麻疹疫苗免疫持久性研究——初免后24～25年追踪观察

目的对1973年在浙江省诸暨县(市)建立的麻疹免疫持久性观察基地进行麻疹疫苗初免后24～25年的血清抗体追踪观察.方法对各年份血清学资料完整的326名观察对象采集微量血,测定HI抗体,同时对HI＜1∶2的对象用细胞中和法(SN)进行复测.结果初免后24～25年抗体阳性率为53.66%～84.48%.不同剂量免后HI的GMT和累积阴转率差异无显著意义.不同免疫途径免疫的抗体持久性均与野病毒感染基本一致,但HI＜1∶2者用SN法复测抗体阳性率可达92.23%.结论麻疹疫苗HI抗体阳性率随免疫时间推移降低,但细胞中和抗体阳性率仍较理想.

流行性乙型脑炎病毒E蛋白上与病原性相关的氨基酸

目的分析比较乙脑病毒弱毒株at222与其强毒株AT31全基因核苷酸序列,探索与乙脑病毒病原性相关的氨基酸.方法由日本基因公司合成多核苷引物,以RT-PCR合成cDNA,筛选出阳性克隆.用Sanger法测定at222与AT31株的全基因序列.结果全基因序列分析比较显示,非编码区3个不同核苷酸均出现在3'-端.编码蛋白氨基酸变化分别是E蛋白上3个,NS1蛋白上3个,NS3蛋白上2个,NS4a蛋白上1个,NS4b蛋白上1个,NS5蛋白上2个.结论强弱毒株间2个变异部位与以前报道一致,且其中AT31的E138位点上E氨基酸为强毒株JaGAr01、JaOArS982、Beijing-1和SA14所共有,而at222E138位点上K氨基酸为弱毒株SA14-14-2所共有.E蛋白上E138、E176位点上氨基酸决定了乙脑病毒病原性.

应用液相色谱法测定纤原中Triton X-100含量

目的建立一种简便、规范、标准的测定Triton X-100含量的方法.方法采用高效液相色谱,利用直线回归方法,根据样品的峰面积从标准曲线上计算出Tritonx-100含量.结果该法重复性好,准确性高,省时简便.结论此法可作为实验室的一种常规方法.

从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位

目的建立一种有效的方法,从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(rUreB).方法重组大肠杆菌发酵后,表达的rUreB包涵体经洗涤、变性、复性,采用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和Pheny1 Sepharose High Performance疏水层析分离纯化.使用SDS-PAGE和HPLC检测纯度,选用ELISA和Western-blotting对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定.结果 rUreB包涵体经洗涤和溶解后,rUreB的纯度＞70%.包涵体溶解液经阴离子交换层析和疏水层析后纯度超过95%.rUreB纯品具有良好的生物学活性.结论建立了从包涵体中获得高纯度的rUreB的工艺,为进一步的研究打下了基础.

小鼠群暴发沙门氏菌病的病原学及病理学研究

目的查明小鼠暴发原因不明的急性传染病病因及病理形态学特点,为临床及病理诊断提供依据.方法解剖临床发病及死亡小鼠24只,从内脏分离致病菌,进行生化反应、血清学检测及病理组织学检查.结果从14只昆明小白鼠及14只NIH小白鼠分别分离出11株和9株致病菌,该20个菌株的生化反应和血清学反应完全符合肠炎沙门氏菌血清型,抗原式为9,12∶g,m∶-.病理形态学改变主要表现肝、脾、肠系膜淋巴结及肠壁集合淋巴结肿大,镜下,肝、脾和淋巴结单核巨噬细胞弥漫性增生,并形成多发性特征性伤寒样肉芽肿,灶状坏死,弥漫性血管内凝血,肝细胞广泛水样变及气球样变为其病理形态学特点.结论小鼠群由于感染肠炎沙门氏菌暴发兽疫流行,其肝、脾和淋巴结的伤寒样肉芽肿具有特征性,可作为小鼠沙门氏菌病病理诊断及鉴别诊断的可靠依据.

应用二倍体细胞培养脊髓灰质炎病毒适宜条件的研究

目的为用KMB17细胞制备口服脊髓灰质炎减毒活疫苗提供适宜条件.方法检测不同培养液、不同代次、不同细胞龄和不同病毒感染量等因素对病毒滴度及产量的影响.结果细胞对脊髓灰质炎病毒的敏感性随细胞龄的增加而降低,培养后24、48、72和96h单个细胞中脊髓灰质炎病毒产量分别为986、745、594和237 LogTCID50;细胞感染脊髓灰质炎病毒后出现细胞病变时间跨度大于48h,早期从病变细胞释放出的病毒在培养上清中不稳定,感染性滴度每24h降低0 .25 LogTCID50以上.结论 KMB17细胞培养脊髓灰质炎病毒的感染性滴度和产毒量受培养液营养成分和病毒接种时细胞龄等条件的影响.

