Hp尿素酶B亚单位减毒鼠伤寒菌重组疫苗的制备和生物效应研究

目的研制表达幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)的减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗,并观察其生物学效应.方法以幽门螺杆菌标准株--悉尼株(SS1)的基因组DNA为模板,构建Hp尿素酶B亚单位减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗SL3261/pTC01-UreB.经口服免疫BALB/c小鼠后,检测肠液中抗UreB的特异性IgA抗体和血清中IgG抗体,同时观察小鼠体重、胃黏膜炎症程度等一般情况.结果构建Hp-UreB的SL3261/pTC01-UreB菌株,连续传80代可稳定表达Hp-UreB,菌落提取质粒后酶切及PCR鉴定均与pTC01-UreB符合;SDS-PAGE和Western blot显示pTC01-UreB转化SL3261可表达与Hp-UreB亚单位相符的相对分子质量约61 000蛋白,该蛋白能与抗Hp兔血清反应;SL3261/pTC01-UreB口服免疫BALB/c小鼠的肠液中抗UreB的特异性IgA抗体和血清中IgG抗体明显增高,而小鼠体重和胃粘膜炎症指数与对照组差异无显著意义.结论Hp-UreB的减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗SL3261/pTC01-UreB口服免疫小鼠可诱导特异性免疫应答.

抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因在CHO细胞中的表达

目的构建抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因,并在CHO细胞中表达.方法采用RT-PCR及RACE技术从鼠杂交瘤细胞克隆免疫球蛋白可变区基因,与人免疫球蛋白恒区基因拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因,转染CHO细胞并测定其表达量.结果构建的嵌合抗体基因在CHO细胞中的初始表达量为0.71μg/ml,亚克隆后表达量达0.95μg/ml.结论已成功构建抗人TNF-α嵌合抗体基因,并在CHO细胞中得到了高效表达.

人溶菌酶cDNA在COS-1细胞及小鼠乳腺的暂态表达

目的研究自行克隆的1.5kbhLYZ双链cDNA的表达特性.方法将此cDNA亚克隆人真核表达载体pcDNA3及乳腺特异表达载体p205C3,重组载体pcDNA3LYZ转染COS-1细胞,用间接免疫荧光法检测转染细胞中hLYZ cDNA的表达;重组载体p205C3LYZ注射哺乳期小鼠,用微球菌溶解试验和斑点杂交试验检测hLYZ cDNA在小鼠体内的表达.结果hLYZ cDNA在转染的COS-1细胞中得到了正确表达;小鼠体内表达并分泌到乳汁中的hLYZ达87μg/ml,且目的基因的表达具有较好的组织特异性.结论hLYZ cDNA可在COS-1细胞中有效表达,基因构件p205C3LYZ可以用于动物乳腺生物反应器研制.

人MC1R基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统进行人恶性黑色素瘤A375细胞MC1R基因在Sf9昆虫细胞中的表达.方法以pMD18-T-MC1R为模板,利用PCR方法扩增人MC1R基因,将MC1R基因连接到pfastBac1质粒上,与穿梭载体DH10Bac转座,获得Bacmid-MC1R质粒后,通过脂质体介导,转染Sf9细胞,使其表达重组杆状病毒,经SDS-PAGE检测表达产物,放射受体分析法检测目的蛋白MC1R活性.结果Bacmid-MC1R质粒转染Sf9细胞后的SDS-PAGE图谱,在相对分子质量为35 000处有一条新生蛋白带.放射受体分析结果显示表达的蛋白与标记配体特异亲和,具有生物学活性.结论MC1R基因成功在真核细胞中得到表达.

人Leptin基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆Leptin基因,构建其重组表达菌株,并对表达产物进行免疫学鉴定.方法利用RT-PCR方法从脂肪细胞RNA中扩增出人瘦素前体(pre-Leptin)的cDNA片段和去信号肽序列的Leptin成熟基因片段,并插入pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达重组人瘦素(rh-Leptin)的菌株.结果DNA序列分析显示获得的pre-Leptin和成熟基因片段的序列与预计序列一致,菌株诱导后经SDS-PAGE检测,rh-Leptin表达量达菌体总蛋白的40%以上.Western blot分析显示重组Leptin具有免疫学活性.结论已获得高效表达Leptin的重组菌株.

