中国生物制品学杂志
Chinese Journal of Biologicals 중국생물제품학잡지
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
- 影响因子： 0.41
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1004-5503
- 国内刊号： 22-1197/Q
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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肺炎链球菌表面蛋白C对人嗜中性粒细胞释放CXCL8的影响
目的 原核表达肺炎链球菌表面蛋白C(Pneumococcal surface protein C,PspC),并分析该蛋白对人嗜中性粒细胞释放CXCL8的影响.方法 将重组质粒pET-32a(+)/PspC转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达TRx-His-PspC融合蛋白并纯化；通过肠激酶切掉融合蛋白的TRx-His部分,获得PspC蛋白,免疫小鼠,获得抗PspC抗体.分离人外周血嗜中性粒细胞,经MTT法检测PspC蛋白对嗜中性粒细胞增殖活力的影响；QRT-PCR检测PspC蛋白及抗PspC抗体对人嗜中性粒细胞释放CXCL8的影响.结果 表达的TRx-His-PspC融合蛋白相对分子质量约为80 000,目的蛋白约占菌体总蛋白的21％,可与His Tag McAb特异性结合.获得的PspC蛋白相对分子量约为60 000,免疫小鼠获得了高滴度的抗PspC中和抗体(1∶12 000).分离的人外周血嗜中性粒细胞纯度＞98％,活细胞比例大于96％,经不同浓度的PspC蛋白刺激人嗜中性粒细胞,不会引起宿主细胞的细胞毒作用；不同浓度的PspC蛋白刺激人嗜中性粒细胞8h后,CXCL8基因mRNA转录水平显著上调(P＜0.01),且呈剂量依赖性；CXCL8的释放均呈剂量依赖性增强(P＜0.01),且24 h高于12 h；抗PspC抗体可显著抑制PspC蛋白刺激人嗜中性粒细胞释放CXCL8.结论 PspC蛋白可上调人嗜中性粒细胞趋化因子CXCL8的合成和释放,揭示了嗜中性粒细胞和肺炎链球菌致病因素之间的关系,为控制肺炎链球菌侵入性疾病奠定了基础.
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肝X受体-β和三磷酸腺苷结合盒转运子A1在人脑胶质母细胞瘤中的表达和意义
目的 研究肝X受体-β(Liver X receptor-β,LXR-β)和三磷酸腺苷结合盒转运子A1( ATP binding cassette transport protein A1,ABCA1)蛋白在人脑胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)中的表达及相关性,并探讨其对GBM的意义.方法 分析48例GBM患者的资料,并取患者肿瘤组织石蜡切片,另取19份瘤旁正常脑组织石蜡切片为对照组,采用SP免疫组化法检测LXR-β和ABCA1蛋白的表达,并分析LXR-β与ABCA1表达的相关性.结果 LXR-β和ABCA1蛋白在GBM中的表达率分别为81.3％和77.1％,与对照组(15.8％和26.3％)相比,差异有统计学意义(P＜0.001),且LXR-β与ABCA1的表达呈正相关(rs=0.500,P＜0.05).患者性别、年龄、胶质瘤复发、手术切除范围、肿瘤大直径、术后放化疗情况与LXR-β、ABCA1蛋白的表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 LXR-3和ABCA1蛋白与GBM的形成和进展有一定关系,有可能成为临床诊断及治疗GBM的生物学指标.
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人VEGF165和小鼠VEGF164共同抗原表位分析及验证
目的 分析人VEGF165和小鼠VEGF164的共同抗原表位,为血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表位疫苗的设计和验证奠定基础.方法 分析人VEGF165和小鼠VEGF164蛋白与KDR结合的关键位点,确定其共同表位.将共同表位插入到VEGF骨架蛋白中,扩增含共同表位的骨架蛋白基因,与原核表达载体pET-24a连接,构建重组表达质粒pET-24a-FV,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Sephacryl S-100凝胶柱进行纯化,纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析.以纯化的表位展示蛋白免疫小鼠,获得免疫血清,ELISA法测定血清效价,Western blot和间接免疫荧光法检测免疫小鼠血清对小鼠VEGF164和VEGF165的识别.结果 人VEGF165和小鼠VEGF164共同抗原表位为KDR 40s loop结合区的EYPDEIEYIFKP;重组表达质粒经双酶切及测序证明构建正确；表位展示蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的20％,纯度可达92％；小鼠VEGF164和人VEGF165均能与小鼠免疫血清发生反应,血清效价达到1∶104；免疫血清不仅能识别表位展示蛋白,还能识别小鼠VEGF164和人VEGF165单体和二聚体,还可与人HeLa、小鼠B16肿瘤细胞之间存在阳性反应,表明表位展示蛋白能展示VFGF的共同抗原表位.结论 骨架蛋白展示的VEGF164和VEGF165共同表位免疫小鼠后,能产生针对这两个蛋白的特异免疫反应,证实EYPDEIEYIFKP表位是VEGF164和VEGF165的共同抗原表位.
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柯萨奇病毒A组16型G20分离株在不同培养条件下的增殖动力学
目的 探讨柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)G20分离株在不同培养条件下的增殖动力学.方法 常规培养Vero和人二倍体KMB-17细胞,待细胞长至单层,接种G20株病毒,进行病毒蚀斑试验,以0.1MOI的感染复数分别感染此两种细胞,置不同温度和pH维持液中进行培养,每2h收样1次至第24 h,以48 h收样作为对照样,微量滴定法检测病毒滴度,并绘制增殖动力学曲线.结果 G20株病毒在Vero及KMB- 17细胞中传代适应后,均可导致细胞病变.G20株病毒在此两种细胞中培养,pH6.0、pH6.5时,不同培养温度下,病毒基本不增殖；pH7.5与pH7.0的病毒增殖基本一致,增殖速度随温度呈现37℃＞ 35℃＞ 33℃的趋势；在33℃～ 37℃、pH7.0～8.0时,病毒均有不同程度的增殖；在41℃、各pH条件下,病毒增殖均明显受到限制.结论 病毒在此两种细胞中,37℃,pH7.5培养条件下,增殖速度及滴度均较理想.