生长抑素(SS)基因在大肠杆菌pT7ZZ表达系统中的克隆与表达

目的构建和筛选既能稳定、高效表达SS融合蛋白,又能使这种融合蛋白保持良好的SS抗原性和高水溶性等特点的重组质粒.方法用BamH I/Xho I(B/X)和BamH I/EcoR I(B/E)双酶切,将含有SS基因的片段由pThioHis A中切出,然后分别克隆到pT7ZZa中的相应酶切位点,得到pSSB/X(短尾)和pSS-B/E(长尾)两个重组质粒,用常规表达技术在大肠杆菌中对其进行表达.结果 pSS-B/X和pSS-B/E两个重组质粒在宿主菌BL21(DE3)中均获得表达,pSS-B/X获得高效表达,SS融合蛋白占菌体总蛋白的30.6%.两个表达菌经超声裂解后电泳发现,SS-B/X-ZZ和SS-B/E-ZZ这两种融合蛋白基本为可溶性蛋白,沉淀中含量极低.二者均具有良好的抗原性.结论 pSS-B/X重组质粒很有希望成为SS基因疫苗的候选质粒.

重组人IL-18的高效表达、纯化及诱导KG-1细胞产生高水平IFN-γ

目的研究IL-18在大肠杆菌中高效表达及纯化工艺,并诱导KG-1细胞产生IFN-γ.方法利用RT-nPCR从正常人胎肝组织中扩增获得人IL-18基因, 克隆于pThiohisA载体,转化宿主菌BL-21,1mmol/L IPTG诱导,表达产物以包涵体形式存在,经2%Triton X-100洗涤,在8mol/L尿素下变性阴离子柱层析,透析复性后再经凝胶过滤纯化,通过纯化产物诱导人骨髓瘤单核细胞KG-1(ATCC CCL-246)产生 IFN-γ,并检测其生物学活性.结果获得了在大肠杆菌中的稳定高效表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的25%左右,纯化后纯度可达95%以上,具有显著的刺激细胞产生IFN-γ的活性.结论制备具有生物学活性高纯度的rhIL-18方法的建立,为基础研究与临床应用开发奠定了基础.

HIV-2型gp105、gag核酸疫苗构建与免疫学研究

目的构建含HIV-2 gp 105和gag基因的核酸疫苗,并评价其免疫效果.方法将HIV-2 gp 105型和gag基因克隆到核酸疫苗载体pcDNA3.1(+)中,构建重组核酸疫苗质粒.通过间接免疫荧光试验在细胞水平上检测gp105和ggg基因的表达产物.重组核酸疫苗免疫小鼠后,用流式细胞仪测定CD+4、CD+8T淋巴细胞亚类数,用HIV-2抗体ELISA检测试剂盒检测免疫鼠血清中抗HIV-2抗体.结果构建了3种重组核酸疫苗质粒pcgag、pcgp105和pcgag-gp105,转染BHK细胞后都能表达外源蛋白,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖,并诱导产生抗HIV-2特异性抗体,其中pcgag-gp105的免疫效果较pcgag和pcgp105显著.结论构建的重组核酸疫苗质粒均能诱导机体产生免疫反应,含有融合基因的pcgag-gp105免疫效果显著.

应用吖啶橙-分光光度法检测重组人白介素-2制品中SDS含量

目的用吖啶橙-分光光度法检测重组人白细胞介素-2(rIL-2)制品中SDS含量.方法将被检样品与吖啶橙混合后,加入甲苯进行萃取,然后用紫外分光光度计测A499吸收峰.结果在0～0.01%SDS浓度范围内,SDS浓度与A400呈线性关系,本法可检测浓度低至0.001%的SDS.结论在一定的SDS浓度范围内可用吖啶橙-分光光度法检测SDS.

人凝血因子Ⅷ浓制剂国际标准品第六次协作标定

目的建立第六次人凝血因子Ⅷ浓制剂国际标准品,用于全世界各国建立本国人凝血因子Ⅷ浓制剂国家标准品.方法共采用3种方法,即一期法、二期法和基质显色法.结果标准品批号为97/616,效价8.5IU/支.结论候选待标品Y比X更稳定,实验室之间误差Y比X小,所以选用候选标准品Y作为第六次人凝血因子Ⅷ浓剂国际标准品.

