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兔免疫血清特异性IgG的初步分离纯化的教学实验设计
目的 将血清特异性IgG的分离纯化与纯度鉴定实验用于医学院本科实验教学.方法 设计家兔特异性免疫血清经硫酸铵盐析,再通过Sephedex G-25凝胶过滤层析,将分离前后的样品分别配制成相同蛋白浓度,分别进行玻片凝集试验和试管凝集试验.结果 玻片凝集法分离后的样品凝集现象强于分离前;试管凝集法分离后的样品凝集效价大于分离前.结论 成功得到初步分离纯化的特异性IgG.实验操作较为简便,结果稳定,再现性好.通过本实验学生能更好地理解免疫球蛋白的制备、分离纯化的基本方法和过程.
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利用凝胶过滤层析技术分离人源γ-微管环形复合物
目的：分离人源γ-微管蛋白环形复合物（γ-tubulin ring complex ，γTuRC）。方法利用凝胶过滤层析技术分离人源293 FT细胞裂解产物；利用免疫印迹检测γTuRC和γ-微管蛋白小复合物（γ-tubulin small complex ，γTuSC）所在的洗脱组分，实现复合物与游离蛋白分离。结果γTuRC复合物组成型组分γ-微管蛋白（γ-tubulin）、γ-微管蛋白复合物蛋白2（γ-tubulin complex protein 2， GCP2）、GCP3和GCP4在第4洗脱组分（4＃）被洗脱富集，该组分相对分子质量约为2×106；γTuSC复合物组成型组分γ-tubulin、GCP2、GCP3蛋白在14＃洗脱组分被洗脱富集，该组分相对分子质量约为3．1×105；未掺入的游离蛋白组分在18＃洗脱组分后被洗脱下来。非变性凝胶电泳可在相应组分中检测到γTuRC和γTuSC复合物。结论γTuRC复合物在凝胶过滤层析4＃洗脱组分得到富集；γTuSC复合物在14＃洗脱组分得到富集。上述复合物与游离蛋白成功分离，可用于后续复合物组装研究。
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全蝎胃蛋白酶酶解混合多肽体外抗凝活性研究及其组成分析
目的 采用凝胶过滤层析法分离全蝎酶解液的抗凝活性部位,并检测活性部分的分子量分布范围.方法 采用紫外检测法、考马斯亮蓝法检测,合并凝胶层析蛋白流分;以APTT凝血时间为指标,检验各组分体外抗凝活性;通过MALDI-TOF-MASS法检测分离部分的分子量分布范围.结果 全蝎酶解液通过凝胶过滤层析分得的2组分抗凝效果显著,分子量分布范围850～5 300.结论 体外抗凝试验表明:凝胶过滤层析法纯化分离全蝎胃蛋白酶酶解液方法 可行,MALDI-TOF-MASS表明活性组分为小分子肽类.
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刀额新对虾变应原的分离、鉴定与纯化
目的 通过对我国常见的刀额新对虾变应原蛋白进行分离、鉴定与纯化,以提供虾特异性变应原用于食物变态反应疾病的诊断和治疗.方法 通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离刀额新对虾的蛋白质组分并测定其分子量,收集过敏病人血清,采用免疫印迹(Western-blotting)法鉴定其变应原成分,通过离子交换层析对刀额新对虾变应原进行初步纯化,通过疏水层析和凝胶过滤层析进一步对变应原纯化.结果 刀额新对虾有17条蛋白带,其中主要条带有10条,68和36 kD为可与虾过敏性病人血清IgE结合的特异性变应原;通过各种层析方法纯化出刀额新对虾68kD变应原,纯度为96%.结论 对刀额新对虾变应原进行分离、鉴定和纯化,得到高纯度的68 kD刀额新对虾变应原,为临床虾变态反应疾病的诊断和治疗奠定基础.
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杂色曲霉菌变应原分离、鉴定及纯化
目的 对杂色曲霉菌变应原蛋白进行分离、鉴定与纯化.方法 提取杂色曲霉菌蛋白质,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,用免疫印迹(western-blot)鉴定变应原成分,用western-blot法鉴定出了6种变应原,通过离子交换和凝胶过滤层析纯化变应原.结果 碳酸氢盐-盐水提取液(Coca's液)共提取出23条蛋白质条带,分子量为17、20和62 kD的蛋白质为杂色曲霉菌主要变应原,而分子量为22、35和76kD的蛋白质为次要变应原;通过各种层析纯化变应原,得到含有分子量为20kD主要变应原和35kD的次要变应原的组分.结论 鉴定了杂色曲霉菌的主要和次要变应原并部分纯化出其变应原组分,为变态反应疾病的诊断和治疗提供依据.
