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阴阳双补方及各拆方对H2O2致PC12细胞氧化损伤的保护作用与PLC-γ1-PKCα-PLD信号转导通路的关系
自由基(free radical,FR)是具有未配对电子的原子、原子团、分子或离子.人体内的氧自由基包括过氧化物离子O2-2、超氧化物离子O-3、H2O2等[1].研究发现,多种神经系统疾病及衰老都和自由基损伤密切相关[2].
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磷脂酶D在胞吞与胞吐中的作用
磷脂酶D(PHospholipase D，PLD)水解其主要底物磷脂酰胆碱是细胞信号转导的重要途径之一。大量研究表明PLD激活是受体介导的胞吞和胞吐过程中关键的一步。本文主要介绍PLD 在受体介导的胞吞和胞吐过程中的作用及作用机制的研究进展
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磷脂酶D参与胰岛素和收缩引起的Ⅰ型肌纤维葡萄糖跨膜转运的信号转导体系
目的:研究磷脂酶D(phospholipase D,PLD)是否参与胰岛素和收缩引起的I型肌纤维葡萄糖跨膜转运的信号转导体系.方法:利用PLD的抑制剂丁醇,观察其对胰岛素和肌肉收缩引起的I型肌纤维占大多数的离体大鼠比目鱼肌葡萄糖跨膜转运的影响,了解PLD在信号转导体系中的作用.用同位素双标法测定胰岛素或肌肉收缩引起的葡萄糖跨膜转运速率,同时观察收缩力总量和收缩输出量时间变化曲线.结果:同对照相比,丁醇可显著降低由胰岛素或肌肉收缩引起的肌细胞葡萄糖跨膜转运摄取速率(P<0.01),还明显影响肌肉的收缩力(P<0.01).结论:同在II型肌纤维中的作用一样,PDL也参与I型肌纤维中由胰岛素或肌肉收缩引起的肌细胞葡萄糖跨膜转运的信号转导系统.
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沙丁胺醇与色甘酸钠对大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒过程中磷脂酶D活性的影响
采用主动致敏的大鼠腹腔肥大细胞(RPMC)为实验材料,细胞脱颗粒以β-氨基己糖苷酶释放率为指标,细胞磷脂酶D(PLD)活性采用酶联化学发光法检测. 结果发现,卵白蛋白(4 mg*L-1)攻击主动致敏的RPMC 120 s后,细胞PLD活性与β-氨基己糖苷酶释放率均明显增加,分别为对照组的2倍及8倍以上. 1%正丁醇,10 mmol*L-1 2,3-二磷酸甘油酸能显著抑制PLD活性,且使PLD活性及细胞β-氨基己糖苷酶释放率均降低到对照水平. Wortmannin, 300 nmol*L-1能显著抑制PLD活性,并减少细胞β-氨基己糖苷酶释放. 1,10 μmol*L-1的沙丁胺醇与色甘酸钠均能部分抑制PLD活性,并减少细胞β-氨基己糖苷酶的释放. 结果表明, PLD在主动致敏的RPMC脱颗粒过程中起一定作用;沙丁胺醇(1,10 μmol*L-1),色甘酸钠(1,10 μmol*L-1)抑制主动致敏的RPMC脱颗粒的作用机理与抑制PLD有关.