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高表达ABCG2基因对人原发性肝癌细胞SP表型的影响
目的 研究高表达ABCG2基因对人原发性肝癌细胞SP表型的影响.方法 构建pMSCVpuro-ABCG2逆转录病毒质粒,并转染至病毒包装细胞PT67中,将获得的病毒上清液感染人原发性肝癌non-SP(Side population)细胞,筛选稳定感染的细胞系non-SP-ABCG2和non-SP-puro,RT-PCR法检测细胞中ABCG2基因的转录水平,Western blot法检测细胞中ABCG2蛋白的表达水平,显微镜观察细胞形态的变化,Hoechst33342染色分析细胞的SP表型.结果 逆转录病毒质粒pMSCVpuro-ABCG2经双酶切及测序证实构建正确；non-SP-ABCG2细胞中ABCG2基因的转录和蛋白表达水平均较空载体pMSCVpuro转染的细胞non-SP-puro明显提高；non-SP-ABCG2细胞的形态发生改变,成梭形生长,偶见小三角样细胞,细胞生长缓慢,细胞间排列不紧密,并出现了SP表型.结论 ABCG2基因的高表达与细胞SP表型的形成具有一定的相关性,并能影响细胞的基本形态.
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改良法氧诱导的早产儿视网膜病变动物模型的建立
目的 改良法建立氧诱导的早产儿视网膜病变动物模型,并检测视网膜组织中血管内皮生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)基因mRNA的表达.方法 将54只7日龄Wistar幼鼠随机分为空气对照组和高氧实验组,高氧实验组饲养环境维持氧气流量为0.5～0.75 L/min,氧浓度为(80±2)％,空气对照组一直处于空气中饲养.每组分别取12、14、17日龄幼鼠,经心腔灌注后,剥离视网膜,行ADP酶染色,观察幼鼠视网膜血管形态；每组分别取17日龄幼鼠,取眼杯,经HE染色计数突破视网膜内界膜的内皮细胞核数目；每组分别取12、14、17日龄幼鼠视网膜组织,经RT-PCR检测VEGFR2基因mRNA的表达.结果 ADP酶染色镜下观察可见,视网膜血管在高氧环境中收缩闭塞,在相对缺氧环境中迂曲扩张并生成大量病理性新生血管；空白对照组和高氧实验组突破视网膜内界膜的内皮细胞核数分别为2.650±0.875和31.450±0.686,两组间差异有统计学意义(P＜0.05)；高氧实验组VEGFR2基因mRNA的表达先显著下降(12日龄),后显著增加(14日、17日龄),对照组VEGFR2基因mRNA一直维持在较低水平,两组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 已成功建立了氧诱导的早产儿视网膜病变动物模型,为进一步研究下调或阻断VEGFR2的药物对ROP等新生血管疾病的疗效奠定了基础.
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α-甘露糖苷酶Ⅱ基因沉默对人胃癌BGC-823细胞增殖及凋亡的影响
目的 探讨沉默高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgi α-mannosidaseⅡ,GMⅡ)基因的表达对人胃癌BGC-823细胞增殖与凋亡的影响.方法 根据GenBank中登录的人GMⅡ基因mRNA序列及siRNA设计原则,设计了4条siRNA,并构建4个针对靶点的重组表达质粒pGPU6/GFP/Neo-1140、pGPU6/GFP/Neo-1303、pGPU6/GFP/Neo-1406和pGPU6/GFP/Neo-1817,同时合成阴性对照质粒pGPU6/GFP/Neo-shNC,经Lipofectamine 2000分别转染BGC-823细胞,通过RT-PCR及Westernblot检测转染细胞中GMⅡ基因mRNA和蛋白的表达,筛选沉默效果佳的质粒；经MTT试验、细胞周期分布分析、Hoechst33258和Annexin V-FITC/PI双染试验分别检测沉默GMⅡ基因对人BGC-823细胞增殖与凋亡的影响.结果 pGPU6/GFP/Neo- 1303组GMⅡ基因mRNA和蛋白的表达明显低于空白对照组和阴性对照组(P＜0.05),表明pGPU6/GFP/Neo-1303组沉默效果好；与空白对照组和阴性对照组相比,pGPU6/GFP/Neo- 1303组BGC-823细胞增殖抑制率明显升高(P＜0.01),G1期细胞比例明显上升(P＜0.05),S期细胞比例明显下降(P＜0.01),细胞凋亡率明显升高(P＜0.05).结论 已成功沉默BGC-823细胞中GMⅡ基因的表达,从而抑制BGC-823细胞的增殖并促进其凋亡,GMⅡ可能成为防治胃癌的新靶点.