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两种层析方法纯化轮状病毒效果的比较
目的 比较两种不同的凝胶层析纯化方法对人轮状病毒(Rotavirus,RV)的纯化效果及其对病毒抗原性和免疫原性的影响.方法 病毒收获液经超滤浓缩后,分别采用Q Sepharose Fast Flow(QFF)离子交换层析和Sepharose 4 Fast Flow (4FF)凝胶过滤层析纯化,采用A群轮状病毒诊断试剂盒(胶体金)检测纯化病毒的抗原性;电镜观察病毒的形态;荧光灶法测定病毒纯化前后的感染性滴度;双抗体夹心ELISA法测定抗原含量;Lowry法测定纯化前后样品的蛋白含量;SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化的病毒蛋白;纯化病毒经灭活后,PAGE分析病毒的核酸带型,免疫小鼠,检测纯化病毒的免疫原性.结果 QFF洗脱峰1和4FF洗脱峰1为RV抗原阳性,电镜观察可见完整的、大小约70 nm的RV颗粒;经QFF和4FF层析纯化后,病毒的感染性滴度分别为7.10和4.50 lgCCID50/ml,终抗原同收率分别为65.3％和11.8％,病毒液总蛋白去除率分别为99.68％和99.52％;SDS-PAGE分析显示,经QFF和4FF纯化的样品未见明显杂蛋白条带,且特异性良好;纯化病毒灭活后,病毒基因组带型未发生改变,且保持了良好的抗原性和免疫原性.结论 两种凝胶层析方法均能纯化人轮状病毒,综合比较,QFF离子交换层析纯化效果优于4FF凝胶过滤层析.
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Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗纯化工艺的建立
目的 建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)纯化工艺.方法 采用Sepharose CL-6B凝胶过滤和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析两步纯化法纯化脊髓灰质炎病毒,进行各项检定后再经除菌过滤和灭活.结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒纯化后的蛋白去除率均不低于98.81%,病毒滴度分别为8.75、8.50和8.63 IgCCID_(50)/ml,DNA残留量均＜100 pg/ml.除菌过滤和灭活后,D抗原含量略有下降.结论 已建立了Sabin株IPV的纯化工艺,纯化后制备出了高纯度的Sabin株IPV.
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蛋白酪氨酸激酶NOK/STYK1胞内区的表达与纯化
目的:酪氨酸蛋白激酶NOK/STYK1具有很强的促肿瘤形成和转移能力,被认为是很有前途的肿瘤治疗靶点.由于NOK含有一个跨膜区,且富含疏水性氨基酸,其表达和纯化非常困难,直接影响了对其功能及相关分子机理的深入研究.本研究目的是获得可溶的且纯度较高的NOK胞内区融合蛋白△NOK (AA:49-422),为后续抗体的制备和功能研究奠定重要基础.方法:含有△NOK基因的原核表达载体,转入E.coli BL21中,IPTG诱导蛋白表达,通过亲和层析获得可溶的△NOK融合蛋白.融合蛋白经凝血酶酶切后,凝胶过滤层析分离标签蛋白获得△NOK蛋白.同时,我们还通过Bac-to-Bac系统获得合有△NOK基因的杆状病毒,感染sf9细胞,尝试在真核细胞中表达目的蛋白.结果:通过在sf9昆虫细胞和大肠杆菌表达系统中盐浓度等各种条件的摸索,首次获得了可溶的且纯度较高的NOK胞内区融合蛋白(△NOK-GST)和一定量去除标签的△NOK蛋白.本研究中与大肠杆菌相比,昆虫细胞并不适合△NOK的纯化.结论:我们建立了一套优化的NOK蛋白表达和纯化体系,从而为后续抗体制备和各种体内外生化实验等功能研究奠定基础,为研究NOK在肿瘤中的作用和药物筛选创造条件.同时丰富了整个RTKs家族作用机制的探索,进一步促进了以RTKs为靶点的治疗手段在临床上的应用.
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凝胶过滤层析纯化乳酸脱氢酶同工酶
乳酸脱氢酶(LDH)广泛存在于生物细胞内.它以NAD+为辅酶,在细胞代谢过程中起重要的调节作用,是早发现的同工酶之一.近年来随着酶法分析的应用,酶促偶联反应不断应用于临床医学及其他研究领域.特别是正确选择以NAD+、NADP+为辅酶的脱氢酶做标记酶、工具酶,以便准确测定组织中其他一些酶的特性已成为许多人的研究内容[1].20世纪70年代以前常用硫酸盐及有机溶剂分级沉淀,然后用离子交换层析分离纯化.
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凝胶过滤层析分离蛋白质实验中三种过滤介质分离效果的比较
目的探讨凝胶过滤层析分离蛋白质的佳实验效果.方法分别采用不同规格的凝胶过滤层析介质Sephadex G-50、G-75、G-100,通过凝胶过滤层析法分离已知分子量的混合蛋白质.结果混合样品得到分离,呈现三组分离样品的层析图.结论从大分子物质中除去小分子物质时应选用交联度大的介质G-50.进行中等蛋白质分离时,选用G-75较为合适.将小分子物质浓缩而除去大分子物质时,应选用交联度小的介质,如G-100或G-200.
