中国生物制品学杂志
Chinese Journal of Biologicals 중국생물제품학잡지
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
- 影响因子： 0.41
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1004-5503
- 国内刊号： 22-1197/Q
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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人叉头转录因子O亚型3基因重组表达质粒的构建及鉴定
目的 构建人叉头转录因子O亚型3(forkhead box class O3,FOXO3)基因重组表达质粒,并检测其在人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的表达.方法 利用3对引物从人cDNA中分别扩增大小为382、829和891 bp的3个目的片段,胶回收后进行拼接,获得hFOXO3的CDS片段,与pcDNA3.1(+)载体连接,构建重组表达质粒pcDNA3.1 (+)-hFOXO3,转染人PBMC,采用Real-time PCR和Western blot分别检测hFOXO3基因mRNA水平及蛋白表达水平.结果 重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;转染PBMC后,pcDNA3.1(+)-hFOXO3组hFOXO3基因mRNA的水平分别为转染试剂对照组和pcDNA3.1(+)组的2 599.7和2 377.8倍,且差异均有统计学意义(P＜0.001);pcDNA3.1(+)-hFOXO3组hFOXO3蛋白的表达水平分别为转染试剂对照组和pcDNA3.1(+)组的2和1.8倍,且差异均有统计学意义(P＜0.01);而转染试剂对照组和pcDNA3.1(+)组间hFOXO3基因mRNA水平和蛋白的表达水平差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了pcDNA3.1(+)-hFOXO3重组表达质粒,其在人PBMC中能进行hFOXO3基因mRNA的转录及蛋白的表达,为进一步研究hFOXO3的生物学功能及其作用机制奠定了基础.
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酶联免疫法测定重组乙型肝炎疫苗中庆大霉素残留量的相关影响因素分析
目的 分析酶联免疫法测定重组乙型肝炎疫苗中庆大霉素残留量的相关影响因素.方法 使用庆大霉素酶联免疫试剂盒对3种表达系统的重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母、汉逊酵母、CHO细胞)成品和原液进行庆大霉素回收率测定,同时对不同来源庆大霉素标准品绘制的标准曲线进行对比,对铝佐剂和标准品对庆大霉素残留量检测的影响进行分析.结果 含铝佐剂的乙型肝炎疫苗成品中庆大霉素回收率差异较大,疫苗原液中测定庆大霉素的回收率较稳定,在85.1％～ 101.5％之间,波动性较小;试剂盒自带标准品与庆大霉素国家标准品绘制的标准曲线存在差异.结论 不同制备工艺的铝佐剂会影响乙型肝炎疫苗中庆大霉素的回收率,在原液中测定庆大霉素残留量稳定性良好,标准品来源及批次会影响庆大霉素残留量的测定.
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舌鳞状细胞癌永生化细胞系细胞的侵袭性
目的 比较从转移灶中富集出的舌鳞状细胞癌永生化细胞系Tca8113-Ml细胞与原发灶组织获得的Tca8113细胞系细胞侵袭能力的差异,探讨舌鳞状细胞癌永生化细胞系细胞侵袭特性与转移肿瘤干细胞(migratingcancerstem cell,MCSC)的相关性.方法 采用Transwell小室侵袭试验和BALB/c裸鼠移植瘤试验分析Tca8113和Tca8113-Ml细胞的侵袭能力.结果 Tca8113-Ml组的穿膜细胞数(93.8±4.4)明显多于Tea8113组(34.0±1.6),且差异有统计学意义(P＜0.01);Tca8113-M1组裸鼠更易形成移植瘤,且移植瘤形成较快,生长速度也较快,成瘤率为6/6,而Tca8113组成瘤率为4/6.结论 舌鳞状细胞癌永生化细胞系Tca8113-Ml细胞的侵袭能力较强,表明从转移灶中富集出的细胞系细胞具有明显的“干性”,提示肿瘤转移与MCSC之间存在相关性.
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唑来膦酸对甲型肝炎病毒抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响
目的 探讨唑来膦酸(zoledronic acid,ZOL)对甲型肝炎病毒(hapatitis A virus,HAV)抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响.方法 将不同剂量(10、20、40μg)的ZOL与HAV抗原(18 EU)混合,为ZOL不同剂量组,并设阴性对照组(生理盐水0.2ml)、阳性对照组(HAV抗原18 EU)、铝佐剂对照组[HAV抗原(18 EU)+ Al(OH)3(100 μg)],均经皮下注射ICR小鼠,免疫4、8、12、16周后,经小鼠尾静脉采血,分离血清,采用ELISA法检测小鼠血清中抗HAV抗原特异性IgG抗体水平.免疫16周后,取ZOL 40 μg组及阴性对照组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织进行病理切片观察.结果 除阴性对照组外,各ZOL剂量组小鼠免疫4周后,均产生抗-HAV IgG,并随着时间的延长呈上升趋势,于第8周后达到峰值,此后逐渐下降;ZOL不同剂量组的抗体水平均明显高于阳性对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),免疫8周后,40 μg组抗体水平高,为1 079 EU;ZOL 40 μg组免疫4和16周后的抗体水平高于铝佐剂对照组,但差异无统计学意义(P＞0.05),ZOL的佳剂量为40 μg/只.ZOL 40μg组小鼠心、肝、脾、肺、肾组织均未观察到病变.结论 ZOL可明显增强HAV抗原诱导小鼠的体液免疫应答.
