百日咳毒素S1亚单位的表达及其免疫原性研究

目的研究百日咳毒素S1(Pertussistoxin S1 subunit)亚单位在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性.方法采用PCR法从百日咳杆菌染色体中获得S1亚单位的结构基因并克隆到质粒pCR2.1-TOPO中,转化宿主菌DH5α和TOP010.用抗S1的单抗1B7检测表达产物.用粗制的重组S1(rS1)免疫小鼠,做主动免疫保护实验.rS1免疫家兔,检测rS1的免疫原性.并以家兔免疫血清在小鼠进行被动免疫保护实验.结果rS1可在大肠杆菌中稳定高效表达,表达量分别占细胞总蛋白量的14%(DH5α)和24.2%(TOPO10).rS1能被1B7识别,在小鼠主动免疫实验中,保护率可达56.3%.家兔免疫血清ELISA效价为1:32 000.抗rS1血清对小鼠被动的免疫保护率为100%.结论rS1具有良好免疫原性,为百日咳基因工程疫苗或亚单位疫苗研制及百日咳免疫机理研究提供了依据.

病毒灭活后抗淋巴细胞免疫球蛋白的稳定性

目的观察经过病毒灭活后抗淋巴细胞免疫球蛋白(ALC)的稳定性.方法取各项指标均符合国家暂行规程要求的ALG放2～8℃保存,在不同时间进行质量测试.结果24个月时,制品的花环抑制效价仍不低于1:4 000,淋巴细胞毒效价不低于1:1 000.其纯度和IgG各组分含量与试验之前相比,差异元显著意义,且其他各项主要指标也均达到国家制检规程的标准.结论经过病毒灭活后制品的稳定性良好.

HCV核心区全基因片段的表达及产物抗原活性分析

目的表达并纯化核心基因全片段,以得到良好特异性的核心蛋白.方法自克隆载体pUC19/HCV-C中切下核心基因全片段,将其插入带有His 6纯化标签的融合表达质粒pTrcHisA中,转化人大肠杆菌,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE、中和抑制ELISA和Western blot对占菌体总蛋白15%以上的表达产物进行鉴定,用IMAC一步法纯化,纯化产物检测HCV阴阳性血清标本,并与日本东燃公司核心抗原C11检测结果进行比较.结果核心基因全片段插入pTrcHisA载体,转化入大肠杆菌TOP10后构建成功稳定的表达株PTrcHisA/HCV-C/TOP10,用纯化产物检测血清标本,与日本东燃公司核心抗原C11检测结果的阳性均值与阴性均值之比及A值分布基本相同.结论表达抗原具有良好的免疫反应性和特异性.

视网膜色素上皮细胞培养及其超微结构的观察

目的体外培养视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium RPE)细胞并对其进行超微结构观察,为RPE细胞在细胞和分子水平研究奠定基础.方法采用酶消化法对RPE细胞进行取材和培养,利用光镜和电镜进行观察及分析.结果培养的细胞贴壁生长,融合后呈单层、镶嵌式排列;电镜下可见到细胞表面绒毛、细胞之间复合体、细胞间质少及细胞排列紧密等上皮组织的特征性结构,细胞内可直接观察到大量黑色素颗粒.结论为各种损伤致RPE细胞形态学改变的研究奠定了基础.

导向性人干扰素α2a工程菌生物学特性的稳定性

目的全面观察了解pBV220-IFNN/DH5α工程菌生物学特性的稳定性.方法工程菌菌株连续传至50代后,进行质粒性状、扫描电镜观察、干扰素表达水平、革兰氏染色及各项生化反应检测.结果pBV220-IF-NN/DH5α工程菌呈现典型的大肠杆菌形态,各代次菌的各项检测结果与原始菌种差异无显著意义.结论该菌种可作为生产用菌种.