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重组细胞中鼠细小病毒检测方法的建立及初步应用
目的 建立生物技术产品用重组细胞中鼠细小病毒(Murine minute virus,MMV)污染的检测方法,并进行验证及初步应用.方法 以NB324K细胞为指示细胞,建立MMV感染性检测方法,并以不同CCID50的MMV分别感染NB324K细胞,验证方法的灵敏度；通过设计针对编码非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)保守序列的引物和探针,建立用于重组细胞中MMV检测的实时荧光定量PCR,并对其线性、特异性、精密性、灵敏度、低检测限及试验可行性和干扰性进行验证；将NB324K细胞感染试验与荧光定量PCR法相结合,建立NB324K细胞感染-PCR法,并通过对大量样本的检测,分析荧光定量PCR法和NB324K细胞感染-PCR法的可行性.结果 NB324K细胞感染试验的灵敏度为0.2 CCID50;荧光定量PCR检测方法佳线性范围为1×108～1×104拷贝/μl,R2达0.99以上,特异性良好,与其他种属的细小病毒均无交叉反应,试验内和试验间Ct值的变异系数(CV)均小于5％,试验内病毒定量拷贝数的CV在20％～ 30％之间,试验间病毒定量拷贝数的CV在20％～50％之间,灵敏度为5×103拷贝/μl,低感染性病毒颗粒检测限为2 CCID50.该方法能够用于细胞样品中MMV的检测,部分样品基质对病毒的检测具有一定的干扰性.NB324K细胞感染-PCR法的灵敏度为0.02 CCID50,检测时间可缩短为96 h,与荧光定量PCR法分别对47份样品进行检测,结果均为阴性.结论 成功建立了MMV荧光定量PCR检测方法和NB324K细胞感染-PCR法,可应用于重组细胞中MMV污染的检测,为进一步提高生产用重组细胞的安全性奠定了基础.
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两种非侵入性评估红细胞成分血血容量方法的建立及应用
目的 建立两种非侵入性评估红细胞成分血血容量的方法,为准确评估红细胞成分血血容量提供参考.方法 检测130袋红细胞成分血的净重量及容量,计算平均血液密度,对血净重量及容量进行相关性及线性回归分析,建立回归方程；利用血液平均密度与血净重量,建立血容量计算方程.利用上述两种方程,对100袋红细胞成分血进行检测与分析,由血净重量计算出血容量作为预期值,以实际检测出的血容量作为观察值,经t检验,分析其观察值与预期值有无显著差异,以证实该方法的可靠性.结果 130袋红细胞成分血的净重量与容量呈正相关(r=0.998,P＜0.01),线性回归方程为y=0.9423x-2.394 1(r2=0.996,d.f=128,F=29 819.8,P＜0.01);130例袋红细胞成分血的平均密度为1.072 8,血容量计算方程为y=0.932 2 x；100袋红细胞成分血血容量的预期值与观察值比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 已成功建立了评估红细胞成分血血容量的两种方法,该方法操作简便、安全,结果可靠,可在输血实践中推广应用.
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牛乳中副结核分枝杆菌套式PCR检测方法的建立
目的 建立牛乳中副结核分枝杆菌套式PCR检测方法,以便快速检测牛奶中副结核分枝杆菌 方法 在制备的液体培养基中培养副结核分枝杆菌T、P18、P10,提取基因组DNA,应用DNAstar引物设计软件,根据副结核分枝杆菌独特的稳定性插入片段IS900设计内、外引物,建立检测牛乳中副结核分枝杆菌的套式PCR方法,并对该法的敏感性、特异性进行验证.结果 用所建立的方法已成功扩增出目的基因,大小与预期一致；该法的敏感性为102个细菌/ml,特异性试验结果显示,除含副结核分枝杆菌的乳样为阳性外,含其他细菌的乳样均为阴性,表明本方法特异性强.结论 已成功建立套式PCR检测方法,可用于牛乳中副结核分枝杆菌的检测.
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酿酒酵母残留蛋白ELISA定量检测方法的建立
目的 建立酿酒酵母残留蛋白(Host cell protein,HCP)ELISA定量检测方法,为重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)及相关生物制品的质量控制提供依据.方法 制备酿酒酵母全细胞蛋白参考品,以其为抗原,免疫家兔,采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,SDS-PAGE分析纯度,免疫双向扩散法测定抗体效价,Western blot法分析抗体的特异性.以制备的抗酿酒酵母多克隆抗体作为包被抗体,HRP标记的抗酿酒酵母多克隆抗体作为检测抗体,建立酿酒酵母抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法；梯度稀释酿酒酵母蛋白抗原参考品,并绘制标准曲线,确定该方法的线性范围及检测限,并进行特异性、准确度、精密度及适用性验证.结果 共制备3批酿酒酵母抗原蛋白,其平均含量分别为1.61、1.64和1.63 mg/ml;纯化的IgG抗体纯度为91.7％,抗体效价为1∶64,能与酿酒酵母蛋白多数条带结合；酿酒酵母蛋白抗原浓度在6.25 ～ 200 ng/ ml的范围内,线性关系良好(R2＞0.99),低检测限为6.25 ng/ml;用建立的方法检测小牛血清、人血白蛋白、MEM培养基、Vero细胞上清蛋白、Vero细胞乙型脑炎疫苗及PHK细胞狂犬疫苗,均无交叉反应,特异性良好；检测不同浓度的抗原回收率为97.6％～107.00％,变异系数均＜10％,低定量检测限为25 ng/ml;检测3批酿酒酵母重组乙型肝炎疫苗生产各工序中酿酒酵母蛋白的残留量,能有效反映杂蛋白去除率.结论 成功建立了酿酒酵母HCP双抗体夹心ELISA定量检测方法,该方法特异性强,精密度及准确度良好,可用于生物制品中酿酒酵母HCP的检测.