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Toll样受体3配体poly(I：C)干预对糖尿病大鼠视网膜病变的影响
目的 探讨Toll样受体3(Toll-like receptor 3,TLR3)配体poly(I:C)干预对糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠视网膜病变的影响.方法 用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立SD大鼠DM模型,4周后处死大鼠,收集视网膜,Real-time PCR法检测早期DM大鼠视网膜中TLR3和炎性因子(IL-6、IL-1α、TNF-α)mRNA的转录水平,Western blot检测大鼠视网膜中TLR3蛋白的表达水平.分别经正常和4周病程的DM大鼠玻璃体腔注射poly(I:C),48 h后处死大鼠,Real-time PCR检测大鼠视网膜中TLR3和IL-6、IL-1 α、TNF-α基因mRNA的转录水平,Western blot检测TLR3蛋白的表达水平,HE染色观察大鼠视网膜结构的变化.结果 早期DM组大鼠视网膜中TLR3基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均显著高于NC组(P均＜0.01),IL-6、IL-1α、TNF-α基因mRNA的转录水平均显著高于NC组(P均＜0.01);经玻璃体腔注射poly(I:C),能显著上调大鼠视网膜中TLR3基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平(P＜0.05或P＜0.01)以及IL-6和TNF-α基因mRNA的转录水平(P＜0.05);病程4周时,DM组大鼠视网膜结构与正常大鼠比较,无明显异常,而DM干预组较正常干预组视网膜水肿显著加重,结构出现紊乱.结论 DM大鼠早期视网膜中TLR3的表达显著增加;经玻璃体腔注射poly(I:C)可加重正常和DM大鼠视网膜损伤,可能是通过激活TLR3信号通路,上调信号通路下游产物IL-6、IL-1α、TNF-α的表达水平实现的.
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氢氧化铝和PolyIC佐剂在结核亚单位疫苗中的佐剂效应
目的 观察重组抗原Ag85b和ESAT6-CFP10(EC)联合氢氧化铝佐剂(Al)和PolyIC (IC)佐剂诱导小鼠的免疫效果及对豚鼠结核的预防作用.方法 将BALB/c小鼠随机分为6组:PBS组、Pro组(Ag85b+ EC)、Al+ IC组、Pro+ Al组(Ag85b+ EC+ Al)、Pro+ IC组(Ag85b+ EC+ IC)、Pro+ Al+ IC组(Ag85b+ EC+ Al+ IC),经小鼠后肢内侧肌肉注射,共注射3次,间隔10d.末次注射后2周,摘眼球采血,分离血清,采用间接ELISA法检测IgG抗体效价;同时处死小鼠,无菌取脾,分离淋巴细胞,采用ELISPOT法检测抗原特异性的IFNy水平.将豚鼠随机分为3组:NS组、BCG组和Pro+ Al+ IC组,NS组和Pro+ Al+ IC组免疫3次,间隔10 d;BCG组仅免疫1次,于前两组第3次免疫时进行免疫.末次免疫30 d后经皮下注射结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)菌液,攻毒41 d后,处死豚鼠,解剖,检测肝、脾、肺的病变程度,并进行评分,同时分离脾脏Mtb,计算每只豚鼠的脾菌分离对数值.结果 经Ag85b多肽和EC多肽刺激后,Pro+ Al+ IC组IFNγ斑点形成细胞(spot forming cell,SFC)数均显著高于其他各组(P＜0.000 1或＜0.05),同组间经Ag85b多肽刺激后的SFC均高于经EC多肽刺激后的SFC.Pro+ Al+ IC组血清Ag85b特异性IgG抗体效价高,与Pro+ Al组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),但与Pro+ IC组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);Pro+ Al+ IC组血清EC特异性IgG抗体效价高,与Pro+ Al和Pro+ IC组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);同组间Ag85b特异性IgG抗体效价高于EC特异性IgG抗体效价.Pro+ Al+ IC组豚鼠脏器综合病变指数和脾菌分离对数值均显著高于BCG组(P＜0.000 1),略低于NS组,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 氢氧化铝佐剂和PolyIC佐剂联合使用可协同增强结核分枝杆菌抗原Ag85b和EC的细胞免疫应答及体液免疫应答;但Ag85b和EC配伍构成的重组亚单位疫苗对豚鼠预防性保护力较弱,不适合用作暴露前预防.
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丙型肝炎病毒感染对内皮细胞趋化因子配体1表达的影响
目的 探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染对肝细胞及血管内皮细胞趋化因子配体1[chemokine (C-X3-C motif) ligand 1,CX3CL1]表达的影响.方法 分别以0.5 MOI感染性HCV病毒颗粒(cell-culture-derived infectious HCV,HCVcc)感染Huh7细胞48 h、以不同剂量(0.1、0.2、0.5、1μg)的HCV RNA转染HepG2细胞48 h、以0.5和1.0 MOI HCVcc感染过表达人CD81的HepG2细胞48 h后,抽提各步细胞总RNA,采用Real-time PCR法检测HCV感染肝细胞对胞内CX3CL1 mRNA表达的影响.分别以1.0 MOI HCVcc刺激HUVEC 48h、以0.1、0.2、0.4、1.0 MOI HCVcc刺激人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMEC) 48 h、以0.5 MOI HCVcc刺激Huh7和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)共培养细胞体系48 h,抽提各步细胞总RNA,采用Real-time PCR法检测HCVcc刺激内皮细胞对胞内CX3CL1表达的影响.结果 与未感染细胞对照相比,0.5 MOI HCVcc感染的Huh7细胞中CX3CL1 mRNA水平上调2倍多(P＜0.05),随着HCV RNA转染HepG2细胞剂量的增加,CX3CL1 mRNA水平随之升高,组间差异有统计学意义(P＜0.05),0.5和1.0 MOI HCVcc感染过表达CD81的HepG2细胞,胞内CX3CL1 mRNA水平分别上调7.56和13.91倍(P＜0.05).与未刺激细胞对照相比,HCVcc刺激HUVEC可引起胞内CX3CL1的mRNA水平上调5倍多(P＜0.05);与HCVcc未刺激的共培养组相比,与HCVcc感染的Huh7细胞共培养的HUVEC胞内CX3CL1 mRNA水平上调约13倍,HUVEC受HCVcc刺激后,CX3CL1 mRNA水平的上调幅度高于HUVEC单独培养组(P均＜0.05);与未刺激细胞对照相比,0.1、0.2、0.4和1.0 MOI HCVcc刺激HBMEC可引起胞内CX3CL1 mRNA水平上调1.71、2.37、2.85和3.05倍(P＜0.05).结论 HCV感染可引起肝细胞和血管内皮细胞CX3CL1表达上调,HCVcc感染肝细胞释放的细胞因子也是促进内皮细胞CX3CL1表达上调的刺激物,为HCV感染引起肝外疾病产生的机制提供了参考.