森林脑炎纯化疫苗的研究

目的制备森林脑炎纯化疫苗.方法将森林脑炎病毒感染地鼠肾单层细胞,收获病毒液,经超滤浓缩、柱层析纯化病毒后配制而成.结果疫苗免疫保护力指数均≥1.0×106,杂蛋白去除率≥99%,小牛血清蛋白去除率＞99%,所有检测项目全部合格.结论该纯化工艺制备的森林脑炎纯化疫苗抗原含量高,热稳定性好,免疫原性强,各项检测结果均符合2000年版<中国生物制品规程>标准.

应用微柱凝胶法鉴定ABO及RH(D)血型

目的应用微柱凝胶法全自动血型鉴定系统(以下简称微柱凝胶法)鉴定ABO及RH(D)血型.方法选取100份正常献血者标本和100例住院患者标本,采用试管法和微柱凝胶法进行ABO和RH(D)血型鉴定,并选取14份已知ABO血型的亚型标本和10份弱D抗原的标本,采用两种方法进行比较.结果在正常献血者和患者的ABO及RH(D)定型中,两种方法获得的结果均一致.采用单抗试剂,微柱凝胶法可检出14份亚型标中的9份;试管法可检出14份亚型中的10份.采用人血清抗体,微柱凝胶法可检出14份亚型中的6份;试管法可检出其中的7份.结论在鉴定正常的ABO及RH(D)血型时,两种方法的结果差异无显著意义,微柱凝胶法可取代传统的试管法用于常规的ABO和RH(D)血型鉴定.

五种编码流感病毒蛋白的DNA疫苗的免疫原性研究

目的比较编码流感病毒A/PR/8/34(H1N1)蛋白的各类DNA疫苗在BALB/c小鼠的免疫原性.方法分别将编码流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase, NA)、基质蛋白(matrix protein, M1)、核蛋白(nucleoprotein, NP)以及非结构蛋白(nonstructural protein, NS1)基因克隆入表达质粒.用基因枪轰击法将构建的重组DNA转入小鼠表皮,共2次,间隔3周.第2次免疫7d后,用同源病毒攻击小鼠,通过检测小鼠肺部病毒量和小鼠存活率来评价上述各类DNA对小鼠的免疫原性.结果 HA、NA DNA能诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体,并提供有效的保护.而M1、NP、NS1 DNA不能提供有效的保护,尽管其中用M1、NP DNA 免疫的小鼠能检测到抗体应答.结论病毒表面糖蛋白HA、NA DNA具有较强的免疫原性.

胃蛋白酶对抗狂犬病毒IgY活性的影响

目的观察抗狂犬病毒IgY经胃蛋白酶酶解24h后,抗体活性的变化.方法高效价抗狂犬病毒IgY粗提后,经胃蛋白酶酶解,纯化,用ELISA及小鼠中和实验测其抗体活性.结果获得单一IgY酶解片段并能够中和狂犬病毒.结论 IgY经胃蛋白酶酶解24h仍保持其中和抗体的活性,为制备口服免疫制剂奠定基础.

HSV-tk基因/GCV系统治疗肿瘤的旁观者效应与缝隙连接关系的研究

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因/丙氧鸟苷(GCV)系统杀伤肿瘤细胞时旁观者效应与细胞间缝隙连接的关系.方法用PA317细胞包装STK质粒(逆转录病毒载体介导的HSV-tk基因),形成假逆转录病毒颗粒,转染有缝隙连接的大鼠胶质瘤细胞C6和无缝隙连接的人宫颈癌细胞Hela,制成C6 tk+和Hela tk+细胞,将不同比例的C6和C6 tk+、Hela和Hela tk+细胞混合,每种比例8孔,培养24h后4孔加入含0.5μg/ml GCV的培养基,4孔作对照,6d后用MTT法测量细胞存活率.在两个培养皿中放入周围粘有33mm高滤纸的载玻片,分别接种C6、C6 tk+细胞.细胞80%汇合后将载玻片互换,并加入含0.5μg/ml GCV的培养基,6d后观察细胞形态.结果 C6细胞组存在旁观者效应,Hela细胞组不存在旁观者效应.培养皿中tk+细胞大部分被杀死,tk-细胞无变化.结论 HSV-tk基因/GCV系统杀伤肿瘤细胞时旁观者效应与细胞间缝隙连接有关.