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响应面法优化胶原蛋白发酵培养基和培养条件
目的 利用统计学方法对重组大肠杆菌发酵培养基进行优化,提高胶原蛋白产量.方法 应用 Plackett-Burman试验设计法和响应面法,对发酵培养基6种组分配比和2个初始发酵条件进行优化；用Design-Expert软件对实验数据进行多元回归分析,并建立3种主要因素(葡萄糖、混合氮源和K2HPO4)与胶原蛋白产量之间的函数关系.用终优化的配方进行5次验证试验.结果 培养基3个佳浓度为:葡萄糖为14.69 g/L、混合氮源为15.04 g/L、K2HPO4为11.91g/L,胶原蛋白表达率可达33.95％.5次验证试验所测得的胶原蛋白平均表达率为34.02％,与预测结果基本一致.结论 优化的重组大肠杆菌发酵培养基可显著提高胶原蛋白产量.
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成像毛细管等电聚焦电泳分析糖蛋白类生物技术药物
目的 建立成像毛细管等电聚焦电泳分析糖白蛋类生物技术药物的异构体和等电点的方法.方法 应用优化的成像毛细管等电聚焦电泳技术,对3种糖蛋白类生物技术药物即聚乙二醇化重组人促红素(PEGlysated erythropoietin,PEG-EPO)、重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体(Recombinant human TNK mutant of tissue type plasminogen activator,rhTNK-tPA)和全人源化单抗A的异构体和等电点进行分析.结果 采用优化的成像毛细管等电聚焦电泳技术,可较好地分析PEG-EPO、rhTNK-tPA和全人源化单抗A的等电点和异构体,该方法可靠、快速,具有较好的分离度和重现性.结论 成像毛细管等电聚焦电泳技术可用于分析糖蛋白类生物技术药物的异构体和等电点,为保证糖蛋白类生物技术药物生产工艺的稳定性及质量控制提供了有效手段.
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原料血浆及血液制品中人细小病毒B19 DNA的检测
目的 检测我国原料血浆及血液制品中人细小病毒B19( Human parvovirus B 19)的污染情况 方法 在B19基因组编码区的高度保守区2 000 ～2 300 bp之间设计PCR引物探针,采用荧光定量PCR法检测单人份血浆、生产用混合血浆、静注人免疫球蛋白、人纤维蛋白原、人凝血因子Ⅷ及人凝血酶原复合物中的B19病毒DNA.结果 单人份血浆、生产用混合血浆、静注人免疫球蛋白、人纤维蛋白原、人凝血因子Ⅷ和人凝血酶原复合物的B19病毒DNA阳性率分别为0.092％、82.41％、0、45.83％、67.86％和78.79％.结论 我国原料血浆及血液制品中B19病毒的污染情况略低于国外文献报道,可能与试剂盒的灵敏度及样本量有关,有必要对国内的相关制品作进一步的跟踪.
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植物DNA甲基化与逆境响应
在逆境胁迫下,植物会根据自身需要调节信号传导途径,从而上调(启动)或下调(关闭)基因表达以确保自身的适应性生长及发育.近年研究显示,植物DNA甲基化变异在响应逆境胁迫过程中发挥着重要作用,生物逆境和非生物逆境都可使植物的甲基化状态发生调控性改变,从而使植物在一定程度上适应和抵抗逆境伤害.本文对植物DNA甲基化及逆境胁迫下甲基化变异方面的研究进展作一综述.
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调节性树突状细胞在免疫相关性疾病中的研究进展
树突状细胞(Dendritic cell,DC)是机体免疫系统中一组形态和功能异质性的专职抗原提呈细胞,其既能启动初始免疫应答,也能负向调节免疫反应.具有负向调节免疫应答功能的树突状细胞称为调节性DC(Regulatory DC,DCreg).DCreg在某些感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等的发生发展过程中起重要作用,也有望在临床中成为重要的治疗工具.DCreg的分化与细胞所处的微环境有关,结合微环境研究DCreg才能客观地反应机体免疫功能的真实状态.本文就DCreg分化的微环境、血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)诱导的DCreg(DCVIP)以及部分DCreg在免疫相关性疾病中的临床意义等方面的新研究进展作一综述.
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变应原疫苗的研究进展
变态反应疾病已成为当今全球关注的重要公共卫生问题.应用变应原疫苗进行特异性免疫治疗为目前变态反应疾病有效的疗法之一.近年来,随着生物技术的发展,变应原疫苗的研究也取得了相应的进展.本文就变应原疫苗的作用机理、分类及标准化和质量控制的研究进展作一综述.
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Ipr1DNA疫苗诱导BALB/c小鼠免疫应答的探讨
目的 构建真核表达质粒pBud-Iprl-OriM,探讨其诱导BALB/c小鼠的免疫应答,为新型结核病疫苗的研制提供新思路.方法 将鼠胞内病原体抗性基因1(Intracellular pathogen resistance,Ipr1)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的复制子OriM插入真核表达质粒pBudCE4.1,构建pBud-Ipr1-OriM表达质粒(Ipr1DNA疫苗)；将BALB/c小鼠随机分为4组:生理盐水对照组、BCG组、pBud-OriM组及pBud-Ipr1-OriM组,pBud-OriM组及pBud-Ipr1-OriM组经肌肉注射免疫相应的重组质粒,BCG组经背部皮内注射BCG,每隔2周注射1次,共3次；末次免疫后2周,处死小鼠,分离血清,采用ELISA法检测小鼠血清中IL-12和IFNγ的水平；取脾组织,采用流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞数量,同时观察肺脾组织的病理学变化.结果 经酶切、测序鉴定证实,重组真核表达质粒pBud-Ipr1-OriM(Ipr1DNA疫苗)构建成功；pBud-Ipr1-OriM组免疫小鼠血清中IL-12水平及小鼠脾组织中CD4+和CD8+T细胞数量均高于其他组,肺脾组织未见病理学改变.结论 Ipr1DNA疫苗能有效诱导BALB/c小鼠的细胞免疫应答,为新型结核病疫苗的研制奠定了基础.