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小鼠睾丸组织高表达基因mINCA1真核表达质粒的构建及其RNA干扰靶点的筛选
目的 构建小鼠睾丸组织高表达基因mINCA1的真核表达质粒,并筛选其RNA干扰靶点.方法 从BALB/c小鼠睾丸组织中扩增mINCA1基因,插入真核表达载体pMSCVpuro,构建重组真核表达质粒pMSCVpuro-mINCA1,转染人胚肾HEK 293T细胞,转染48 h后,分别采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中mINCA1基因mRNA的转录及蛋白的表达.设计并合成针对mINCA1基因的4个RNA干扰质粒,分别与质粒pMSCVpuro-mINCA1共转染HEK293T细胞,采用Western blot法筛选mINCA1基因的干扰靶点.结果 PCR、双酶切及测序结果证实重组真核表达质粒pMSCVpuro-mINCA1构建正确;pMSCVpuro-mINCA1质粒转染的HEK 293T细胞中有mINCA1基因mRNA的转录及蛋白的表达;干扰质粒PGPU6/GFP/Neo-shRNA1和PGPU6/GFP/Neo-shRNA3可显著降低mINCA1蛋白的表达量.结论 成功构建了mINCA1基因真核表达质粒,并筛选出mINCA1基因的2个有效干扰靶点,为进一步研究mINCA1基因的功能及作用机制奠定了实验基础.
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基于口蹄疫病毒2A片段的多基因共表达质粒的构建及表达
目的 构建基于口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV) 2A片段的多基因共表达质粒,并在293T细胞中共表达HBx、人Sox2及人c-Myc基因.方法 以FMDV 2A自剪切片段连接HBx、Sox2和c-Myc基因编码序列,克隆至载体pEGFP-C1,构建多基因共表达质粒pEGFP-XSM;在脂质体LipofectamineTM 2000的介导下,将重组质粒pEGFP-XSM转染293T细胞,同时设空载体组(转染空载体pEGFP-C1)和空白对照组(未转染),转染48 h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达;Real-time PCR和Western blot法分别检测各组293T细胞中HBx、Sox2和c-Myc基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平.结果 多基因共表达质粒pEGFP-XSM经酶切和测序鉴定构建正确;空载体组和pEGFP-XSM转染组细胞荧光镜下均可见GFP的表达;pEGFP-XSM转染组中HBx、Sox2和c-Myc基因mRNA的转录水平较空白对照组及空载体组均明显升高(P＜0.001);pEGFP-XSM转染组可见相对分子质量约48 000的GFP-HBx-2A融合蛋白条带和约38 000的HA-Sox2-2A融合蛋白条带,各组均可见相对分子质量约49 000的c-Myc蛋白条带,pEGFP-XSM转染组c-Myc蛋白的表达水平明显高于空白对照组及空载体组(P＜0.01).结论 成功构建了多基因共表达质粒pEGFP-XSM,并在293T细胞中实现了HBx、Sox2和c-Myc蛋白的共表达,为进一步深入研究该共表达蛋白在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生发展中的生物学机制奠定了基础.
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幽门螺杆菌黏附素A的原核表达、纯化及其结晶条件搜索
目的 原核表达、纯化幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)黏附素A(H.pylori adhesin A,HpaA),并初步搜索其结晶条件.方法 采用TMHMM和SignalP-4.1软件预测HpaA蛋白中的跨膜序列和信号肽序列,根据GenBank中登录的编码HpaA的基因序列hp0797去掉预测出的信号肽序列后设计引物,以H.pylori标准株26695基因组为模板,PCR扩增编码HpaA的基因序列,插入原核表达载体pET-22b,构建重组表达质粒pET-22b-HpaA,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG 25℃诱导表达,表达的重组蛋白经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析进行纯化.将纯化产物浓缩至10 mg/ml,采用结晶搜索试剂盒,通过悬滴汽相扩散法搜索HpaA的结晶条件,并在此基础上配制条件进行优化.结果 去掉序列中编码信号肽区域或跨膜结构域的密码子,选择HpaA的36 ～ 260位氨基酸进行克隆,构建的重组原核表达质粒pET-22b-HpaA经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白HpaA相对分子质量约27 000,表达量约占菌体总蛋白的10％以上,主要以可溶形式表达,纯化后的纯度可达99％以上.在多种条件下,均有结晶生长,晶体多为薄片状、针状或簇状,在20％ PEG3350,0.1 mol/L HEPES(pH 7.0)条件下,晶体形状类似长方体,外形有所改善.结论 成功表达了HpaA蛋白,初步掌握其结晶条件,为下一步晶体结构学的研究及其在H.pylori感染与致病中的作用机制奠定了基础.
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球形节杆菌尿酸酶的表达、纯化及其活性
目的 在大肠埃希菌中表达球形节杆菌尿酸酶(uricase,Uri),并进行纯化和检测其活性.方法 根据大肠埃希菌遗传密码子偏爱性,结合原核翻译起始序列的局部二级结构自由能小化原则,优化设计编码Uri蛋白的核苷酸序列,经PCR扩增球形节杆菌uri基因,克隆至载体pET43.1a,构建重组表达质粒pET43.1 a-uri,转化感受态大肠埃希菌BL21-odonPlus(DE3)-RIPL,IPTG诱导表达.表达产物经硫酸铵粗纯及DEAE琼脂糖凝胶层析纯化后,经SDS-PAGE分析纯度;参考Uri产品说明书测定蛋白酶活性,并确定其佳检测温度及pH值.结果 重组表达质粒pET43.1 a-uri经酶切及测序鉴定构建正确;重组蛋白相对分子质量约33 000,以可溶性形式存在,表达量约占菌体总蛋白的40％;纯化后纯度可达90％以上;酶活性达13.2 U/mg,酶活性检测佳反应温度为40℃,佳反应pH值为9.0.结论 成功于大肠埃希菌中表达了uri基因,并获得高纯度的Uri蛋白,其酶学性质与天然的球形节杆菌尿酸酶基本一致,为其大规模稳定生产及尿酸酶法检测试剂的配制研究奠定了基础.
