒菌株,分别是HTC8、PR15、FL01和SSH11.脱毒菌株HTC8仅残留有低含量的8.2kb dsRNA,PR15和SSH11完全脱去dsRNA,而FL01仍残留有低浓度的8.2kb和2.5 kb dsRNA.该4株脱毒菌株的菌丝生长速度和漆酶活力均比出发菌种有不同程度的提高,尤其是HTC8和PR15,菌丝生长速度比出发菌种分别提高22.73%和18.18%.漆酶活力比出发菌种分别提高145.83%和134.38%.综合比较此4种脱毒方法,菌丝尖端脱毒法和原生质体再生脱毒法比冷冻真空干燥法和单孢杂交法脱毒效果好,制备脱毒菌株用时短、效率高.
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漆酶-介质体系中介质的研究进展及应用
漆酶是一种多铜氧化酶,利用铜离子特性催化氧化底物,消耗氧分子终生成水,其特征底物为酚类、芳胺类等物质.由于漆酶氧化电势较低、空间阻碍等因素限制了其应用范围.后来研究者发现,在漆酶中加入一类小分子物质在一定程度上拓宽了其作用底物范畴,且提高了其催化效率.加入的小分子称为“介质”,漆酶与介质共同构成漆酶-介质体系(LMS).目前,LMS在环保、纺织、造纸等领域显示出潜在的应用价值.本文将对近年来LMS中介质的结构特点、作用方式、催化机制及其应用等多方面的研究进展进行综述.
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桑黄菌发酵过程中酶活性的变化
目的 研究桑黄菌发酵过程中酶活性的变化及其和胞外多糖量的关系.方法 在发酵过程中测定原始菌株和变异菌株的羧甲基纤维素酶、滤纸酶、木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)活性变化及培养基中胞外多糖量变化.结果 2菌株的羧甲基纤维素酶和滤纸酶的活性变化呈单峰曲线,分别在第4天和第6天达到峰值;原始菌株和变异菌株的LiP、锰过氧化物酶和漆酶活性的变化呈双峰曲线,且原始菌株和变异菌株LiP的酶促反应米氏常数(Km)分别为25.96、27.07 μg/mL; MnP的K(m分别为13.28、13.49mmol/mL; Lac的Km分别为0.12、0.21 mmol/mL;培养基中多糖量前期快速下降,10d后趋于稳定.结论 桑黄菌发酵时能产生较全面的分解木质素和纤维素的酶系统,原始菌株和变异菌株产生的LiP和MnP为同种酶,Lac为同功酶.桑黄菌胞外酶活性变化和培养基中胞外多糖量变化有一定关系.
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内生镰刀菌漆酶辅助提取槐米中总黄酮的研究
目的 研究内生真菌胞外漆酶在槐米总黄酮提取中的应用.方法 内生镰刀菌在起始pH 7.0的综合马铃薯培养基中,20℃下摇瓶培养6 d,具有较高的漆酶活力(36.1 U/mL).槐米干粉投入真菌发酵液中进行酶解处理,比较酶料比、酶解温度、酶解时间和酶解液pH值对槐米总黄酮提取率的影响.结果 槐米干粉以酶料比40:1加入粗酶液中,在pH 7.0、20℃下酶解处理1 h后,总黄酮提取率可达11.4%.比常规提取法提高了28.7%.结论 内生菌漆酶辅助提取法为槐米总黄酮提取的可行新方法.
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漆酶-介质-有机磷酸酯毒物三元复合物的分子作用机制
[目的]构建漆酶-介质-有机磷酸酯毒物三元复合物(laccase-meidator-organophosphate poison ternary complex,LMO)模型,在分子水平探究漆酶-介质体系(laccase-mediator system,LMS)对有机磷酸酯毒物(organophosphate poisons,OPs)的降解机制.[方法]基于分子对接建立LMO模型,通过分子动力学模拟,考察三元体系稳定性和动态研究LMS对OPs的降解机制.[结果]在LMO中,介质结合于漆酶活性位点内部,与Asp206产生氢键作用,与中性氨基酸产生疏水作用和π-π堆积作用;介质首先生成介质中间体,进而与结合于漆酶活性位点外缘的OPs发生相互作用;分子动力学模拟发现,三元复合物达到稳定时漆酶构象发生了突变,电子受体His458远离了Ⅰ型铜离子(type-1 copper ions,T1Cu).[结论]LMS对OPs的降解是通过漆酶的疏水作用及介质中间体完成的;LMO作用过程中漆酶的构象变化利于促进漆酶与介质间的电子传递,更有利于OPs的降解.