C型口蹄疫病毒VP1基因的串联与原核表达

目的构建C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,并鉴定其表达产物的免疫反应性.方法首先合成C型口蹄疫病毒C-S8C1株VP1基因的3个抗原表位,并克隆到pMD18-T载体上,再按设计的酶切位点酶切后连接,构建出C型VP1双拷贝基因片段(VP1C).将VP1C基因连接到原核表达载体pET-CKS上,构建重组质粒pETCKS-VP1C,转入BL21菌中进行原核表达.采用SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物,并利用包涵体洗涤法对表达产物进行初步纯化.结果VP1C基因在大肠杆菌中获得表达,产量占沉淀蛋白的45%,且表达产物可以被C型口蹄疫病毒标准血清所识别.VP1C重组蛋白纯度达84.1%.结论已成功构建了C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,所表达的VP1C有良好的免疫反应性,可以作为检测C型口蹄疫病毒的候选基因.

狂犬病毒糖蛋白DNA疫苗的构建及免疫效果的研究

目的构建狂犬病毒糖蛋白基因DNA疫苗,并检测其免疫小鼠的免疫应答.方法用RT-PCR法扩增和分离CTN株狂犬病毒糖蛋白基因,测序后克隆入VR1055载体中,构建重组质粒VR1055-CTN,经碱裂解法提取质粒,并经Sepharose4FF柱层析纯化后免疫NIH小鼠,用ELISA法检测体液抗体,用MTT法检细胞免疫,并进行常规效力试验.结果VR1055-CTNDNA疫苗具有较好的诱导狂犬病毒抗体的能力,在诱导细胞免疫中,刺激脾淋巴细胞转化指数和小鼠血清中的IL-2活性均高于空白载体对照,差异有显著意义(P=0.000).效力试验的小鼠存活率分别为73%和25%.结论该疫苗既能诱导体液免疫,又能诱导细胞免疫,并具有较好的免疫保护效果.

同源比较法克隆单抗CAb-1重链可变区基因

目的获得抗人大肠癌单抗CAb-1重链可变区VH的准确基因.方法结合生物信息学同源比较分析,利用高兼并的FR1 5'端处引物扩增的单抗CAb-1的VH基因,并与数据库中序列比对,在同源性高的抗体序列的信号肽处二次设计引物,用RT-PCR法获得抗体基因VH的准确序列.结果选定了与已知抗体VH高度同源的序列进行引物设计.凝胶电泳可见预期大小DNA条带.经测序表明,配对于信号肽处的扩增产物不仅与配对于抗体可变区FR1的结果一致,而且也纠正了配对于CAb-1的VH的FR1的兼并引物所引入的氨基酸突变.结论所优化设计的引物能够扩增完整的抗人大肠癌单抗CAb-1重链可变区基因,为小分子工程抗体改造奠定了基础.

羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原嵌合基因的构建及在毕赤酵母中的表达

目的构建羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原嵌合基因,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达.方法用PCR方法,从含乙肝病毒全长基因的质粒中扩增出S和pre-S2(Met1-Gly26)2个基因片段,并将S2融合于S基因的3'端,构建SS2嵌合基因.将上述片段克隆到pBluescriptⅡSK(+)载体中,测序后亚克隆到毕赤酵母表达载体pAO815,构建重组表达质粒.用电转化法将重组质粒导入Pichia GS115细胞,构建重组表达菌株GS115-SS2.重组菌株经甲醇诱导后制备抗原初提液,进行ELISA和Western blot分析.结果表达产物经ELISA检测具有S和前S2抗原性.Western blot分析表明,该融合抗原既能与S抗体结合,也能与前S2抗体结合,其相对分子质量约为27000,与理论值相符.抗原初提物的反向血凝(RPHA)效价达1:1 024,约相当于16μg/ml.结论已成功构建羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原嵌合基因,并在毕赤酵母中得到有效表达.

自我复制性核酸疫苗

迄今,核酸疫苗免疫诱导效力偏低,是限制其实际应用的原因之一.尽管目前发展了许多策略,在不同程度上提高了核酸疫苗的免疫效力,但仍然未达到可供实用化的理想效果.而且,质粒载体长期在宿主细胞中存留,存在着可能与宿主细胞染色体DNA随机整合和细胞转化的潜在危险[1].此外,外源基因在体内长期高水平表达,可能会刺激机体产生抗DNA抗体,导致自身免疫病或免疫耐受等问题[2].所以,提高核酸疫苗在机体内的表达水平,加强其免疫效力,同时又能保证核酸疫苗的安全性,已成为核酸疫苗研究中的关键问题.