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一例人狂犬病病例的病毒分离及鉴定
目的 对2013年武汉市新发生的一例疑似狂犬病死亡病例的脑组织进行病毒分离及鉴定.方法 采用直接荧光抗体法(DFA)和ELISA法检测狂犬病病毒(rabies virus,RABV)抗原;提取病毒RNA,设计12对引物,分段扩增全基因组,克隆后测序,应用DNAStar软件包中的MegAlign模块对基因所编码的氨基酸进行对位分析;Clustal X 1.83软件和GENEDOC软件用于序列比对;MEGA 4.1软件以Kimura two-parameter模型邻位相连法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统进化树(Bootstrap-1000),并与国内外疫苗株及近期湖北省及周边地区分离的代表性街毒株进行同源性分析.结果 分离的街毒株13WH10的RABV抗原呈阳性;13WH10街毒株基因组全长11 924 bp,属基因Ⅰ型狂犬病病毒;13WH10与湖北省及周边街毒株处于同一亚群,与CTN-1疫苗株及东南亚地区的街毒株同源性较高,高于欧美国家疫苗株.结论 成功对武汉市2013年新发生的一例疑似狂犬病死亡病例的脑组织进行了病毒分离及鉴定;CTN-1与RABV国内分离株同源性较高,系统进化关系较近,提示采用CTN-1疫苗株生产的狂犬病疫苗可有效预防中国狂犬病的流行.
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腺病毒介导的slit2 shRNA对缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞中血管内皮生长因子表达的影响
目的 观察腺病毒介导的slit2 shRNA对缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells,RPE)中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响,探讨slit2在脉络膜新生血管(chorodal neovascularation,CNV)中的可能作用,为CNV的治疗提供新的思路.方法 分别采用RT-PCR和免疫组化法检测人视网膜色素上皮-19(ARPE-19)细胞中slit2及受体Robo1基因mRNA的转录和蛋白的表达;用200 μmol/L氯化钴处理人ARPE-19细胞,建立化学缺氧模型,以未缺氧组作为对照,采用Real-time PCR和Western blot法检测在缺氧状态下细胞中slit2、Robo1、VEGF基因mRNA及蛋白水平表达的变化;将缺氧的人ARPE-19细胞随机分为shRNA处理组(加入Ad-slit2-shRNA)、空腺病毒组(加入空腺病毒)和缺氧组,24 h后收集各组细胞,Real-time PCR和Western blot法检测slit2 shRNA干扰后细胞中slit2、Robo1、VEGF基因mRNA和蛋白水平表达的变化,ELISA法检测细胞培养上清中VEGF蛋白水平的变化.结果 在正常人ARPE-19细胞中有slit2和Robo1基因mRNA的转录及蛋白的表达;缺氧组人ARPE-19细胞中slit2、Robo1、VEGF基因mRNA和蛋白的表达水平均较未缺氧组明显升高(P＜0.05);与缺氧组相比,slit2-shRNA处理组人ARPE-19细胞中slit2、Robo1、VEGF基因mRNA和蛋白的表达水平均明显降低(P＜0.05),缺氧组与空腺病毒组slit2、Robo1、VEGF的变化差异无统计学意义(P＞0.05).结论 slit2 shRNA沉默RPE细胞中的slit2后,可明显抑制缺氧诱导的RPE细胞中VEGF的表达,为临床CNV的治疗提供了新的思路.
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脐带间充质干细胞长期体外培养的生物学特性及遗传稳定性
目的 观察脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)体外长期培养的生物学特性及遗传稳定性.方法 从剖宫产足月健康新生儿脐带中分离培养UC-MSCs,并连续传代,显微镜下观察细胞形态.分别检测P3和P12代UC-MSCs的增殖能力、免疫表型、向成脂肪细胞和成骨细胞的分化诱导率、衰老情况、成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)及染色体核型.结果 P3代UC-MSCs为形态相对均一的梭形贴壁细胞,呈平行排列生长或旋涡状生长;P12代UC-MSCs宽大扁平,贴壁性减退,漂浮细胞增多,胞浆内出现黑色颗粒和空泡;P3和P12代UC-MSCs均表达CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR;P3较P12代UC-MSCs的细胞增殖能力及向成脂肪细胞分化诱导率均明显升高(P均＜0.05);向成骨细胞分化诱导率及细胞衰老率均明显降低(P均＜0.05);成纤维细胞集落数及染色体中期分裂相明显增多(P＜0.05).结论 长期体外培养的UC-MSCs生物学特性发生改变,遗传学特性稳定,但染色体中期分裂相减少.
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融合蛋白TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA的原核表达、纯化及其生物学活性
目的 原核表达、纯化融合蛋白TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA,并检测其生物学活性.方法 以pET32a(+)CTP-OD-HA为模板,PCR扩增OD序列中的第1-87 bp和第190-216 bp序列,并通过重叠PCR连接成为新序列,命名为OD1,克隆至pET32a(+)载体,构建原核表达质粒pET32a(+)CTP-OD 1-HA;再分别以pET32a(+)CTP-OD-HA和pET32a(+)CTP-OD1-HA质粒为模板,PCR扩增CTP-OD-HA和CTP-OD 1-HA片段,分别克隆至表达载体pCOLD-TF-DNA,构建质粒pCOLD-TF-CTP-OD-HA和pCOLD-TF-CTP-OD1-HA,转化E.coli BL21,IPTG诱导表达TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA融合蛋白;表达的融合蛋白经镍离子亲和层析纯化和脱盐浓缩后,采用MTT法和DAPI染色检测两种融合蛋白对K562细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用.结果 重组原核表达质粒pCOLD-TF-CTP-OD-HA和pCOLD-TF-CTP-OD 1-HA经菌落PCR及测序证实构建正确;表达的TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD 1-HA融合蛋白相对分子质量分别约为67 000和63 000,主要为可溶性表达,表达量分别占总菌体蛋白的35％和20％,脱盐浓缩后,纯度分别约为98％和95％,均可与鼠抗HA单克隆抗体特异性结合;TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA对K562细胞的增殖抑制率分别为34％和31％,与PBS对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.001);TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD 1-HA处理的K562细胞胞核均具有细胞凋亡的典型特征.结论 原核表达并纯化了TF-CTP-OD1-HA融合蛋白,该蛋白具有与TF-CTP-OD-HA相似的生物学活性,为今后开发治疗慢性粒细胞白血病的小分子多肽药物提供了新的策略.