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漆酶纯化及部分性质研究
目的:研究三色革裥菌(Lenzites tricolor)所产漆酶的纯化及其部分酶学特性.方法:利用盐析、层析等方法纯化漆酶;测定漆酶的活力及不同金属离子对其的影响.结果:培养第6d时生长快,漆酶活力强.层析缓冲体系应选择:缓冲液Na2HPO4-C6H8O7;pH值5.0;反荷离子强度范围0.4~0.5 mol/L较合适.漆酶的Km值约为60.4 μmol/L.Na+ 、Ba2+对漆酶活力无明显影响,Cu2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+对漆酶有不同的抑制作用,而Ca2+对漆酶有明显的激活作用.经75% (NH4)2SO4盐析、Sephadex G-150层析后得到较好的纯化漆酶.结论:三色革裥菌所产漆酶经盐析、层析得到较好的纯化效果,不同金属离子对漆酶活力具有不同的影响.
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催化菘蓝活性木脂素生物合成的漆酶基因家族生物信息学分析
目的 从转录组数据库中发掘并分析了参与菘蓝落叶松脂素生物合成的关键合成酶之一——漆酶(laccase)的基因序列,并进行生物信息学分析,为以后的功能研究提供可靠依据.方法 利用生物信息学分析软件,从已有菘蓝转录组数据库中寻找漆酶并分析其各项特征,主要包括理化性质、同源性分析、蛋白结构分析和茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后表达特征等分析.结果 菘蓝漆酶基因(Iilacs)中的Iilac3和Iilac5在MeJA诱导下的转录水平与药效成分的积累相一致,推测其可能为参与落叶松脂素合成的潜在的功能基因.结论 通过对菘蓝漆酶进行详细的生物信息学分析,可为今后功能蛋白的筛选和进一步研究其生理生化机制和结构特征打下坚实的基础.
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松杉灵芝漆酶的分离纯化及酶学性质研究
采用硫酸铵分级沉淀、透析和DEAE-sepharose阴离子交换柱层析对松杉灵芝漆酶进行分离纯化并研究其部分酶学性质.结果表明,纯化漆酶比活力为55.438 7 U/mg,回收率为31.7％,相对分子质量约为52 000.该酶催化底物ABTS的适反应温度和适反应pH值分别为40℃和4.0,在30～40℃及pH 4.0～5.0范围内具有良好的稳定性.以ABTS为底物的米氏常数K为0.909 mmol/L,vm.为454.5 mmol/(Lmin).K+和Fe3+对漆酶具有明显的激活作用;NH+4、Cu2+对漆酶活性影响不大;Fe2+能完全抑制漆酶的活性.
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产漆酶真菌筛选及其固态发酵条件的初步研究
目的筛选产漆酶真菌,优化固态发酵培养基组成,研究粗酶的酶学性质.方法平板筛选获得菌株,通过测定漆酶活性优化培养基的组成.结果获得了固态发酵条件下产漆酶活性较高的菌株.优化后培养基的组成:豆粕和木屑比例1:1,木糖0.5%,酒石酸铵2.0%,培养基含水量65%.漆酶适温度60℃,低于50℃时漆酶较稳定,适pH 3.5,pH 6.5～9.0之间漆酶稳定性较好.结论得到了产漆酶活性较高的菌株,培养基优化后漆酶活性提高7倍.
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碳源氮源对杂色云芝产漆酶的影响
目的：研究碳源氮源对杂色云芝合成漆酶的影响。方法以本实验室保藏的高漆酶合成菌株杂色云芝为研究对象，首先比较不同培养方式对该菌株漆酶合成的影响，然后通过单因素实验和响应面分析实验研究了碳源和氮源对漆酶合成的影响。结果摇床振荡培养产酶效果优于静止培养，在不同的碳源与氮源中，蔗糖为该菌株产漆酶的合适碳源，合适的氮源是酵母粉，培养基中碳氮源的佳含量为：蔗糖10．2g/L ，酵母粉7．2g/L。结论碳源和氮源对杂色云芝发酵生产漆酶有很大的影响，响应面法对杂色云芝产液态发酵产漆酶条件的优化是可行的。
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双向固体发酵对川芎活血化淤的增效作用
目的 通过双向固体发酵技术研制具有活血化淤作用的灵芎菌质.方法 经过川芎平板初筛法和川芎袋料复筛法,获得能在川芎基质上生长的优势菌株;进一步通过测定小鼠凝血时间和出血时间,以及大分子右旋糖酐所致的血淤模型中小鼠耳伊文斯蓝的表达量,确定发酵得到的灵芎菌质的活血化淤作用,同时用ABTS法测定了菌株生长时期漆酶的活性.结果 复筛得到三株能够在川芎基质上生长良好的灵芝菌株,其中ZL-13灵芎菌质具有较好的活血化淤效果,而且作用显著优于中药材川芎;此外,菌株的漆酶活性越高,发酵形成的菌质活血化淤效果越好.结论 通过双向固体发酵技术得到的灵芎菌质能显著提高川芎的活血化瘀效果.