血红蛋白类红细胞代用品理化性质的色谱分析

目的建立血红蛋白类红细胞代用品的色谱分析方法.方法通过高效液相系统与二极管矩阵检测器、多角度激光散射检测器和蒸发光散射检测器进行组合,检测聚乙二醇(PEG)化牛血红蛋白(PEG-bHb)的色谱纯度、相对分子质量分布和磷脂含量.结果PEG-bHb为多位点不均一修饰的混合物,数均相对分子质量为1.211×105,重均相对分子质量为1.347×105,残余磷脂含量低于1μg/ml.结论色谱分析方法是进行血红蛋白类红细胞代用品理化性质分析的适宜方法.

125 Ⅰ标记rLTB-UreB及口服BALB/c小鼠示踪实验研究

目的观察125Ⅰ标记基因重组融合蛋白LTB-UreB灌喂BALB/c小鼠后的体内分布.方法采用氯胺T氧化法标记rLTB-UreB,Sephadex-G25凝胶过滤纯化,纸层析鉴定放射化学纯度及比活度.将BALB/c小鼠随机分为PBS口服空白对照组、Na125Ⅰ口服对照组和125Ⅰ-rLTB-UreB实验组,于不同时间采集标本,γ放射计数器检测CPM(每分钟计数值),SPSS分析结果.结果纯化后的标记蛋白纯度＞90%.实验组PP结和肠系膜淋巴结CPM升高,与对照组比较差异有非常显著意义.结论125Ⅰ标记融合蛋白口服后可在肠道粘膜下淋巴组织沉积,为融合蛋白作为幽门螺杆菌口服疫苗候选抗原提供重要实验依据.

应用酚-硫酸法测定结核菌素纯蛋白衍化物的糖含量

目的分析酚-硫酸法测定结核菌素纯蛋白衍生物糖含量的可行性.方法利用糖与酚-硫酸试剂反应产生棕黄色,在487nm波长处有大吸收峰,吸光度与糖浓度呈线性关系,测TB-PPD的糖含量.结果吸光度与糖含量的线性范围为10～100μg/ml(r=0.9998),相对标准差为1.4%,平均回收率为98%.结论该方法简便、快速、准确,适用于TB-PPD糖含量测定.

血浆制品中Triton X-100残留量测定方法的建立

目的建立血浆(SD法病毒灭活)中Triton X-100残留量测定方法.方法采用新型Oasis固相提取小柱进行样品预处理,用反相SymmetryShield RP18色谱柱的HPLC方法检测SD灭活法血浆中Triton X-100残留量,并对该方法进行讨论.结果用固相提取方法可获得良好的回收率(99.2%),检测限达到1.0ppm,检测精度CV值为3.04%.结论该方法快速、简便、准确,重现性好,可作为实验室SD病毒灭活血浆中Triton X-100检测方法.

乙型肝炎免疫实施方案及效果考核

目的评价乙型肝炎疫苗免疫实施方案和远期效果.方法考核乙肝疫苗接种率、及时率、孕妇HBV筛检率和阳性率,并对1986年出生时接种乙肝疫苗的对象随访采血,检测HBsAg、抗-HBs、抗-HBc.并设免前本区及邻区乙肝疫苗未免疫者为内、外对照.结果免后14年HBsAg阳性率在1%以下,与内、外对照相比下降幅度达90%,远期保护效果为81.23%.结论免后14年仍无需加免.

CuZn-SOD乳酸-羟乙酸共聚物缓释微球的制备及体外、体内释放研究

目的探讨CuZn-SOD包裹入乙酸-羟乙酸共聚物制备的药物微球的缓释效果.方法采用复乳法制备CuZn-SOD乙酸-羟乙酸共聚物(PLGA)药物微球,分别用恒温摇瓶法和ELISA法检测体外和体内的释放效果.结果有机相/分散相体积比、内水相体积、蛋白质浓度等因素影响微球的性质,由于聚合物的吸附作用,CuZn-SOD的体外释放呈明显的两段释放,释放不完全;体内释放显示微球制剂有一定的缓释效果.结论该微球有比较好的缓释作用.