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5-氟尿嘧啶与甲基磺酸乙酯复合诱变选育高产弹性蛋白酶菌株
目的 以弗氏链酶菌为出发菌,使用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(Ethylmethylsulfone,EMS)和5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)复合诱变,选育高产弹性蛋白酶突变菌株.方法 用高氏培养基培养弗氏链霉菌,收集菌悬液经摇瓶发酵培养后,加入6 mg/ml 5-FU进行诱变处理,收集处理液,经10倍系列稀释(10-1～ 10-7)后,涂布初筛培养基平板,选取透明圈出现较早和HC(透明罔直径/菌落直径)值较大的菌株培养后,加入2％ EMS,37℃分别作用0、15、30、45、60 min,涂布牛奶培养基,计数菌落数,计算菌悬液存活率,选择合适条件进行复合诱变选育高产弹性蛋白酶突变菌株,选取HC值较大的5个菌株,进行摇瓶发酵培养,采用Sacher法检测弹性蛋白酶活力.结果 弗氏链霉菌菌液经0.6mg/ml 5-FU处理后,经2％ EMS作用30 min进行复合诱变,孢子存活率为l6.1％;经初筛、复筛,获得高产生弹性蛋白酶菌株,酶活力达35.98 U/ml,比出发菌株提高了35.6％.结论 选择5-FU浓度为0.6 mg/ml,EMS浓度为2％作用30 min时,对弗氏链酶菌进行复合诱变,其诱变效率高,可获得高酶活的突变株.
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气相色谱法测定甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中乙醚的残留量
目的 目的采用气相色谱法测定甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中乙醚的残留量,并对该方法进行验证及初步应用.方法 采用气相色谱法定量测定甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中的乙醚含量,顶空条件:平衡温度为90 q℃,平衡时间为30 min.色谱条件:色谱柱:HP-FFAP毛细管色谱柱(25 m×0.32 mm×0.5μm);载气:氮气;流量:1.0～2.0ml/min;进样口温度:160℃;检测器温度:250℃;柱温:45℃;分流比:5:1;进样体积:1 ml.对建立的方法进行验证及初步应用,并建立质量标准.结果 该方法检测乙醚残留量溶剂对所测组分无干扰;系统适应性良好;乙醚浓度在11～ 110 μg/ml范围内,标准曲线的线性关系良好(r=0.999 3);低定量限为0.028 μg/ml;检测对照品溶液的相对标准偏差(RSD)为2.98％;加标回收率在83.08％ ～ 87.58％之间.应用该方法检测9批疫苗样品中的乙醚残留量在0.000 03％～0.000 55％之间,符合《中国药典》二部(2005版)附录ⅧP应不高于0.5％的要求.将乙醚残留量作为该疫苗半成品的质量标准检测项目,限度定为0.05％.结论 气相色谱法测定甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中乙醚的残留量系统适用性、线性、精密性和准确性良好,且易于操作,简便快速,可用于甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中乙醚残留量的测定.
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阈值法检测人用狂犬病疫苗Vero细胞DNA残留量方法的建立及初步验证
目的 建立一种阈值法(threshold method)检测人用狂犬病疫苗Vero细胞DNA残留量的方法.方法 取人用狂犬病疫苗进行DNA抽提后,与内控品经高温变性、冰浴后,37℃水浴1h,加入生物素标记的单链DNA结合蛋白(single stranded binding protein,SSB)和尿素酶标记的抗单链DNA(single stranded DNA,ssDNA)的单抗,与变性的宿主细胞DNA结合形成复合物,经过滤、洗涤后,将复合物吸附于硝酸纤维素膜上,置Threshold仪器样品检测池中,检测DNA含量.对建立的阈值法测定人用狂犬病疫苗Vero细胞DNA残留量的方法进行线性范围、准确性及精密度验证.结果 该方法的低检测限为3 pg/500μl,线性范围为3～ 200 pg/500μl,DNA内控品浓度的对数与相应的检测信号值的对数呈良好的线性关系(R2=0.98);该方法检测不同企业疫苗样品的回收率为99％～ 124％,变异系数为8.5％,加入内控品后再抽提,不同企业疫苗样品的回收率为48％～128％,变异系数为32.9％;同1批疫苗重复10次的检测结果的CV值为7.8％,同1批疫苗不同时间检测结果的CV值为11.8％.结论 阈值法可检测人用狂犬病疫苗Vero细胞宿主DNA残留量,该方法操作简便,灵敏度好,准确性及精密度高,对人用狂犬病疫苗生产和质量控制具有较好的指导意义.
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B型流感病毒血凝素的纯化
目的 纯化B型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA).方法 使用不同浓度的菠萝蛋白酶酶切B型流感病毒HA,超速离心获得含HA的上清后,经蔗糖密度梯度离心进行纯化,HPLC分子筛分析纯化效果.纯化后的蛋白经糖苷酶PNGaseF处理后,切取丰度较高的蛋白条带,进行质谱鉴定.结果 病毒蛋白与菠萝蛋白酶蛋白含量的佳比例为40:1;5％ ～ 30％梯度浓度的蔗糖能很好地去除低相对分子质量的蛋白,流感病毒内丰度较高的NP及M蛋白得到很好的去除;纯化的HA蛋白的纯度大于90％,且HPLC分析显示仅有1个主峰,均一性良好.结论 优化了B型流感病毒HA蔗糖密度梯度离心纯化方法,获得了高纯度的HA蛋白,为制备HA标准抗血清奠定了基础.
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改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞
目的 采用改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs).方法 无菌条件下取足月婴儿脐带,采用改良组织块贴壁法分离间充质干细胞,台盼蓝染色法计数单个核细胞数,倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞周期及免疫表型.结果 原代hUCMSCs的数量为(1～ 5)× 105个.培养至8d,组织块边缘处有单细胞爬出;培养至2周,贴壁生长的细胞散在分布或形成小克隆;培养至20 d,细胞呈梭型、三角形或多角形.培养第20天的原代hUCMSCs的G0/G1期细胞占88.12％,S期细胞占1.23％,G2/M期细胞占10.65％,大多数细胞处于细胞增殖的潜伏期,CD105阳性率为97.65％,CD34阳性率为2.54％.结论 采用改良组织块贴壁法分离了hUCMSCs,其生物学特性与骨髓间充质干细胞相似,为其临床应用奠定了基础.