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血管加压素1a与血管加压素2受体在精氨加压素调节缺氧血管平滑肌细胞蛋白激酶C表达中的作用
目的 观察血管加压素1a(V1a)受体与V2受体拮抗剂对精氨加压素(AVP)调节缺氧血管平滑肌细胞(VSMC) 蛋白激酶C(PKC)α, δ和ε亚型表达的影响,以及磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)和磷脂酶A2(PLA2)活性的变化.方法 缺氧培养大鼠肠系膜上动脉VSMC,采用Western蛋白印迹法检测PKC α, δ和ε亚型蛋白表达;采用酶偶联荧光分析法测定PLC和PLD的活性,酸碱滴定法检测PLA2的活性.结果 缺氧处理1.5 h,VSMC胞膜PKC-α和ε亚型蛋白表达量明显升高,AVP进一步升高胞膜PKC-α和ε的表达.V1a受体拮抗剂d(CH2)5[Tyr2(Me)]AVP预处理可明显拮抗AVP诱导的胞膜PKC α和ε亚型蛋白表达升高,同时也明显拮抗AVP诱导的缺氧VSMC中PLC和PLD活性升高.而V2受体拮抗剂d(CH2)[d-Ile2Abu4]AVP对缺氧诱导的胞膜PKC-α和ε表达增加和VSMC中PLC和PLD活性升高无明显作用.结论 AVP诱导PKC激活的机制可能与V1a受体介导的PLC/PLD途径有关,而V2受体在这一信号传导途径中可能并不起主要作用.
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G12亚型G蛋白对M3乙酰胆碱受体介导的磷脂酶D调控
目的:阐明何种Gα亚型蛋白偶联M3乙酰胆碱受体(M3 mAChR)并介导PLD的激活.方法:将带有Gαq、Gα12及Gα13基因的质粒转染入HEK293细胞,在细胞内过度表达,用免疫杂交检测相应的表达蛋白,并测定胞内M3 mAChR介导的PLD及PLC活性.结果:Gα12、Gα13亚型野生型及功能增强型蛋白的过度表达,导致胞内M3 mAChR介导的PLD活性明显升高(P＜0.001);而过度表达Gα12、Gα13功能缺陷型蛋白,则使胞内M3 mAChR介导的PLD活性明显降低(P＜0.001);但Gαq野生型及功能增强型蛋白的过度表达仅影响胞内PLC活性,对M3 mAChR介导的PLD激活没有影响.结论:M3 mAChR介导的胞内PLD激活极有可能是Gα12、Gα13而不是Gαq亚型G蛋白.
关键词： 受体 胆碱能 磷脂酶D GTP结合蛋白质α亚单位 G12-G13 -
李斯特菌侵染Vero细胞诱发磷脂酶D活性的变化
目的 观察在李斯特菌侵染下Vero细胞内磷脂酶D(PLD)活性的变化,为研究PLD在李斯特菌内化侵入Vero细胞过程中的具体激活机制及功能提供一定的理论基础.方法 将李斯特菌以不同侵染比(MOI,细菌数:细胞数)及不同侵染时间刺激Vero细胞,应用侵染实验和PLD活性测定方法观察李斯特菌侵染量及Vero细胞内PLD活性的变化.结果 当MOI为100:1时李斯特菌侵染量为(99.0±2.6)个,当MOI增加到200:1、400:1时,李斯特菌侵染量分别增加到(150.0±2.6)个和(220.0±1.0)个,并且当MOI值为200:1和400:1时与Vero细胞内基础活性相比,PLD活性均升高近2倍(P<0.05).当侵染时间为30 min时,李斯特菌的侵染量为(102.0±3.0)个,当侵染时间增加到60 min和90 min时,李斯特菌侵染量分别增加到(185.0±1.7)个和(346.0±4.6)个.李斯特菌侵染15 min后,与Vero细胞内PLD基础活性相比升高了大约160%(P<0.05);随着刺激时间的延长,PLD的活性随之升高.结论 建立了李斯特菌内化侵入Vero细胞的模型,证实李斯特菌内化侵入Vero细胞对其吞噬的过程中确实伴有PLD的激活.
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糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D与2型糖尿病
糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI-PLD)是目前在体内发现的唯一能水解糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白的磷脂酶,可调节锚定蛋白的表达和生理功能.近年研究发现胰岛β细胞可合成与分泌GPI-PLD,GPI-PLD不仅具有模拟胰岛素的作用,而且可在体外抑制淀粉样蛋白原纤维的形成,改善糖尿病症状;此外,GPI-PLD分泌受胰岛素分泌的影响,在胰岛素抵抗状态下,GPI-PLD分泌也相应地会在增加后终减少.这些研究结果均提示GPI-PLD与2型糖尿病的发病可能有着密切关联.