选择素及其配体与白细胞的起始粘附

选择素是一类重要的粘附分子,主要介导白细胞与血管内皮细胞的起始粘附.选择素家族包括3个成员(Lselectin、P-selectin和E-selectin),分别表达于白细胞、血小板和血管内皮细胞的表面.选择素所识别和作用的配体是一些糖类化合物.唾液酸化、岩藻糖基化和硫酸化等化学修饰对于配体的功能十分重要.选择素与其配体的相互作用在使白细胞被捕捉的同时,可以转导胞外信号,使白细胞进一步活化并稳定粘附.白细胞粘附与人体的多种生理和病理过程密切相关.

固相提取法检测人血浆中亚甲蓝

目的建立固相提取法,检测人血浆中的亚甲蓝,并验证此方法的稳定性和精确性.方法根据Waters OasisHLB固相提取小柱的技术参数,针对血浆样品建立小柱的活化、清洗和样品洗脱条件,并以此方法进行固相提取小柱提取亚甲蓝的回收率及血浆中亚甲蓝的添加量和残留量测定.结果当血浆中亚甲蓝浓度大于0.05 μmol/L时,固相提取小柱对亚甲蓝的回收率大于94%,偏差小于5.0%.当血浆中亚甲蓝浓度为1、2、3、4和5μmol/L时,测定值与加入值呈线性相关,r=0.99;当血浆中亚甲蓝浓度为0.4、0.2、0.1、0.05和0.01μmol/L时,测定值与加入值也呈线性相关,r=0.99.结论此方法简便、稳定,灵敏度和精确度高.适用于检测血浆中的亚甲蓝.

表达重组人可溶性TRAIL的毕氏酵母发酵工艺

目的优化rhsTRAIL毕氏酵母工程菌在5 L发酵罐中的发酵表达工艺参数.方法研究培养基种类、细胞密度、甘油含量、pH值、甲醇浓度、甲醇流加速率及诱导时间等参数对工程菌生长及目的蛋白表达的影响,并用电镜观察其诱导肿瘤细胞凋亡特征.结果在无机盐培养基中,按10%接种A600=8～12的种菌后,24h酵母菌增殖至A600=76;甘油含量为1%时,菌体生长速度快(A600=160);培养基pH值5.0,甲醇终浓度为1%时,诱导96h表达量高达到120 mg/L,并具有诱导肿瘤细胞凋亡特征.结论rhsTRAIL毕氏酵母的发酵工艺参数为:无机盐培养基,pH值5.0,接种10%A60o=8～12的种菌,甘油含量1%,甲醇终浓度1%,诱导96h.

硫乙醇酸盐培养基中的刃天青的作用分析

目的分析刃天青在硫乙醇酸盐培养基中的作用.方法按2000版<中国生物制品规程>中培养基灵敏度的测定方法,将0.1%刃天青以不同量加入硫乙醇酸盐培养基中,用厌氧菌株生孢子梭状芽胞杆菌、需氧菌株短芽胞杆菌及乙型溶血性链球菌分别进行不同含量刃天青、煮沸驱氧与未驱氧的灵敏度比较.结果不同刃天青含量与未加刃天青、煮沸驱氧与未驱氧的硫乙醇酸盐培养基的灵敏度无明显差异.结论用以上3个标准菌株检测不同刃天青含量的硫乙醇酸盐培养基的灵敏度,其指示剂的作用不明显.

肾综合征出血热病毒在Vero细胞中增殖动态观察

目的观察Ⅰ型和Ⅱ型肾综合征出血热病毒在Vero细胞中的增殖动态.方法将Ⅰ型和Ⅱ型出血热病毒分别感染Vero细胞,并同时采用免疫荧光法检测病毒滴度.结果Ⅰ型和Ⅱ型出血热病毒感染Vero细胞后9～16 d内病毒滴度均大于6.0 LgCCID50/ml;用两种不同方法,在感染10～30d中,每隔3 d收获一次病毒液,感染后第13天和第16天收获的病毒液病毒滴度均大于7.0 LgCCID50/ml.结论Ⅰ型和Ⅱ型出血热病毒能够在Vero细胞中增殖并达到高滴度,感染后10～25d病毒毒力保持稳定.