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融合蛋白GST-PADI4可溶性表达条件的优化及纯化
目的 优化融合蛋白GST-PADI4的可溶性表达条件,并对蛋白进行纯化.方法 对融合蛋白GST-PADI4工程菌的诱导温度(16、20、25、30、37℃)、诱导剂IPTG浓度(0.05、0.1、0.2、0.5、1 mmol/L)、诱导时菌液A600值(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0)、诱导时间(8、12、16、20、24 h)进行优化,分析融合蛋白GST-PADI4的可溶性表达情况;按优化的表达条件进行大量表达后,采用Sepharose 4B亲和层析柱对融合蛋白进行纯化.结果 在16℃,菌液A600值约为0.4时,以0.1 mmol/L IPTG诱导12h,融合蛋白GST-PADI4有较高的可溶性表达;纯化的融合蛋白纯度为91％.结论 优化了融合蛋白GST-PADI4的可溶性表达条件,并获得了高纯度的可溶性融合蛋白,为后续研究PADI4蛋白的功能奠定了基础.
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基于独特型-抗独特型玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA检测方法的建立
目的 建立基于独特型-抗独特型玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)间接竞争ELISA检测方法,并进行验证.方法 采用Protein G亲和层析法纯化ZEN的β型抗独特型单抗1D5(Ab2β-1D5)腹水;以ZEN单抗Fab片段包被酶标板,Ab2β3-1D5为一抗,建立ZEN的竞争ELISA检测方法,绘制标准抑制曲线,根据回归方程计算半数抑制浓度(IC50),并确定检出限(IC10)及线性范围.以ZEN类似物呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉素A代替ZEN作为竞争抗原,用建立的方法进行检测,验证方法的特异性;配制6个浓度的ZEN溶液(20、30、40、50、60和75 ng/ml),用建立的方法进行检测,计算试验内及试验间回收率和变异系数(CV),验证方法的准确性和精密性.结果 Ab2β-1D5单抗的纯化效果较好,浓度为4 mg/ml,效价为1:6×104;ZEN单抗Fab片段的佳包被浓度为1μg/ml.建立的ZEN竞争ELISA检测方法的线性回归方程为:y=-34.099x+81.857,R2=0.994 4,IC50为8.60 ng/ml,IC10为0.58 ng/ml,线性范围为0.58 ～ 128.03 ng/ml;该方法检测ZEN类似物伏马毒素、赭曲霉素A和呕吐毒素的交叉反应率均小于0.01％;检测不同浓度ZEN的试验内平均回收率在98.65％ ～ 113.45％之间,试验间平均回收率在82.96％ ～ 98.00％之间;试验内CV值在0.48％ ～ 6.40％之间,试验间CV值在0.94％ ～8.27％之间.结论 应用ZEN单抗的Fab片段和ZEN的β型抗独特型单抗建立了ZEN的间接竞争ELISA检测方法,该方法特异性较强,准确性和精密性良好,且成本较低,快速简便,易于标准化,适用于样品的大量筛选.
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神经干细胞来源及应用的研究进展
神经干细胞(neural stem cells,NSCs)存在于中枢神经系统中,能够自我更新并具有多向分化潜能.近年来,NSCs疗法为一些难以治疗的神经系统疾病带来了希望.随着转分化技术的进步,NSCs来源更加广泛,但由于移植治疗对NSCs有很高的要求,其来源是否能满足移植的需要,也尚未明了.目前,NSCs尚未有普遍认可的组织来源,各种NSCs来源都有一定的缺陷,包括实际应用的取材限制、不同来源的功能差异等,NSCs的应用主要集中在非临床研究阶段.本文就NSCs的来源及移植治疗部分神经系统疾病的新研究进展作一综述.
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重组结核疫苗AEC/BC02诱导豚鼠的Ⅰ型超敏反应
目的 评价重组结核疫苗AEC/BC02诱导豚鼠Ⅰ型超敏反应炎性介质的释放.方法 将18只雄性豚鼠分成3组:AEC/BC02疫苗组、阴性对照组和阳性对照组,每组6只,分别经后腿肌肉注射AEC/BC02疫苗、生理盐水和卵清蛋白(ovalbumin,OVA),共7针,间隔10d.于末次免疫后14d,各组豚鼠经心脏采血,收集抗凝血,加入不同刺激物;豚鼠采血后,吸入二氧化碳致死,分离豚鼠气管,置于含不同刺激物的KBS缓冲液中;剪开分离气管后的豚鼠腹腔,分别灌入含不同刺激物的KBS缓冲液;AEC/BC02疫苗组用重组蛋白Ag85b、EC及BCG-CpG-DNA(简称CpG)刺激,阴性对照组未刺激,阳性对照组用OVA蛋白刺激.按组胺检测试剂盒和半胱氨酰白三烯检测试剂盒说明书,采用ELISA法检测外周血、气管和腹腔特异性刺激后释放的组胺和半胱氨酰白三烯含量.结果 AEC/BC02疫苗组外周血释放的组胺含量(41.0±23.4)ng/ml与阳性对照组(46.4±28.2)ng/ml比较,差异无统计学意义(p＞0.05);但气管和腹腔肥大细胞释放的组胺含量[气管:(27.4±10.8)ng/ml和腹腔:(9.7±8.1)ng/ml]均明显低于阳性对照组[气管:(71.4±21.1)ng/ml,腹腔:(23.5±12.4) ng/ml)],释放的半胱氨酰白三烯含量[气管:(236.4±63.5) pg/ml,腹腔:(173.4±31.3)pg/ml]也均明显低于阳性对照组[气管:(458.0±208.2)pg/ml,腹腔:(259.2±30.4) pg/ml],差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 肌肉注射途径下,AEC/BC02疫苗给药7针不会诱导豚鼠严重的Ⅰ型超敏反应.