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磷脂酶D与糖尿病并发症
磷脂酶D是一类主要以磷脂酰胆碱为底物的膜脂水解酶，可被多种刺激因素所激活，产生系列胞内信号分子，经蛋白激酶C或非蛋白激酶C途径发挥细胞功能。本文主要介绍了磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D在糖尿病中性粒细胞和心脏、血管、肾脏、神经组织细胞中的酶活性改变，及其引起糖尿病各种并发症改变的信号传导途径，以探讨磷脂酶D通路在糖尿病并发症发病机理中可能存在的作用。
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磷脂酶D与肿瘤的关系
磷脂酶D(PLD)是一种重要的信号转导分子,具有水解磷脂酰胆碱(PC)的能力.在细胞内,PLD的直接或者间接水解产物磷脂酸(PA)及甘油二酯(DAG)均是重要的脂质第二信使,在多条信号转导通路中都涉及PLD的活化.在许多肿瘤组织中,PLD的活性异常升高,大量的研究表明PLD与肿瘤的关系密切.
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沉默NF-κB基因对缺氧胃癌细胞增殖的影响及其机制
目的:探讨通过RNA干扰技术沉默核因子-KB(nuclear factor-κB,NF-κB)基因对缺氧胃癌SGC-7901细胞增殖的影响及其可能的机制.方法:将沉默NF-κB基因的重组载体pcDNATM 6.2-GW/EmGFPmiR-NF-κB转染SGC-7901细胞,并筛选稳定转染的细胞株.实验分为对照组(SGC-7901细胞在常氧状态下培养)、缺氧组(SGC-7901细胞在缺氧状态下培养)、干扰组(稳定转染pcDNATM 6.2-GW/EmGFPmiR-NF-κB后的SGC-7901细胞在常氧状态下培养)和联合组(稳定转染pcDNATM 6.2-GW/EmGFPmiR-NF-κB后的SGC-7901细胞在缺氧状态下培养).应用锥虫蓝染色法检测各组SGC-7901细胞的存活率,平板克隆形成实验和细胞倍增时间法检测各组SGC-7901细胞的增殖变化,蛋白质印迹法检测各组SGC-7901细胞中NF-κB、缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和磷脂酶D-1(phospholipase D-1,PLD-1)蛋白的表达水平.结果:重组载体pcDNATM 6.2-GW/EmGFPmiR-NF-κB成功转染至SGC-7901细胞,并筛选获得稳定转染的细胞株.与对照组比较,缺氧组SGC-7901细胞的存活率变化不明显,干扰组和联合组SGC-7901细胞的存活率降低(P＜0.05);缺氧组SGC-7901细胞的克隆形成数增加,细胞倍增时间缩短(P＜0.05);干扰组和联合组SGC-7901细胞的克隆形成数减少,细胞倍增时间延长(P＜0.05);干扰组SGC-7901细胞中NF-κB、HIF-1α和PLD-1蛋白的表达水平明显下调,缺氧组SGC-7901细胞中NF-κB、HIF-1α和PLD-1蛋白的表达水平明显上调(P＜0.05).与缺氧组比较,联合组SGC-7901细胞中NF-κB、HIF-1α和PLD-1蛋白的表达水平明显下调(P＜0.05).结论:缺氧条件下,SGC-7901细胞中HIF-1α与NF-κB可能存在相互关系,沉默NF-κ基因可降低HIF-1α和PLD-1的表达,从而抑制缺氧条件下胃癌SGC-7901细胞的增殖能力.
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革兰阴性菌磷脂酶D致病机制的研究进展
磷脂酶D (PLD)是致病因子的一种,通过多种机制帮助病原菌感染和复制,其有望成为治疗病原菌感染的新靶标.本文综述几种革兰阴性菌PLD致病机制的研究进展.