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红豆杉醇提物作为流感疫苗佐剂的免疫效果及安全性
目的 探讨红豆杉醇提物作为H3N2流感病毒灭活疫苗佐剂对小鼠的免疫原性及安全性.方法 将ICR小鼠随机分为5组,每组7只,醇提红豆杉佐剂组:含血凝素1.2 μg,红豆杉醇提物0.2 mg;水提红豆杉佐剂组:含血凝素1.2μg,红豆杉水提物0.2 mg[3];铝佐剂对照组:含氢氧化铝0.2 mg,血凝素1.2μg;疫苗对照组:含血凝素1.2μg;空白对照组:注射生理盐水0.2ml.分别于0、21d经腿部肌肉注射免疫2次,每次0.2ml/只,初免后每隔7d采血,收集血清,检测血凝抑制(HI)抗体效价,于初免后l、21、70 d观察各组小鼠的体重变化,并测定红豆杉醇提物的小鼠半数致死量(LD50).结果 醇提红豆杉佐剂组各时间点的小鼠血清HI抗体效价均高于疫苗对照组,在28 d时,含佐剂疫苗组的抗体效价均高于单独疫苗组,醇提红豆杉佐剂组的抗体产生先于铝佐剂对照组；各组小鼠体重增长差异无统计学意义(P＞0.05)；红豆杉醇提物的LD5o值为577.93 mg/kg.结论红豆杉醇提物作为流感疫苗佐剂具有良好的安全性及有效性,有望成为流感灭活疫苗的新型免疫佐剂.
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HIV-1 DNA疫苗的免疫效价及其与免疫剂量的相关性
目的 研究HIV-1DNA疫苗的免疫效价及不同剂量HIV-1DNA疫苗对小鼠诱导免疫反应的影响.方法 将80只BALB/c小鼠随机分为8组,每组10只,分别为对照组(pDRVIl.0空载体,100 μg)、DNA疫苗pENV 3.125、6.25、12.5、25、50、100和200 μg组,经小鼠胫骨前肌注射,100μ1/只,每隔2周免疫1次,共3次.采用ELISA法检测小鼠血清抗体反应,并计算抗体阳转率；ELISPOT法检测小鼠T细胞免疫反应,并计算阳转率.结果 高剂量组抗体反应仅25 μg与100 μg组之间差异有统计学意义(P＜0.05),其他高剂量组间及低剂量各组间差异均无统计学意义(P＞0.05),而各疫苗组抗体阳转率总体之间差异有统计学意义(P＜0.01).高剂量组细胞免疫反应强度之间差异无统计学意义(P＞0.05),且比低剂量组更趋稳定.DNA疫苗诱导的抗体和细胞免疫反应均随免疫剂量的增加而增加,且呈正相关.当疫苗剂量达到100 μg时,均达高反应强度.结论 HIV-1DNA疫苗25 μg免疫剂量对BALB/c小鼠可能是适当的免疫剂量.在选择临床或临床前试验免疫剂量时,使用统计学无差异的低剂量可能免疫效果更好.
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Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在CHO细胞中的表达及其免疫学特性
目的 在CHO细胞中表达Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus-2,HSV-2)糖蛋白D( Glycoprotein D,gD),并检测其免疫学特性.方法采用Vero细胞培养HSV-2,提取总DNA,以其为模板,PCR扩增gD基因,与pCMV-sport载体连接,构建重组表达质粒pCMV-gD,将质粒pCMV-gD转染COS-7和CHO-K1细胞,并进行表达.亲和胶Anti-flag M2 Agarose纯化表达蛋白,经SDS-PAGE和HPLC分析重组蛋白纯度,Western blot分析蛋白反应原性,全波长扫描分析蛋白的光谱曲线,等电聚焦电泳测定蛋白的等电点.以20、40 μg纯化的gD免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清中HSV-2 gD特异性抗体水平,中和试验测定小鼠血清中和抗体水平.结果 酶切鉴定及DNA测序表明,重组表达质粒pCMV-gD构建正确,在COS-7细胞的瞬时表达产物和CHO细胞中的稳定表达产物均可被HSV-2 gD单抗特异性识别,表明该蛋白具有较好的反应原性.纯化的gD在相对分子质量约5 500处可见目的蛋白条带,纯度为65.46％;保留天然HSV-2 gD的反应原性,适紫外吸收波长为275.50 nm,等电点为8.3.gD 20μg组和40 μg组小鼠血清特异性抗体滴度分别为1∶125 000和1∶16 000,中和抗体滴度分别为1∶17和1∶16,表明gD可诱导中和抗体的产生,也可诱导高滴度的HSV-2gD特异性抗体.结论 成功在CHO细胞中稳定表达了HSV-2 gD,表达的HSV-2 gD具有较好的免疫原性,为基因工程疫苗的开发奠定了基础.