重组嗜热脂肪酶工程菌发酵工艺的研究

目的研究重组嗜热脂肪酶表达菌株E.coli BL21(DE3)的生长条件及产物表达规律.方法在发酵过程中,采用补加葡萄糖和蛋白胨,控制pH、溶氧值和温度的方法.结果终发酵液在600nm的光密度值达到54,发酵液细菌湿重达96g/L,脂肪酶活性达到6.8×105U/L.结论确定了工程菌培养的佳条件,提高了目的蛋白和菌体的收获量.

重组类人胶原蛋白的分离纯化

目的建立重组类人胶原蛋白分离及纯化工艺.方法将工程菌株E.coli BL21 3.1在L1523型12.8L自控发酵罐中培养14h,发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后,依次经DEAE-52和Sephadex G-100柱层析分离纯化.结果发酵菌体干重达到71g/L,表达量为菌体蛋白量的29.4%,终产物纯度达98%,回收率为80.5%,纯化倍数为3.4.结论纯化的类人胶原蛋白达电泳纯,相对分子质量为90 000,N端序列为NH2-H-D-P-V-V-Q-R-R-D-W-E-N-P-G,均与其因序列设计一致.

应用质谱扫描测定胸腺肽相对分子质量

目的精确测定胸腺肽相对分子质量分布.方法采用质谱扫描法.结果3批胸腺肽相对分子质量均在2 000～4 000,无10 000以上的大分子蛋白.结论本方法灵敏度高,可直观地测定胸腺肽相对分子质量分布状况,为控制胸腺肽质量提供了新的检测方法.

幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB融合蛋白的表达及生物活性研究

目的通过基因工程方法构建并表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)以基因形式的融合蛋白,并对其生物活性进行初步研究,为幽门螺杆菌疫苗的研究奠定基础.方法用PCR方法从本室构建的融合基因克隆载体扩增出融合基因2 040bp的片段,将融合基因插入原核表达载体pET-11-c中.结果经全自动测序仪测序,SDS-PAGE和免疫印迹以及N端氨基酸测序分析,证实融合蛋白已在BL21中表达,初步纯化后通过动物实验和酶联免疫吸附试验证实其相应的免疫原性和免疫反应性,以及其中LTB成分和GM1结合的特性.结论融合蛋白表达方式为幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗的研究奠定了基础.

应用化学发光免疫分析法测定CA125

目的评价化学发光免疫分析法测定CA125辅助诊断卵巢癌的临床应用价值.方法分别用Lu-miassavTM与ACS:180R试剂测定卵巢癌61例,非卵巢癌21例,正常对照67例,并与RIA进行对照.结果LumiassayTM、ACS:180R与RIA测定CA125的灵敏度分别为86.9%、86.9%和80.3%;特异度分别为95.5%、97.0%和92.5%;阳性预测值分别为94.6%、96.4%和90.7%;阴性预测值分别为88.9%、89.0%和83.9%;准确度分别为91.4%、92.2%和86.7%.LumiassayTM与ACS:180R有高度的一致性和相关性;LumiassayTM、ACS:180R与RIA一致性与相关性略低.结论化学发光免疫分析法测定CA125辅助诊断卵巢癌具有较高的灵敏度、特异度与临床价值,在3种方法的对比中,LumiassayTM与ACS:180R有着高度的相关性,优于RIA.

原料血浆指标检测情况分析

目的考察各血浆站所供血浆初检结果的可靠性,并作质量分析;此外还检测血浆抗-HCMV抗体的滴度.方法按<中国生物制品规程>(原料血浆采集规程)要求的指标对所供血浆进行检测.结果各血站收集的原料血浆初筛合格率为99.96%,个别血浆存在漏检现象,血浆中均有较高的抗-HBS和抗-HCMV抗体.结论各血站所供原料血浆投料前进行二次复检是非常必要的.

