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中药望江南子抗真菌蛋白成分研究
以往中药研究较少涉及蛋白质成分的作用.前人曾报道望江南(Cassia occidentalis L.)种子和其它同属药用植物种子的水浸剂有抑制多种人体真菌活性,并确定决明(C.obtusifolia L)和小决明(C.tora L.)的种子中小分子化合物为活性成分.本实验以绿色木霉(Trichoderma viride Persoon ex Friex Accc30048)和红色酵母为指示菌,发现中药望江南子和决明子的水溶性成分均有抗真菌活性,但经蛋白变性处理或热处理后,望江南子的抗真菌活性丧失.经含DDT和PVPP的缓冲液低温抽提、一20℃丙酮沉淀及在FPLC上进行Superdex 75(16/88)凝胶过滤、Mono S(5/5)离子交换层析和RESOUCE PHE(1ml)疏水层析,从望江南种子中纯化到一种相对分子量28 000的单链抗真菌蛋白(Co-AFP).本工作首次从决明属植物望江南的种子中发现了抗真菌蛋白,为药用植物活性蛋白的进一步研究创造了条件.
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刀额新对虾变应原的分离、鉴定与纯化
目的 通过对我国常见的刀额新对虾变应原蛋白进行分离、鉴定与纯化,以提供虾特异性变应原用于食物变态反应疾病的诊断和治疗.方法 通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离刀额新对虾的蛋白质组分并测定其分子量,收集过敏病人血清,采用免疫印迹(Western-blotting)法鉴定其变应原成分,通过离子交换层析对刀额新对虾变应原进行初步纯化,通过疏水层析和凝胶过滤层析进一步对变应原纯化.结果 刀额新对虾有17条蛋白带,其中主要条带有10条,68和36 kD为可与虾过敏性病人血清IgE结合的特异性变应原;通过各种层析方法纯化出刀额新对虾68kD变应原,纯度为96%.结论 对刀额新对虾变应原进行分离、鉴定和纯化,得到高纯度的68 kD刀额新对虾变应原,为临床虾变态反应疾病的诊断和治疗奠定基础.
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一种利用HCIC快速纯化抗rhTF243单克隆抗体方法的研究
目的:建立从小鼠腹水中快速纯化抗人重组组织因子243(recombine human tissue factor 243,rhTF243)单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的方法.方法:含抗rhTF243单克隆抗体的腹水经离心、过滤及缓冲溶液变换等预处理后,先经疏水电荷诱导层析纯化处理,去除大部分杂蛋白,再经Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析柱进一步纯化.结果:经两步纯化后获得抗rhTF243 单克隆抗体,其生物学活性高、纯度大于95%,抗体效价保持良好,抗体总回收率达73%,且具有明显的抗促凝作用.结论:建立的单克隆抗体纯化方法简便、高效,所得mAb的纯度高、生物学活性好.
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超滤技术去除重组MUC1-MBP融合蛋白中内毒素的效果评价
目的：评价超滤技术去除纯化后重组 MUC1-MBP融合蛋白（MUC1-MBP）溶液中内毒素的效果，阐明超滤技术对去除内毒素的作用。方法：选取表达 MUC1-MBP大肠杆菌基因工程菌，分别通过 CM Sepharose FF离子交换层析（CM）（CM 组）、CM 联合 Phenyl Sepharose 6 FF 疏水层析（C6）（CM＋C6组）、CM 加超滤（CM＋超滤组）以及CM联合C6加超滤（CM＋C6组＋超滤）进行纯化，并去除内毒素；采用 SDS-PAGE 分析蛋白纯度；鲎试剂显色基质法检测内毒素表达水平。结果：SDS-PAGE分析，在预期相对分子质量62000处呈现单一条带， Quantity One分析纯度＞96％；CM组与CM＋C6组内毒素表达水平均较高，但2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与 CM 组比较， CM＋超滤组内毒素表达水平明显降低（P＜0.01）；与 CM＋C6组比较， CM＋C6超滤组内毒素表达水平明显降低（P＜0.01）；CM＋超滤组与CM＋C6＋超滤组内毒素表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：CM或 CM联合 C6均不能有效去除内毒素，其中 C6对去除内毒素几乎无作用；CM加超滤可有效去除内毒素，超滤技术在去除内毒素中发挥重要作用。
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疏水层析在去除复合干扰素聚集体中的应用
干扰素(interferon,IFN)是一种具有广泛生物活性的调节蛋白质,临床上主要用于抑制病毒的增殖.重组复合干扰素(consensus interferon,cIFN)是一种完全由人工设计的重组干扰素,是通过对14种天然亚型IFN序列的扫描,利用重组DNA技术,将这些亚型IFN蛋白质结构中每一位点上常见的氨基酸序列排列成一复合序列,再通过基因重组技术在大肠埃希菌中进行表达.
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重组汉逊酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原疏水层析图谱的峰形规律分析
目的 探讨疏水层析纯化重组汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)表达的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)层析图谱与蛋白含量及HBsAg含量的相关性.方法 采用疏水层析纯化8批HP-HBsAg小量试验样品和5批小量验证试验样品及5批酿酒酵母表达的HBsAg对照试验样品,采用Lowry法和电化学发光法(Electrochemiluminescent immunoassay,ECLIA)分别检测纯化样品中蛋白含量和HBsAg含量,并计算HBsAg的回收率；通过几何法封闭紫外监测图谱特征峰图形,用数字求积仪采用积分法求出各封闭特征峰的图形面积,并进行分析；取小量验证试验1批样品的层析主峰和副峰收液进行电镜观察.结果 8批HP-HBsAg小量试验和5批HP-HBsAg小量验证试验HBsAg的平均回收率分别为70％和54％.HP-HBsAg疏水层析图谱由两部分构成:穿透峰和目标峰(HBsAg峰),目标峰可见高低不同的两个峰(主峰与副峰)；对照图谱中有穿透峰和目标峰.对目标峰进行量化分析,主峰、副峰与目标峰的面积比值分别与其所对应的收集量、蛋白含量和HBsAg含量比值相关.电镜观察可见小量验证试验样品主峰收液中HBsAg颗粒大小均一,副峰收液中HBsAg颗粒大小不均一.结论 疏水层析纯化重组HP表达的HBsAg效果良好,通过峰形之间面积比值,可获得峰形所对应的收集量、蛋白量和HBsAg量比值,为HBsAg的进一步纯化提供了参考.