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氢氧化铝佐剂对肠道病毒71型灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的影响
目的 评价氢氧化铝佐剂对肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的影响.方法 用含铝佐剂及无佐剂EV71灭活疫苗免疫BALB/c小鼠,并设生理盐水对照组.于加强免疫后7d采血,进行小鼠脾单个核细胞( Mononuclear cell,MNC)的分离及CD8+T细胞的去除,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测经EV71疫苗原液或VP2-36刺激后的小鼠脾MNC分泌IFNγ水平；应用液相芯片技术(LUMINEX)检测经EV71疫苗原液刺激后的小鼠脾MNC分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10水平；采用体外微量中和试验法检测小鼠血清中和抗体效价.结果 BALB/c小鼠经2次免疫后,铝佐剂疫苗组小鼠脾MNC的IFNy SFC值显著高于无佐剂疫苗组(P均＜0.05)；铝佐剂疫苗组分泌IL-6和IL-10水平显著高于无佐剂疫苗组(P均＜0.05)；铝佐剂与无佐剂疫苗组小鼠血清EV71中和抗体阳转率均达到100％,铝佐剂疫苗组诱导的中和抗体效价显著高于无佐剂疫苗组(P＜0.01).结论 EV71灭活疫苗可诱导BALB/c小鼠产生特异性IFNy、IL-2、IL-6和IL-10应答,铝佐剂可同时增强EV71灭活疫苗的Th1和Th2类免疫应答.
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C群脑膜炎球菌结合疫苗的工艺稳定性及其免疫原性
目的 研究C群脑膜炎球菌荚膜多糖(Group C meningococcal polysaccharide,GCMP)与破伤风类毒素(Tetanustoxoid,TT)结合疫苗的工艺稳定性及其免疫原性.方法 以己二酸二酰肼(ADH)作为间隔剂,碳二亚胺(EDAC)为缩合剂,扩大量制备8批GCMP-TT结合物,以生化、免疫学方法分析8批GCMP-AH衍生物和GCMP-TT结合物的主要特性；将8批GCMP-TT结合物分别免疫NIH小鼠,ELISA法检测小鼠血清中特异性抗GCMP和抗TT的IgG抗体,分析其免疫原性.结果 8批GCMP-AH衍生物及GCMP-TT结合物各项生化检测指标基本一致,批间差异较小,均达到《欧洲药典》的规程(7.0版)要求,并具有良好的抗原性.免疫小鼠的血清中均产生了较高水平的抗GCMP和抗TT的特异性IgG抗体,与GCMP产生的特异性IgG抗体相比,差异有统计学意义(P＜0.001);GCMP-TT结合疫苗第2针、第3针与第1针相比,免疫后产生的IgG抗体水平差异均有统计学意义(P＜0.001).结论 GCMP-TT结合疫苗的制备工艺稳定、可靠,具有良好的免疫原性,并可诱导免疫记忆,为脑膜炎球菌结合疫苗的规模化生产提供了重要的实验依据.
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H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒的构建及鉴定
目的 构建H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,并进行鉴定.方法 PCR扩增H1N1亚型流感病毒(A/PR/8/34)全长M1基因,与pFastBacdual(pFBD)载体连接,构建重组杆状病毒转移载体pFBD-M1,转化含有Bacimd和Helper 质粒的DH10Bac感受态细胞,获得骨架质粒rBacmid-M1,将其转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1.采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测M1基因的插入,间接免疫荧光、Western blot和ELISA法检测M1蛋白的表达.结果 重组杆状病毒骨架质粒rBacmid-Ml经PCR鉴定证实构建正确；第3代rBac-M1病毒滴度为3×108 pfu/ml;感染rBac-Ml的sf9细胞经PCR扩增可见3 300 bp的条带,间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光,Western blot检测可与鼠抗流感病毒(PR8)和鼠抗M1蛋白(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,ELISA检测M1蛋白可与鼠抗流感病毒(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性.结论 已成功构建了H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,为进一步研究流感病毒M1的功能及新型流感疫苗开发奠定了基础.
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抗CD20人源化单克隆抗体的急性毒性评价
目的 评价抗CD20人源化单克隆抗体SM09的急性毒性.方法 将食蟹猴随机分为阴性对照组、SM09 10、30和100 mg/kg剂量组,采用注射泵前臂静脉缓慢注射单次给药,阴性对照组给予等体积的生理盐水,于给药前和给药后不同时间进行各项毒理学指标检测.结果 食蟹猴注射SM09,在给药速度达600mg/h时,动物未见明显异常反应；给药后各剂量组动物临床症状、体重、进食量、体温、心电图、血压、血清生化指标均未见明显异常；血液学检测结果显示,100 mg/kg剂量组动物白细胞数量出现一过性降低；给药后第2天,各剂量组动物外周血CD20+B淋巴细胞数量即明显降低,B细胞表现出耗竭状态,给药后3～8周,B细胞水平逐渐回复,且呈剂量相关性.给药后8周剖检,100 mg/kg剂量组雌性动物脾脏呈暗红色且体积增大,镜检可见红髓扩张充血和脾小体数量减少.结论 食蟹猴单次静脉注射抗CD20单抗,具有良好的耐受性,除与药理作用相关的外周血B细胞清除效应外,未见其他毒性反应,大耐受剂量可达100 mg/kg.