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不同裂解工艺制备的甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的透射电子显微镜观察
目的 透射电子显微镜观察不同工艺制备的甲型H1N1流感病毒裂解疫苗形态,筛选佳裂解工艺,为疫苗的大规模生产提供参考依据.方法 应用透射电镜对4种不同裂解工艺制备的甲型H1N1流感病毒疫苗进行形态观察,采用中和试验分析其免疫原性,异常毒性试验分析其安全性.结果 透射电镜观察显示4种样品均无完整病毒,样品1裂解程度大,囊膜破裂,多数为病毒碎片;样品2大多数囊膜未破损,缺少纤突;样品3较完整的病毒颗粒略小(约30 ～ 40 nm),纤突清晰;样品4大多数病毒颗粒保留着纤突,但纤突已不整齐清晰.样品2组小鼠中和抗体滴度低,而样品1、3、4组较高,与样品2组相比,差异明显,其中以样品3组高;样品2组小鼠、豚鼠体重增加不明显,而样品1、3、4组小鼠、豚鼠体重增加明显,与样品2组相比差异显著,其中以样品3组明显.结论 电镜观察可直观反映疫苗裂解程度;3种裂解工艺均可用于疫苗生产,其中样品3具有较好的免疫原性和安全性,其工艺可作为佳裂解工艺用于后续疫苗生产.
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灭活轮状病毒与灭活肠道病毒71型联合疫苗的疫效果
目的 评价灭活轮状病毒(rotavirus,RV)与灭活肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)联合疫苗的免疫效果及两种抗原间的相互作用.方法 将灭活RV与EV71按不同抗原含量配比制成联合疫苗免疫ICR小鼠,同时设单价疫苗组,均经小鼠腿部肌肉注射,隔2周免疫1次,共2次,分别于每次免疫后2周,经小鼠尾静脉采血,分离血清,经56 ℃灭活30 min后,采用血清中和试验检测小鼠血清中抗RV和抗EV71中和抗体效价.结果 初次免疫后14d,各组小鼠血清中RV特异性中和抗体阳转率为50％ ～ 67％,中和抗体效价为2.2～2.8,加强免疫后14d,抗体阳转率达100％,中和抗体效价为28.5 ～ 35.9.初次免疫后14 d,各组小鼠血清中抗EV71中和抗体阳转率为83％～ 100％,中和抗体效价为4.0～7.1,加强免疫后14 d,中和抗体阳转率达100％,中和抗体效价为25.4～71.8;联合疫苗组与单价疫苗组间抗RV及抗EV71中和抗体效价差异无统计学意义(P＞0.05);RV和EV71抗原量按160 /160 EU配比时,可诱导出高的抗RV抗体及抗EV71抗体应答.结论 RV与EV71联合疫苗可诱导小鼠产生针对两种病毒的体液免疫应答,抗体应答水平与疫苗抗原配比剂量相关,未发现两种抗原间有协同或拮抗作用.
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高效价巨细胞病毒人免疫球蛋白原料血浆的筛查
目的 分析普通健康供浆员中人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)免疫球蛋白(IgG)抗体效价分布情况,筛查富含高效价HCMV IgG抗体的原料血浆.方法 采用HCMV IgG定量检测试剂,检测本公司下属广西地区五个单采血浆站采集的血浆样本的HCMV IgG抗体效价,检测抗体效价＞15 PEI-U/ml的血浆样本混合后的HCMV IgG抗体效价,并对血浆中富含HCMV抗体的供浆员血浆进行采集,分析效价分布变化情况.结果 健康供浆员28 607份血浆样本的HCMV IgG抗体阳性率为85.2％,其中效价分布在1～ 10、10～ 15、＞15 PEI-U/ml的各占64.5％、8.7％和11.9％;1 318名血浆中富含HCMV抗体的供浆员8 426份血浆样本HCMV IgG抗体阳性率为98.1％,抗体效价＞ 15 PEI-U/ml占43.8％,约为普通健康人血浆样本的3.7倍,3个月内平均抗体效价可维持在15 PEI-U/ml以上的有586人,占44.5％;不同浆站抗体效价＞15 PEI-U/ml的血浆样本混和后的平均效价为33.72 PEI-U/ml.结论 健康供浆员中高效价HCMV IgG抗体的比例较高,部分供浆员HCMV IgG抗体高效价水平可稳定维持3个月,从健康供浆员中采集含高效价HCMV IgG抗体的原料血浆,用于制备巨细胞病毒人免疫球蛋白具有可行性.
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Aurora-A激酶抑制剂VX-680对食管癌细胞凋亡的影响
目的 探讨Aurora-A激酶抑制剂VX-680对食管鳞癌EC9706细胞凋亡的影响.方法 用不同浓度的VX-680(10、30、50、100 nmol/L)处理EC9706细胞48 h,并设DMSO对照组和空白对照组,倒置显微镜下观察细胞形态的变化,CCK-8法检测细胞的存活率,流式细胞术检测细胞的凋亡率.结果 随着VX-680浓度的增加,贴壁细胞逐渐出现皱缩、变圆、脱落等现象;细胞存活率呈逐渐下降趋势(P＜0.01);细胞凋亡率均高于DMSO对照组,且50和100 nmol/L VX-680组细胞凋亡率与DMSO对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 VX-680能促进EC9706细胞凋亡,在食管癌临床治疗方面具有良好的应用前景.
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抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5的药理学分析
目的 分析抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对动物的药理作用,为其安全性用药提供实验依据.方法 取昆明(KM)小鼠,经尾静脉分别注射1、3和9 mg/kg TAP-SSL5,观察其对小鼠神经系统的影响;取SD大鼠,经尾静脉分别注射1和3 mg/ kg TAP-SSL5,设溶剂[20 mmol/L甘氨酸(Gly)-NaOH缓冲液,pH 10.6]为对照组,观察其对呼吸系统和心血管系统的影响.结果 TAP-SSL5对KM小鼠一般行为状态、协调机能和戊巴比妥钠阈下剂量催眠的协同作用无明显影响;对SD大鼠的血压、呼吸频率和心率无明显影响,与溶剂对照组比较,差异无统计学意义(P均＞0.05).结论 融合蛋白TAP-SSL5对动物的神经系统、呼吸系统和心血管系统无明显影响,表明其具有较好的安全性,且无明显的毒副作用.