产芽孢梭菌纤溶酶的纯化及特性

目的从产芽孢梭菌的培养上清中分离纯化出具有纤溶活性的蛋白质.方法以产芽孢梭菌的培养上清为材料,经过滤、硫酸铵盐析、离子交换层析纯化纤溶酶,并对其理化特性和纤溶活性进行鉴定. 结果所分离纯化的纤溶酶相对分子质量为67000,系由相对分子质量45000和20000的2个亚基组成,具有较强的溶解纤维蛋白的作用.此酶属丝氨酸蛋白酶类,胰蛋白酶类.结论为纤溶酶的开发和应用提供了依据.

猪肾γ-谷氨酰基转移酶(GGT)的提纯及其稳定性

目的提纯活性稳定的GGT,制备用于GGT测定的参考品.方法用差速离心法从猪肾皮质中分离刷状缘微绒毛膜,用Triton X-100溶解膜结合的酶,用抗GGT亲和层析柱提纯GGT,检测提纯品的有关特性.结果提纯品GGT比活600IU/mg蛋白,得率45.5%,未测出临床常测的酶,在不同方法间的活性比与人血清GGT相似,在特定介质中制成冻干品,经加速变性试验,在-20℃和4℃预期年失活率分别为0.02%和0.25%.结论本法提纯GGT速度快,得率高,几乎不含杂酶,稳定性好,在不同方法间与人血清酶有互换性,是用于制备酶参考品提纯GGT的理想方法.

核苷酸在营养免疫中的作用

嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸是组成细胞的主要成分,是DNA和RNA的基本组成单位,在细胞结构、代谢、能量和功能调节等方面起重要作用.核苷酸是核酸在体内的代谢产物,其中部分核苷酸又可进一步水解为核苷.核苷酸及其水解产物均可被肠粘膜吸收,肠粘膜细胞可将核苷酸运输到其他细胞.体内核苷酸贮存在核苷酸池(mucleotide pool)中,供许多生化反应包括核酸的合成和细胞代谢使用.大多数核苷酸可由机体再合成来供给,但某些器官(如小肠)再合成核苷酸的能力有限,而依赖饮食中核苷和碱基的主动补救合成(salvage synthesis)来维持核苷酸池,当机体对核苷酸的需要增加时,如机体正处于组织损伤恢复期或处于快速生长期,就需要从饮食中补充更多的核苷酸.

香菇多糖对小鼠脾LAK细胞增殖及活性的影响

自LAK细胞问世以来,LAK细胞与IL-2联合回输治疗肿瘤已取得良好效果.但此疗法需要大量效应细胞及IL-2,价格昂贵且副作用大.因此,增强LAK细胞活性,减少IL-2用量,已成为一项重要的课题.香菇多糖是从香菇的菌丝体提取的高分子葡聚糖,除具有抑制肿瘤生长、转移作用外,对机体免疫功能具有调节作用.临床上已作为免疫增强剂,用于肿瘤和慢性肝炎的辅助治疗.但有关香菇多糖对LAK细胞活性的调节作用尚未见报道.为此我们研究了注射香菇多糖小鼠脾LAK细胞增殖及抗肿瘤活性的作用.

冻干乙型脑炎活疫苗的热稳定实验分析

冻干乙脑活疫苗制品检定项目中,有一项热稳定性实验,系将疫苗存放于37℃ 7d,然后与同批次存放于4℃的疫苗同时检测其病毒滴度,以检查疫苗滴度的下降情况.本文作者应用武汉生物制品研究所生产的数批冻干乙脑活疫苗在37℃存放不同天数,观察疫苗的稳定性,以选取适宜的时间进行热稳定性检定.作者选取武汉所生产的乙脑活苗4批,批号为991231、991232、2000101、20000102,分别存放于4℃,37℃1、3、5、7、9d,然后用蚀斑法进行病毒滴度测定,当疫苗在37℃存放5天时,滴度下降较快,且达到局部范围内的低值,几批疫苗的实验结果非常接近(如作曲线图可以看到在37℃ 5 d 是一个明显的折点,5d后反而无大变化.)

我国生物技术产品的发展战略

随着生物技术的快速发展和人类基因组计划等的相继展开,生物技术的发展呈现出前所未有的巨大活力.目前,我国正在实施的国家科技攻关计划、"863"计划、自然科学基金、火炬计划等均把生命科学和生物技术放在重要的地位,极大地促进了我国生物技术产业的发展和成熟.随着WTO的加入,必将对我国制药行业带来极大的挑战,进口制品将会大量增加,对我们的市场势必形成极大的冲击.因此,我们必须面对世界性的挑战,将其转化为发展的机遇和动力,加速我国制药行业的发展.现将我国医药生物技术产品的现状和发展战略简介如下.

DTP/eIPV在儿童常规免疫中的作用