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链霉菌磷脂酶D的分离纯化及部分酶学性质
由链霉菌发酵所得的磷脂酶D经过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose 阴离子色谱、Source 30S阳离子色谱和Superdex 75凝胶过滤色谱分离纯化,相对分子质量约为57k.在55℃和pH 7.0时显示高相对酶活力.酶动力学参数Km和Vmax分别为254mmol/L和0.417μmol/min.
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siRNA干扰水通道蛋白3和磷脂酶D2表达对A431细胞株生长和凋亡的影响
目的 探讨水通道蛋白3(AQP3)和磷脂酶D2(PLD2)在人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431细胞增殖和凋亡中的作用.方法 针对AQP3和PLD2各设计3条siRNA,用脂质体转染法将siRNA导入A431细胞.用荧光定量PCR方法筛选出其中干扰效果佳的AQP3-siRNA和PLD2-siRNA,Western印迹法检测转染后AQP3和PLD2蛋白的表达水平.将A431细胞分为5组:正常培养组(不加任何处理),转染试剂组(加入转染试剂),阴性对照组(转染阴性对照siRNA),AQP3-siRNA组(转染AQP3-siRNA),PLD2-siRNA组(转染PLD2-siRNA).CCK8法检测AQP3和PLD2表达下调对A431细胞增殖的影响,膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭双染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 用脂质体转染法将siRNA导入A431细胞后,AQP3和PLD2的mRNA和蛋白表达均较阴性对照组明显下降.与阴性对照组比较,转染AQP3-siRNA后A431细胞增殖在24、48、72 h均受到明显抑制(t值分别为24.10、11.00、9.54,均P＜0.01);转染PLD2-siRNA后,A431细胞增殖同样在24、48、72 h均受到明显抑制(t值分别为30.47、7.02、8.73,均P＜0.01).与阴性对照组比较,转染AQP3-siRNA后,A431细胞凋亡在48 h和72 h均明显增加(t值分别为11.36、20.91,均P＜0.01);转染PLD2-siRNA后,A431细胞凋亡在72 h明显增加(t值为4.86,P＜0.05).结论 siRNA下调AQP3或PLD2表达可抑制A431细胞增殖,诱导A431细胞凋亡.
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含芳香酰基的磷脂酰胆碱的酶促水解
3种含芳香酰基的磷脂酰胆碱(PC)被磷脂酶A2(PLA2)和磷脂酶D(PLD)水解以制备相应的溶血磷脂和磷脂酸.两个酰基均为芳香酰基的PC能被Naja mossambica mossambica PLA2水解,但不能被猪胰PLA2水解;花生PLD、Streptomyces chromofuscus PLD能水解仅含一个芳香酰基(sn-1或sn-2位)的PC,但不能水解含两个芳香酰基的PC.这些结果表明酶的来源和酰基的结构对甘油磷脂的酶促水解反应有很大的影响.
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磷脂酶D在脂多糖及抗原引爆大鼠外周血白细胞中的作用
目的:探讨脂多糖(LPS)与卵白蛋白(OA)是否引爆大鼠外周血白细胞,致敏过程对大鼠外周血白细胞引爆的影响以及磷脂酶D在大鼠外周血白细胞引爆中的作用.方法:采用正常及主动致敏的大鼠外周血白细胞为实验材料,以LPS或抗原(OA)为引爆剂,fMLP为激动剂处理细胞,测定白细胞弹性蛋白酶释放和髓过氧化物酶(MPO)活性作为细胞激活指标,同时,用酶偶联比色法测定白细胞PLD活性.结果:LPS和fMLP共同处理正常大鼠外周血白细胞,引起弹性蛋白酶和MPO释放高于fMLP单独处理(P<0.05);OA和fMLP共同处理正常大鼠外周血白细胞,引起上述两种酶的释放与fMLP单独处理无明显差别.LPS和fMLP共同作用于致敏大鼠外周血白细胞,引起弹性蛋白酶和MPO释放与fMLP单独作用无明显差别;OA和fMLP共同作用于致敏大鼠外周血白细胞,引起上述两种酶的释放高于fMLP单独作用(P<0.05).正常大鼠中,PLD活性与弹性蛋白酶释放和MPO活性的相关系数,分别为0.51和0.73(P<0.01).致敏大鼠中,PLD活性与弹性蛋白酶释放和MPO活性的相关系数,分别为0.48(P<0.01)和0.37(P<0.05).结论:①LPS能引爆正常大鼠外周血白细胞.②特异性抗原OA能引爆致敏大鼠外周血白细胞.③PLD与大鼠外周血白细胞引爆作用有一定联系.