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长链人胰岛素样生长因子-1的分离纯化
目的 建立长链人胰岛素样生长因子-1(Long chain Arg3 human insulin-like growth factor-1,LR3IGF-1)的分离纯化方法.方法 将LR31GF-1毕赤酵母工程菌接种至30 L发酵罐进行高密度发酵,发酵液经离心、超滤浓缩后,采用SPSepharose FF阳离子交换层析、Phenyl SepharoseFF疏水层析、S-100凝胶过滤层析和DEAE Sepharose FF层析对发酵上清液中的表达产物进行分离纯化,测定蛋白浓度,计算蛋白收率,并分析纯化样品的浓度.采用MTT法检测各步纯化样品促NIH-3T3细胞增殖的活性.结果 纯化LR3IGF-1的蛋白总收率为28％,RP-HPLC纯度可达95％以上.随着纯化过程中样品纯度的增加,LR3IGF-1的活性也相应增强,各纯化步骤基本不影响LR3IGF-1的生物活性.结论 初步建立了LR3IGF-1的分离纯化工艺,其简便有效,为LR3IGF-1的规模化生产奠定了基础.
关键词： 长链人胰岛素样生长因子-1 阳离子交换层析 疏水层析 -
应用疏水层析纯化HIV-1跨膜蛋白gp41截短体包涵体
目的对表达HIV-1跨膜蛋白gp41截短体包涵体进行纯化.方法将收获的表达菌体洗涤、超声波破菌、预处理后进行疏水层析.结果纯化后的gp41截短体的融合蛋白纯度达到90%,并且具有较好的抗原性和特异性.结论利用疏水层析可以将目的蛋白进行有效的纯化,为下一步的应用打下基础.
关键词： 人类免疫缺陷病毒1型 跨膜蛋白 包涵体 疏水层析 纯化 -
应用疏水层析法纯化hCG单克隆抗体
建立一种良好的纯化hCG单克隆抗体方法.将hCG单克隆抗体的实验小鼠腹水经离心、过滤预处理后,用疏水层析法进行纯化,并探讨了洗脱方式、不同上样缓冲液离子强度、洗脱体积对抗体纯度的影响.以20 mmol/mL磷酸缓冲液+1.5 mmol/L硫酸铵为上样缓冲液,15 CV的洗脱体积进行洗脱,单抗纯度为70％,回收率20％.纯化后的单克隆抗体的生物学活性没有下降.本研究建立的疏水层析法纯化hCG单克隆抗体的方法,操作简便、快速而且效果良好.
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重组人瘦素的分离纯化
目的:探索毕赤酵母表达的人瘦素的非亲和层析纯化方法.方法:采用强阴离子交换柱(Sepharose Qfastflow)和疏水层析柱(Phenyl Sepharose 6 fastflow)在pH 7.5的条件下进行纯化.结果:经Q柱一步纯化后,产物纯度由42.3%到达89.6%,随后通过疏水层析纯化后,产物纯度达到96.2%.经SDS-PAGE证实为单一蛋白条带.结论:通过上述手段已成功分离纯化得到纯度较高的由毕赤酵母表达的重组人瘦素.
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疏水层析法和凝胶过滤法分离HI47抗CD20 F(ab')2之比较
目的比较疏水层析和凝胶过滤两种方法分离纯化HI47抗CD20 F(ab')2的优缺点.方法采用亲和层析柱protein-G对发酵菌体裂解液进行粗纯化,分别采用疏水层析法和凝胶过滤法进行抗CD20 F(ab')2的分离纯化:疏水层析采用梯度洗脱,80%B液洗脱20min,100%B液洗脱30 min;凝胶过滤以50mmol/L PB缓冲液(pH 7.0),0.8 mL/min洗脱4 h.结果粗纯化产物主要含F(ab')2、Fab',含量分别为19.6%、59.7%.采用疏水层析法1 h即可完成分离,F(ab')2回收率为67%,纯度为89.3%;凝胶过滤4 h完成分离,F(ab')2回收率为65%,纯度为90.5%.FACS结果表明,两者结合Raji细胞的阳性率分别为99.93%和99.97%.结论疏水层析分离纯化抗CD20 F(ab')2简单、快速、回收率高、纯度高,适用于大规模的工业化生产.
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疏水层析用于纯化重组乙肝表面抗原的研究
目的提高重组乙肝表面抗原(HBsAg)的纯化效率.方法用HBsAg基因重组质粒转化中华地鼠卵巢细胞,经克隆筛选的C28细胞系作为基因工程乙肝疫苗株[1],培养重组CHO-C28工程细胞,收集含HBsAg的细胞原液,经连续离心(15000r/min)除细胞碎片,超滤浓缩后研究不同盐浓度下,疏水介质对于重组HB8Ag的吸附及纯化的影响.结果硫酸铵饱和度为4%、6%时,盐浓度太低,HBsAg未能很好地结合到疏水介质上;硫酸铵饱和度为10%时,疏水性太强,HBsAg不宜从介质上洗脱下来.结论8%饱和度的硫酸铵更适合重组HB8A g的纯化.