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金黄葡萄球菌肠毒素C2对小鼠移植瘤的抑制作用
目的 采用小鼠移植瘤模型,对金黄葡萄球菌肠毒素C2的抗肿瘤作用进行研究,以进一步揭示超抗原在肿瘤治疗方面的意义.方法 从金葡菌发酵液中提纯SEC2蛋白,并经SDS-PAGE及测序分析；构建小鼠S180肉瘤和Lewis肺癌移植瘤模型,分别腹腔注射高、中、低剂量(800、400、200 ng/kg)的SEC2,连续给药10 d,同时以环磷酰胺为阳性对照,生理盐水为阴性对照.于给药后第11天处死小鼠,将肿瘤组织分离并称重,比较SEC2对S180肉瘤及Lewis肺癌移植瘤的抑瘤效果.结果 在相对分子质量约30 000处可见目的条带,与理论值相符,N-未端氨基酸测序与文献报道一致；SEC2对两种移植瘤均产生较明显抑制作用,高、中、低剂量SEC2对S180肉瘤的抑瘤率分别达到50.60％、31.81％和19.38％,对Lewis肺癌的抑瘤率分别达到55.62％、45.70％和37.78％.结论 从动物水平上确认了SEC2的抑瘤效果,为进一步开展超抗原抗肿瘤研究奠定了基础.
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白藜芦醇对脓毒症大鼠急性肺损伤的保护作用及对巨噬细胞炎症蛋白-2、IL-10、IL-18表达的影响
目的 研究白藜芦醇( Resveratrol,Res)对脓毒症大鼠急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)的保护作用及对ALI大鼠肺组织中巨噬细胞炎症蛋白-2(Macrophage inflammatory protein,MIP-2)、白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)和白细胞介素-18 (Interleukin- 18,IL-18)表达的影响.方法 将SD大鼠随机分为空白对照组(Con组)、假手术组(Sham组)、脓毒症组(Sep组)和白藜芦醇组(Res组).采用盲肠结扎穿刺术(Cecal ligation and puncture,CLP)制备脓毒症相关性ALI大鼠模型,造模24 h后,Res组给予0.3 ml/100 g的Res液,Con、Sham和Sep组给予等量生理盐水,均经尾静脉注射.各组分别于0、6、12、24和48 h,取大鼠肺组织,HE染色观察病理形态学变化,计算肺湿重/干重比值(W/D)；ELISA法检测各组大鼠血浆中MIP-2、IL-10和IL-18含量；Western blot法检测各组大鼠肺组织中MIP-2、IL-10和IL-18蛋白的表达水平.结果 Res组在造模后12 h,肺组织病理变化与Sep组相比有所减轻,48 h Res作用达到强,各种病理改变明显减轻,部分肺组织开始接近正常形态；肺组织W/D比值与Sep组相比均明显降低(P＜0.05)；Res组在12、24和48 h MIP-2水平均明显低于同时间点Sep组(P＜0.05),在24和48 h IL-10水平明显低于同时间点Sep组(P＜0.05),12、24和48 h IL-18水平明显低于同时间点Sep组(P＜0.05).Western blot结果显示,造模后24 h,Res组MIP-2、IL-10和IL-18蛋白表达水平明显低于Sep组(P＜0.05).结论 白藜芦醇能有效减轻脓毒症所致ALI,作用与抑制MIP-2、IL-10和IL-18的过度表达,实现内稳态有关.
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国产流感病毒亚单位疫苗的安全性及免疫原性
目的 观察国产流感病毒亚单位疫苗的安全性及免疫原性.方法 按照单盲法、随机、对照的原则,将900名观察对象分为幼儿组、儿童组、成人组和老年组,各组分别按2∶1的比例随机接种试验疫苗和对照疫苗(进口疫苗),观察各组接种后的全身反应、局部反应和其他不良反应以及免疫后HI抗体阳转率、保护率和GMT增长倍数.结果 观察组接种后全身反应发生率为8.33％,仅1例发生局部反应,不同年龄人群全身反应发生率与对照组相比,差异均无统计学意义(P＞0.05)；免疫后观察组H1N1、H3N2和B(亚)型HI抗体总阳转率分别为87.90％、70.02％和71.32％,保护率分别为93.30％、93.30％和74.67％,与对照组相比,差异均无统计学意义(P＞0.05);GMT增长倍数分别为31.6、8.2和14.0,除H1N1亚型GMT平均增长倍数高于对照组外,其他两(亚)型与对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 国产流感病毒亚单位疫苗具有与进口同类疫苗相似的安全性和免疫原性.
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核输入受体蛋白在子宫内膜异位症和子宫内膜癌中的表达
目的 探讨核输入受体蛋白13( Importin 13,IPO13)在子宫内膜异位症和子宫内膜癌中的表达及其临床意义.方法 随机选取20份正常增殖期子宫内膜和20份正常分泌期子宫内膜标本为对照组A、B,20例子宫内膜异位症和20例子宫内膜癌患者的子宫内膜标本为实验组C、D.采用免疫组化法检测IPO13在各组中是否表达；免疫荧光法检测IPO13和干/祖细胞标记在各组中的共表达；荧光定量PCR法检测各组中IPO13基因mRNA转录水平；Western blot法检测IPO13蛋白在各组中的表达水平.结果 IPO13在各组子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的胞浆及胞核中均有表达.对照组B的IPO13阳性细胞数明显低于对照组A和实验组(P＜0.01).IPO13与CD34、CD45、端粒酶、OCT4、C-KIT、PDGF-Rβ、CD90和CD146共表达于各组子宫内膜的上皮细胞和间质细胞；实验组及对照组A的IPO13基因mRNA和IPO13蛋白表达量明显高于对照组B(P＜0.01).结论 IPO13在正常子宫内膜中有表达,且增殖期表达高于分泌期；在子宫内膜异位症和子宫内膜癌中的表达明显高于正常分泌期子宫内膜,此结果可能与子宫内膜干/祖细胞的表达异常相关；IPO13可作为子宫内膜干/祖细胞的一个候选的标记.