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不同栽培基质对灵芝基质营养物质及胞外酶活的影响
目的 研究不同栽培基质对袋料栽培灵芝生长过程中基质内营养物质及菌丝胞外酶活的影响.方法 分别选取棉籽壳、玉米芯和杂木屑作为栽培基质对灵芝进行熟料袋式栽培,同时研究灵芝不同生长时期基质中各部位总糖、还原糖、水溶性蛋白和游离氨基酸含量的变化规律;以及不同时期基质中各部位漆酶、锰过氧化物酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、滤纸酶和酸性蛋白酶的活力变化规律.结果 玉米芯中的糖类和蛋白类物质含量及胞外酶活力高于棉籽壳和杂木屑,其中玉米芯对基质中总糖含量和木质素降解酶系的影响大.结论 在袋料栽培灵芝过程中,不同栽培基质对灵芝基质中营养物质的含量和菌丝胞外酶活力大小有明显影响,其中玉米芯基质为明显.
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灵芝属不同菌种漆酶活性的比较
目的:初步探索灵芝属不同菌种漆酶活性与其生长的相关性,筛选出高产漆酶的菌种.方法:利用PDA固体培养基方式,采用ABTS+法和硫酸-苯酚法分别对漆酶活性和多糖含量进行测定.结果:有柄树舌前期生长较快,漆酶活性第4天达到大(1 476.64 U/g),为甜灵芝大值的11.37倍,综合分析后优势显著;信州灵芝多糖含量较低;灵芝S3生长速度平缓,多糖含量居中.结论:灵芝属不同菌种生长速度存在差异,与漆酶活性存在一定的相关性,且有柄树舌可作为漆酶高产的出发菌种.
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新型隐球菌毒力相关因子及其研究进展
新型隐球菌是一种重要的致病性真菌,它主要引起细胞免疫功能低下的人群感染.近年来,由于器官移植术的广泛开展、免疫抑制剂的广泛应用以及艾滋病(AIDS)患者的不断增加,新型隐球菌引起的感染日益增多.新型隐球菌的毒力因子主要包括多糖荚膜、黑色素生成、表达漆酶和37℃时具有生长能力等.深入研究这些毒力因子有助于了解其致病机制,为今后隐球菌感染的诊断及治疗提供新的思路.为此本文对上述毒力因子及其研究进展作一综述.
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灰色葡萄孢霉产漆酶性质的研究及其对白藜芦醇的催化
目的 研究灰色葡萄孢霉在生长过程中合成的一种漆酶的部分酶学性质,该漆酶能催化白藜芦醇聚合生成其脱氯二聚体viniferin,此二聚体具有比白藜芦醇更高的生物学活性.方法 通过培养灰色葡萄孢霉获得该漆酶的粗酶液,测定其适pH及温度,并用其对白藜芦醇进行催化.结果 该漆酶的适pH为4.9,适反应温度为26℃,对20 mg·L-1的白藜芦醇有较好的催化效果.结论 灰色葡萄孢霉在生长过程中合成的漆酶可以催化白藜芦醇而生成viniferin.
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真菌漆酶基因研究进展
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,也是木质索生物合成的关键酶之一,目前已发现多种生物能产生漆酶,包括植物、真菌、昆虫、细菌等.其中,以真菌中的白腐菌研究多.近年来,由于漆酶在生物漂白、农作物秸秆利用以及环境垃圾处理方面具有广阔的应用前景,漆酶研究越来越受到国际上的重视.同时,随着分子生物学相关技术的发展,漆酶研究已深入基因水平,已有多种漆酶基因获得克隆,一些漆酶基因也实现了异源表达.本文概述了真菌漆酶基因研究的新进展.