人肝细胞生长因子β链在E.coli中的表达、纯化及活性测定

目的为获得重组人肝细胞生长因子β(rhHGF-β)的高效表达体系,分离纯化rhHGF-β,以期研究其在生物学和医学中的作用.方法从人胎肝组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术,对HGF-β基因加工修饰,与载体PBV220重组,构建rhHGF-β的表达载体,转化大肠杆菌,筛选rhHGF-β的高效表达菌株.对rhHGF-β进行粗纯化,透析复性后MTT法检测生物活性.结果获得了rhHGF-β完整的cDNA序列,重组克隆的酶切结果与设计一致.目的蛋白的表达量占全菌蛋白的30%,粗纯化后纯度达90%,复性产物能刺激大鼠肝细胞的增殖.结论建立了rhHGF-β的表达体系,获得了具有生物活性的rhHGF-β,为进一步大量制备和研究HGF的生物学功能提供了重要的实验数据.

重组(CHO细胞)乙肝疫苗纯化工艺的改进

目的增加重组(CHO细胞)乙肝疫苗生产投量,提高纯化收率.方法增加每批细胞收液的投量,改进纯化工艺及调制样品方法.结果提高了HBsAg终收率,并缩短了纯化时间,减少了设备用量.结论改进后的工艺成本较低,效益提高,适于规模化生产.

两种全肝血流阻断方法比较

目的寻找一种对机体创伤小且能保护肝细胞的全肝血流阻断方法.方法将成年健康家犬随机分为3组,A组采用Heaney法作为标准对照;B组采用自制球囊导管门腔心房内转流法;C组采用自制球囊导管门腔心房内转流法加用"复方仙台合剂"法.在肝血流阻断中及开放肝血流后不同时间监测血红细胞SOD活力、肝组织MDA含量、SGOT及SGPT的变化.结果在肝血流阻断前及开放肝血流后不同时间,A组红细胞SOD活力降低及MDA增高均明显高于B组,而B组又明显高于C组;SGOT、SGPT于全肝血流阻断再灌5、30及60min与阻断前比较差异有显著意义,A组变化大,C组小.结论双球囊导管门腔心房内转流对肝损伤小,且加用"复方仙台合剂"对缺血再灌注损伤具有修复作用.

破伤风抗体IgG酶联检测试剂盒的研制

目的研制检测破伤风IgG的酶联检测试剂盒.方法以精制破伤风类毒素进一步纯化后作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人IgG作为抗体制备ELISA试剂盒,并进行敏感性、特异性及重复性检测.结果试剂盒敏感性可达0.003 9IU/ml,特异性达95%以上,重复性好,CV＜7%,试剂盒置于37℃、7 d敏感性无明显改变.结论成功地制备了破伤风抗体IgG酶联检测试剂盒.

基因疫苗用质粒DNA生产下游工程的概述

基因治疗的研究和基因疫苗的开发被认为是人类医学史上的两大突破.第一批基因治疗药品很快将要面市,预计到2010年,此类药品的市场收益将达到45 000 000$[1].

CpG ODNs临床应用前景

细菌基因组DNA和人工合成的CpG ODNs主要依赖其序列中CpG基序激活特异性和非特异性系统的细胞发生免疫应答.

生物制品冻干技术的进展

冷冻干燥是将含水物质先冻结成固态,而后使其中的水分从固态升华到气态,以除去水分而保存物质的方法[1].优点是保持成分不变性,抑制生长和酶的作用,保持体积和形状,保护易氧化物质,去除水分,保存期长.

胆囊癌早期诊治体会

胆囊癌是常见的胆道恶性肿瘤之一,发病率约占消化道肿瘤第6位,5年生存率低,其致病机理目前仍尚不清楚,一般认为与胆囊结石、胆囊炎的慢性感染及长期刺激有关,大量临床资料表明慢性胆囊炎、胆囊结石是胆囊癌的诱因.

《中国生物制品学杂志》已列入"中国生物医学核心期刊"