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梅花鹿和马鹿鹿茸尖部与基部水溶性成分含量测定
目的 测定不同种类鹿茸尖部和基部水溶性成分含量,并分析其含量差异.方法 对传统方法加工的鹿茸进行水溶性成分提取,采取凝胶过滤层析方法,以细胞色素C为内参,采用SuperdexTM75 10/300 GL凝胶过滤层析柱,缓冲液使用O.05mol· L-1PBS +0.3 mol·L-1NaC1,流速0.5ml/min,检测波长280 nm,通过峰下面积积分,计算水溶性成分含量.结果 实验建立了水溶性成分含量的计算方法.经计算水溶性成分含量分别为梅花鹿二杠茸尖部30.50％,基部为6.77％;梅花鹿三杈茸尖部29.69％,基部为5.98％;马鹿四杈茸尖部28.27％,基部为3.22％.结论 水溶性成分含量在鹿茸尖部和基部差异明显,梅花鹿二杠茸、梅花鹿三杈茸和马鹿四杈茸的尖部分别为基部的4.5倍,5倍和9倍;从不同种类鹿茸的水溶性成分含量上看,梅花鹿二杠茸优于梅花鹿三杈茸优于马鹿四杈茸,与传统分类相一致.
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一种新的高纯度蓝舌病毒中国湖北株制备方法
目的:获得高纯度蓝舌病毒HbC株,为制备生产和实验室研究奠定基础.方法:利用反向免疫共沉淀方法获取纯化的蓝舌病毒颗粒;运用透射电镜和凝胶过滤层析检测纯化产物病毒的结构完整性和纯度;组织培养技术检测产物的生物学活性并计算纯化得率.结果:纯化后的病毒经凝胶过滤层析分析仅见一个层析峰;所对应的电镜照片背景干净,未见明显杂质;纯化后的病毒对Vero细胞的TCID50是10-5.7·ml-1;纯化得率为50.4%～70.8%.结论:这种新方法能制备出高纯度、高活性的蓝舌病毒,且得率较高,易于放大生产,从而具备大批量高纯度生产制备蓝舌病毒的潜能.
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可溶性HLA-G-肽复合物的体外制备与纯化
目的 探讨可溶性HLA-G-肽复合物的体外制备与纯化.方法 原核高效表达的HLA-G重链及轻链(β2m)在抗原肽(人工合成九肽NH2-KGPPAALTL-COOH)的存在下,通过稀释复性折叠成HLA-G-肽复合物,采用凝胶过滤层析对折叠复合物进行纯化.利用特异性抗体(mAb W6/32和兔抗人β2m抗体)进行ELISA和Western blot对纯化产物进行鉴定.结果 折叠复合物中,主要含有HLA-G重链聚合体、HLA-G-肽复合物及β2m 3种成分,纯化后主要为HLA-G-肽复合物.结论 成功地获得纯度较高的可溶性HLA-G-肽复合物单体,为进一步研究HLA-G的生物学功能奠定了基础.
关键词： HLA-G-肽复合物 稀释复性 凝胶过滤层析 -
线粒体自噬受体Nix蛋白的原核表达及其纯化
目的 获得可用于蛋白晶体筛选的高纯度及构象均一的Nix蛋白.方法 将Nix截断基因构建到原核载体并转化大肠杆菌.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后通过GST柱亲和纯化目标蛋白.TEV酶切除GST标签后采用凝胶过滤层析进一步纯化.结果 Nix截断基因成功构建到pGEX-4T-2并诱导表达了目标蛋白.通过GST亲和层析得到了可溶性的携带GST标签的Nix(2～135)蛋白.切除GST标签的Nix(2～135)通过凝胶过滤层析得到了构象均一的单体蛋白.结论 采用原核表达、亲和层析和凝胶过滤层析可获得纯度高且构象均一的单体Nix蛋白.
关键词： 线粒体自噬受体Nix 载体构建 亲和层析 凝胶过滤层析 -
牡蛎多糖的分离和纯化
采用醇沉法分离牡蛎多糖,苯酚-硫酸法测定其含量,凝胶层析法纯化牡蛎多糖.牡蛎粗提物的多糖含量为36.7%;醇沉法多糖得率为33%,回收率为78.9%;牡蛎多糖可能含有4种组分的多糖成份.
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鸡胚脊髓背角神经营养物质的HPLC纯化分析
目的纯化鸡胚脊髓背角内的神经营养物质.方法采用Sephadex G-200凝胶过滤层析法分离鸡胚脊髓背角内的神经营养物质,以鸡胚背根神经节细胞培养结合MTT法检测各洗脱峰液的神经营养活性.所得活性组分用高效液相色谱技术(HPLC)进一步分离,同前用MTT 法检测各洗脱峰液的神经营养活性.结果经层析获得三个洗脱峰,其中第2洗脱峰液促进培养神经细胞生长的活性强(P<0.01),提示2峰洗脱液含有神经营养物质.HPLC后获得 7个洗脱峰.经MTT法测定各峰洗脱液对鸡胚DRG神经细胞的生长活性发现F 峰有明显的神经营养活性(P<0.05).结论通过分离纯化获得了有较强活性的神经营养物质.