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支气管哮喘发病机制和抗哮喘新药研究进展
支气管哮喘(以下简称哮喘)是呼吸系统疾病中的一种常见病,现在认为哮喘是气道慢性炎症性疾病,以肺部可逆性气流阻塞、气道黏膜炎症和气道高反应性为特征.近年来,主要在磷酸二酯酶、磷脂酶D、中枢神经系统在哮喘发病过程中的神经免疫调节作用和新药开发等方面进行了研究,并建立了相应的实验研究方法,为今后进一步的研究工作打下坚实基础.
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伪结核棒状杆菌毒力因子的研究进展
人兽共患病原伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)引起的慢性传染病干酪样淋巴结炎杆菌(Caseous lymphadenitis,CLA)呈全世界流行,极难防制.该病原感染致病的机理与其毒力因子密切相关,本文就伪结核棒状毒力因子研究情况进行综述,提出进一步鉴定和解析不同毒力因子在该病原感染致病中的作用及相互关系,对深入了解该病原的致病机制和候选疫苗研究具有重要的指导意义.
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超临界CO2体系制备富含DHA南极磷虾磷脂酰丝氨酸工艺研究
磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,简称PS)在自然界中含量稀少,但在食品、医药、化妆品等行业有极高的利用价值.为提高PS的得率,本文以超临界CO2为非水反应介质,以南极磷虾中提取的磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)为原料,在磷脂酶A1 (PLA1)的作用下使游离DHA结合到磷脂酰胆碱Sn-2位上,以制备富含DHA的磷脂酰胆碱(DHA-PC),再通过磷脂酶D改性成富含DHA的磷脂酰丝氨酸(DHA-PS),并研究不同条件对其改性的影响.通过单因素和正交实验得到制备DHA-PS的佳工艺条件为压力9 MPa,温度38℃,时间4h,丝氨酸的添加比例1∶2,佳缓冲溶液pH7.5,得率可达89.73％.与传统有机溶剂法相比,以超临界为介质制备PS,极大地提高了反应速率和得率,同时也实现了南极磷虾粉的高值化利用.
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补髓生血颗粒对慢性再生障碍性贫血患者骨髓单个核细胞PI-3K和PLD表达的影响
目的 探讨补髓生血颗粒对慢性再生障碍性贫血(CAA)患者骨髓单个核细胞中磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3K)和磷脂酶D(PLD)表达的影响及其作用机制.方法 采用蛋白质印迹(Western-blot)方法检测CAA患者和正常人骨髓单个核细胞内PI-3K和PLD表达水平.结果 疗前CAA患者骨髓单个核细胞的P1-3K和PLD表达水平均低于正常组(P均＜0.05),疗后PI-3K和PLD表达水平有所上升,与疗前相比具均有显著性差异(P均＜0.05).结论 ①CAA患者PI-3K和PLD的低表达异常可能影响了骨髓的造血功能；②补髓生血颗粒通过调节PI-3K和PLD介导的异常信号转导通路,抑制骨髓造血干/祖细胞的过度凋亡,进而促进造血干/祖细胞的增殖和分化,改善造血微环境,以恢复骨髓的造血功能.
