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Cry1Ie基因在大肠杆菌中的表达及等同性鉴定
目的 以Cry1Ie基因表达蛋白为模式蛋白,建立外源基因表达蛋白的技术平台.方法 利用大肠杆菌系统高效表达Cry1Ie蛋白,并采用SDS-PAGE技术分离纯化,通过生物学活性和免疫反应性2项指标检测了大肠杆菌表达蛋白与转基因玉米中蛋白的等同性.结果 大肠杆菌表达系统可以产生大量的Cry1Ie蛋白,所获得的蛋白与转Cry1Ie玉米表达的Cry1Ie蛋白有相同的免疫反应性和生物活性.结论 大肠杆菌表达系统可以作为Cry1Ie外源基因蛋白表达技术平台用于转基因植物食用安全性的初步研究.
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神经系统RNA结合蛋白Musashi1 RRM1的初步结晶
目的 对Musashi1发挥功能的RRM1结构域进行结晶,得到可用来衍射的蛋白晶体,为之后的结构解析打基础.方法 通过构建Musashi1 RRM1的原核表达载体,并在BL21中表达、纯化高纯度的蛋白质,通过筛选结晶体条件得到蛋白晶体.结果 通过系统筛选和优化晶体生长条件得到了蛋白晶体.结论 MusasM1 RRM1的蛋白晶体质量较好,满足蛋白晶体衍射和数据收集的要求.
关键词： RNA结合蛋白 Musaahi1 RRM1 蛋白表达和纯化 结晶 -
HCA518的蛋白表达、纯化和单克隆抗体的制备
目的:对HCA518蛋白进行表达和纯化,并制备HCA518蛋白的单克隆抗体.方法:采用基因重组技术在原核系统表达HCA518蛋白,金属镍螯合的Ni-NAT亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株;ELISA方法进行单克隆抗体细胞株的筛选;Western blot方法鉴定单克隆抗体的特异性;免疫荧光法对HCA518蛋白进行定位.结果:成功表达和纯化了HCA518重组蛋白,其纯度达98%.共筛选出2株分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化了HCA518的单克隆抗体,腹水中单克隆抗体的效价分别为1×10-4、5×10-4,属于IgG2b亚型和IgM,该抗体能与重组蛋白和肿瘤细胞核蛋白(P100)发生特异性反应,免疫荧光显示HCA518蛋白主要定位于细胞核中.结论:建立了稳定分泌HCA518单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体特异性好,对进一步应用于检测肿瘤组织中HCA518蛋白和判断肿瘤细胞的恶性增生程度预测肿瘤预后具有重要的实用价值.
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蛋白酪氨酸激酶NOK/STYK1胞内区的表达与纯化
目的:酪氨酸蛋白激酶NOK/STYK1具有很强的促肿瘤形成和转移能力,被认为是很有前途的肿瘤治疗靶点.由于NOK含有一个跨膜区,且富含疏水性氨基酸,其表达和纯化非常困难,直接影响了对其功能及相关分子机理的深入研究.本研究目的是获得可溶的且纯度较高的NOK胞内区融合蛋白△NOK (AA:49-422),为后续抗体的制备和功能研究奠定重要基础.方法:含有△NOK基因的原核表达载体,转入E.coli BL21中,IPTG诱导蛋白表达,通过亲和层析获得可溶的△NOK融合蛋白.融合蛋白经凝血酶酶切后,凝胶过滤层析分离标签蛋白获得△NOK蛋白.同时,我们还通过Bac-to-Bac系统获得合有△NOK基因的杆状病毒,感染sf9细胞,尝试在真核细胞中表达目的蛋白.结果:通过在sf9昆虫细胞和大肠杆菌表达系统中盐浓度等各种条件的摸索,首次获得了可溶的且纯度较高的NOK胞内区融合蛋白(△NOK-GST)和一定量去除标签的△NOK蛋白.本研究中与大肠杆菌相比,昆虫细胞并不适合△NOK的纯化.结论:我们建立了一套优化的NOK蛋白表达和纯化体系,从而为后续抗体制备和各种体内外生化实验等功能研究奠定基础,为研究NOK在肿瘤中的作用和药物筛选创造条件.同时丰富了整个RTKs家族作用机制的探索,进一步促进了以RTKs为靶点的治疗手段在临床上的应用.
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人CD112(Nectin2/PRR2)单克隆抗体的制备和鉴定
目的:表达和纯化CD112 胞膜外区重组蛋白, 制备针对CD112胞膜外区的单克隆抗体(mAb), 并且研究CD112的分布.方法:采用基因重组技术在真核系统表达CD112-Fc融合蛋白, 亲和层析法进行蛋白纯化;纯化的CD112-Fc融合蛋白免疫BALB/c小鼠, 杂交瘤技术建立分泌CD112 mAb的杂交瘤细胞株, 间接ELISA、 Western blot及FCM鉴定mAb 的特异性.用流式细胞术(FCM)检测 CD112 的细胞系分布.结果:构建了高效真核表达载体pIg3C-CD112, 表达并纯化了CD112-Fc融合蛋白, 其纯度大于 90%.以纯化重组蛋白为免疫原共制备9株分泌抗CD112 mAb的杂交瘤细胞株(命名为FMU-CD112.1 ～FMU-CD112.9), 制备腹水并纯化 mAb.FMU-CD112.1、 3、 6和8能用于Western blot, FMU-CD112.1、 4、 6和8可用于 FCM.CD112细胞分布检测显示该分子主要分布在正常上皮及内皮细胞系、巨核细胞谱系和部分T细胞系, 并高表达于上皮及内皮来源的肿瘤、胶质瘤等细胞系.结论:成功地表达纯化了CD112-Fc融合蛋白并建立了稳定分泌CD112 mAb的杂交瘤细胞株, 为CD112的功能研究打下坚实的基础.
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兔抗人硒蛋白P抗体的制备与鉴定
目的:以原核表达的人硒蛋白P片段(HSelP)制备其兔多克隆抗体并进行鉴定.方法:在E.coli中诱导表达HSelP片段, 经DEAE fast flow和Ni-NTA-Agarose柱层析纯化后, 以其为免疫原制备兔抗HSelP抗体, 并以Western blot鉴定抗体的特异性.结果:成功地表达并纯化了HSelP, 制备的兔抗HSelP抗体可有效地检测天然的SelP.结论:以原核表达并纯化的HSelP为免疫原, 成功地制备了兔抗该蛋白的抗体, Western blot鉴定特异性良好.为进一步研究硒蛋白P的功能、分布及建立较简便的检测方法打下了基础.