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姜黄素对人髓母细胞瘤DOAY细胞增殖的影响及其机制
目的 探讨姜黄素对髓母细胞瘤(medulloblastoma,MB)DAOY细胞增殖的影响及其机制.方法 用20、40、60、80、100 μmol/L的姜黄素(curcumin)处理DAOY细胞24、48和72 h,采用MTT法检测姜黄素对细胞增殖活性的影响;用30 μmol/L姜黄素处理DAOY细胞48 h,设未处理细胞为对照组,免疫细胞化学法检测姜黄素对细胞中β-catenin蛋白表达的影响,Western blot法检测β-catenin及cylinD1蛋白的表达水平.结果 不同浓度及作用不同时间姜黄素均可明显抑制DAOY细胞的增殖(P＜0.05),且在姜黄素浓度≤60 μmol/L时,呈时间、剂量依赖性.对照组细胞中,β-catenin蛋白在胞浆和胞核中均有表达,且以胞核为主,经30 μmol/L姜黄素处理48 h后,胞核蛋白β-catenin及总蛋白cyclinD1的表达均明显低于对照组(P＜0.05),胞浆蛋白β-catenin的表达无明显降低(P＞0.05).结论 姜黄素可通过抑制β-catenin的表达和核转位,阻断Wnt/β-catenin信号通路转导,进而抑制其下游靶基因cyclinD1的表达,从而抑制MB的增殖.
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2012年沧州市手足口病发病情况分析
目的 分析2012年沧州市手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的发病情况,为今后沧州市HFMD疫情的防控提供参考.方法 收集沧州市2012年HFMD疫情报告的流行病学资料及实验室核酸检测资料,对2012年沧州市HFMD发病情况进行分析.结果 2012年沧州市HFMD病例累计报告12 659例,比上年同期(14 858例)降低14.80％;5月份为发病的高峰期;疫情主要集中在任丘市、肃宁县、沧县、青县、河间市;1岁儿童发病率高(34.84％);男女发病比例为1.9:1;病例多发于5岁以下散居儿童(87.51％);实验室病原学检测739份标本,检出EV71型187份(25.30％),CoxA16型263份(35.59％),其他肠道通用病毒感染106份(14.34％);2012年核酸检测总阳性率和EV71阳性率明显低于2011年(P＜0.01),CoxA 16阳性率明显高于2011年;重症20例,死亡0例.结论 沧州市2012年HFMD感染以CoxA16型病毒为主,提示今后沧州市HFMD的疫情应侧重CoxA 16型病毒的防控.
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Wnt2和β-catenin在乳腺癌及其配对癌旁乳腺组织中的表达与临床意义
目的 探讨Wnt2和β-catenin在乳腺癌及其配对癌旁乳腺组织中的表达与临床意义.方法 采用RT-PCR法检测7份乳腺癌及其配对癌旁乳腺组织中Wnt2和β-catenin基因mRNA的转录水平;免疫组织化学方法检测40份浸润性乳腺导管癌及其配对癌旁乳腺组织中Wnt2和β-catenin蛋白的表达水平;分析Wnt2和β-catenin与乳腺癌临床病理特征的相关性及二者联合检测与乳腺癌恶性程度及淋巴结转移的相关性.结果 乳腺癌组织中Wnt2和β-catenin基因mRNA的相对转录水平均显著高于配对癌旁乳腺组织(P＜0.05).Wnt2在配对癌旁乳腺组织细胞质中呈弱表达,在浸润性乳腺导管癌组织细胞质中呈高表达,乳腺癌Wnt2阳性表达率(77.5％)显著高于配对癌旁乳腺组织(15.0％)(P＜0.05);配对癌旁乳腺组织中β-catenin均表达于细胞膜中,在浸润性乳腺导管癌组织细胞质及细胞核中均有表达,异常表达率为67.5％(27/40).Wnt2和β-catenin的表达与浸润性乳腺导管癌患者年龄无关(P＞0.05),与乳腺癌临床分期、病理组织学分级及淋巴结转移有关(P＜0.05).Wnt2和β-catenin均为阳性表达者的肿瘤恶性程度和淋巴结转移的发生率显著高于两者均为阴性或两者之一为阳性表达者(P＜0.05).结论 Wnt2和β-catenin表达在乳腺癌发生和侵袭转移中可能起重要作用,本实验为进一步探讨Wnt2和β-catenin在乳腺癌发病机制中的作用奠定了基础.
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表皮生长因子受体-3真核表达质粒的构建及其免疫小鼠抗体滴度的检测
目的 构建表皮生长因子受体-3 (v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3,ErbB3)真核表达质粒,并检测其免疫小鼠血清抗体滴度.方法 以乳腺cDNA文库为模板,PCR扩增ErbB3全长基因,插入pcDNA3.1-myc/His载体,构建重组表达质粒pcDNA3.1-myc/His-ErbB3.同时以质粒pcDNA3.1-myc/His-ErbB3为模板,PCR扩增ErbB3-ECD和ErbB3-RLD基因,插入pET-28a(+)和pGEX-KG载体中,构建重组表达质粒pET-28a(+)-ECD和pGEX-KG-RLD;将质粒pET-28a(+)-ECD和pGEX-KG-RLD转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Western blot鉴定后,经GST柱或镍亲和柱纯化,BCA法定量纯化后蛋白.以60 μg质粒pcDNA3.1-myc/His-ErbB3免疫BALB/c小鼠,4次免疫后,经小鼠尾静脉采血,分离血清,以纯化后的ErbB3-ECD和ErbB3-RLD蛋白为包被抗原,采用间接ELISA法检测小鼠血清抗体滴度.结果 3种质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确.表达的重组蛋白ErbB3-ECD和ErbB3-RLD在相对分子质量约76 000和46 000处可见特异蛋白条带,浓度分别为2和1 mg/ml,免疫后的小鼠血清抗体滴度分别为1:400和1:10000.结论 ErbB3全长质粒免疫BALB/c小鼠后,经ErbB3-ECD和ErbB3-RLD蛋白初步筛选,已获得ErbB3的多克隆抗体,为后期ErbB3单抗的制备以及以ErbB3为靶点的核酸免疫治疗奠定了基础.
| 年 | 期数 |
| 2019 | 01 02 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 |
| 2000 | 01 02 03 04 |