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一起院内医务人员百日咳聚集性发病的流行病学调查
2010年9月天津市河北区某医院发生一起院内医务人员百日咳聚集性发病,经实验室血清学及鼻咽拭子检查,4人被确诊,为多年来少见的典型院内聚集性病例.为研究其传播机理,我中心开展了回顾性流行病学调查,并进行了实验室检测.
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转录因子7样2基因rs290487-T/C多态性与2型糖尿病患者胰岛素抵抗的相关性
目的 探讨我国沈阳地区汉族人群中转录因子7样2(Transcription factor 7-like 2,TCF7L2)基因rs290487-T/C单核苷酸多态性与2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者胰岛素抵抗的相关性.方法 选择224例T2DM患者,提取其外周血基因组DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)对其TCF7L2基因rs290487位点进行基因分型,同时检测各项临床指标,并分析其与TCF7L2基因rs290487-T/C多态性的相关性.结果 T2DM患者组rs290487位点CT+CC基因型的胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)、胰岛素β细胞功能指数(Homeostasis model assessment of Beta cell function index,HOMA-β)及空腹胰岛素(Fasting insulin,FINS)均高于TT基因型,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 沈阳地区汉族人群TCF7L2基因rs290487位点的多态性与T2DM患者胰岛素抵抗相关,为T2DM的病因学研究提供了新的思路.
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戊型肝炎病毒重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒的制备
目的 制备戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒.方法 以4型HEV ORF2重组蛋白P179免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法进行克隆化培养,制备腹水,并对杂交瘤细胞进行染色体计数,鉴定单抗亚类及特异性、并检测稳定性；经SDS-PAGE分析抗体纯度,以免抗179抗原多抗作为包被抗体,HRP标记P179单抗作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,制备试剂盒,并进行佳线性范围测定、准确性、精密性和稳定性验证.结果 获得4株能稳定分泌抗P179抗原单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3A10、3F8、4E9和5G6,腹水抗体效价分别为1∶10-7、1∶10-6、1∶10-6和1∶10-7,染色体数分别为96、98、101和99条；亚类分别为IgG2a、IgG2a、IgG1和IgG2b;4株单抗连续传代3个月,液氮冻存1年抗体效价未发生变化；制备的试剂盒有良好的线性(R2＞0.950 0)、准确性、精密性,试验内变异系数为4.17％～6.26％,回收率在87.9％ ～ 114.8％之间,试验间变异系数为5.82％～8.01％,回收率在90.8％ ～ 108.9％之间；于37℃及4℃放置3d,仍具有良好的稳定性.结论 成功制备了戊型肝炎病毒P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒,可用于戊型肝炎疫苗生产中定量检测疫苗抗原.
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ABO血型反定型试剂质控方法和质量标准的建立
目的 建立ABO血型反定型试剂的质控方法和质量标准.方法 用抗P、抗M、抗N、抗C、抗c、抗E、抗e试剂检测O型血浆样本,选择分别与抗P、抗M、抗C、抗e试剂反应呈(卅)强阳性样本,和与抗P、抗N、抗c、抗E试剂反应呈(卅)强阳性样本各2份,配制ABO血型反定型用O型细胞.分别对两个厂家提供的和自制的ABO血型反定型用O型细胞进行抗原性检测,同时进行外观、特异性、ABH抗原性、亲和力、溶血率、稳定性检测,并检测35份含IgM类不规则抗体的阳性血浆样本,对比检出率.结果 自制的ABO血型反定型用O型细胞与抗P、抗M、抗N、抗C、抗c、抗E、抗e试剂反应均呈++以上,而其他两个厂家提供的ABO血型反定型试剂均有部分抗体漏检；外观、特异性、ABH抗原性、亲和力、溶血率、稳定性检测均无明显差异,符合相关要求；自制的ABO血型反定型用O型细胞可检出所有IgM类不规则抗体,无漏检,而其他两个厂家提供的ABO血型反定型试剂均有部分血浆样本漏检.结论 本研究建立的质控方法和质量标准适用于IgM类不规则抗体的检出.
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WHO新版疫苗批签发指导原则介绍
世界卫生组织(World Health Organization,WHO)疫苗批签发指导原则(Guidelines for Independent Lot Release of Vaccines by Regulatory Authorities)历经3年,在广泛征求来自不同国家的国家监管部门(National Regulatory Authority,NRA)、国家检定实验室(National Control Laboratory,NCL)、疫苗生产商和研究部门代表以及生物制品标准化专家委员会(Expert Committee on Biological Standardization,ECBS)专家组的意见和建议基础上达成了共识.该指导原则经专家委员会审议后,发表在WHO的技术报告中.
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我国无细胞百白破联合疫苗中百日咳疫苗的批签发及效力试验的回顾性分析
现在几乎全世界都在实施百日咳疫苗的免疫接种,但百日咳仍然是威胁人类健康的重要传染病之一,也是导致婴幼儿死亡的主要原因之一[1].目前,百白破联合疫苗包括全细胞百白破联合疫苗( DTwP)和无细胞百白破联合疫苗(DTaP),前者于1948年研制成功,其百日咳部分为全菌体灭活后制成.全细胞百日咳疫苗接种后副反应大,日本于1981年率先研制无细胞百日咳疫苗[2].
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实时荧光定量PCR产品质量标准要点分析
自1985年问世以来,PCR技术以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物学等领域得到了广泛的应用.近年来出现的核酸定量PCR技术,尤其是实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)技术,实现了PCR从定性到定量的飞跃,以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为分子生物学研究、医学研究和疾病诊断中的重要工具.
| 年 | 期数 |
| 2019 | 01 02 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 |
| 2000 | 01 02 03 04 |