Vero细胞疫苗生产过程中宿主细胞蛋白含量分析

目的了解Vero细胞疫苗中间产品中宿主细胞蛋白(Host cell protein,HCP)的含量变化.方法模拟Vero细胞疫苗生产工艺流程,制备Vero细胞HCP,免疫家兔制备Vero细胞HCP免疫血清,经Protein A Sepharose CL-4B亲和层析,制备纯化的抗Vero细胞HCP IgG,通过SDS-PAGE和Western blot分析Vero细胞乙型脑炎疫苗及Vero细胞SARS疫苗各中间产品的蛋白、HCP及病毒抗原成分的含量变化.结果Vero细胞乙型脑炎疫苗和Vero细胞SARS疫苗中间产品中均存在一定量HCP,不同的纯化工艺均可以去除大部分HCP,随着生产工艺的进行,疫苗中间产品中HCP的含量逐渐降低,病毒成分的纯度逐渐增高,但纯化后产品中仍存在少量HCP.结论Vero细胞乙型脑炎疫苗和Vero细胞SARS疫苗均存在一定量HCP.

用乳糖作为诱导剂进行重组蛋白的表达

目的研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组蛋白的表达.方法以表达SARS刺突蛋白片段的工程菌BL21(DE3)/S为模型菌株,采用葡萄糖、甘油作为碳源,不同浓度的乳糖和异乳糖作为诱导剂,在摇瓶中进行表达实验.在40L发酵罐中进行验证.结果在摇瓶实验中,乳糖浓度大于0.5 mmol/L即可以很好地诱导目的蛋白的表达,表达量与IPTG诱导时相当;葡萄糖的存在可以抑制乳糖,但不能抑制异乳糖的诱导作用;使用甘油作为碳源,既不抑制乳糖,也不抑制异乳糖的诱导作用.在发酵罐实验中,诱导初始阶段葡糖糖的存在抑制乳糖的诱导作用.结论在以乳糖操纵子为调控手段的工程菌表达系统中,可以使用乳糖作为诱导剂,诱导阶段应采用非葡萄糖碳源.

检测禽流感病毒RT-PCR一步法的建立及H5、H9亚型的鉴定

目的建立禽流感病毒(AIV)通用型RT-PCR一步法,并鉴定AIV H5和H9亚型.方法根据流感病毒高度保守的M1基因序列,设计一套通用型引物,建立AIV RT-PCR一步法.根据H5、H9亚型HA基因序列,分别设计一套特异性引物,其上、下游引物分别位于裂解位点两侧,应用RT-PCR一步法检测AIV H5和H9亚型,并验证所建立方法的敏感性;通过检测NDV、IBV和IBDV等RNA病毒及计算机软件模拟检测,验证其特异性.结果所建立AIV系列RT-PCR检测方法具有特异、敏感、简便和快速的特点.结论该方法可用于AIV的检测,H5、H9亚型的鉴定及致病性分析.

冷原子吸收法检测硫柳汞含量

目的应用冷原子吸收法检测硫柳汞含量.方法将硫柳汞消化还原成汞蒸汽,经测汞仪检测.结果用该方法制备标准曲线具有很好的相关性,相关系数r(n=10)为0.999 7±0.000 2.样品重复检测10次,平均变异系数为1.03%,回收率为96.0%.与双硫腙滴定法检测结果进行比较,差异无显著意义.结论此法可作为硫柳汞含量检测的常规方法.

口服脊髓灰质炎疫苗效力标准品国际协作研究

目的评价第2代脊髓灰质炎疫苗效力国际标准品的适用性,并确定其标示滴度.方法由WHO参考实验室英国国家检定所(NIBSC)组织协作研究,并提供测定样本及单克隆抗体,共有13个实验室参加,各实验室分别采用单抗及内部参考品进行测定,结果递交NIBSC进行总结.结果本实验室对各样本测定的结果与各实验室测定结果均值总体上是一致的,变异系数基本在5%以下.结论本实验室目前采用的病毒滴度测定方法及试剂的敏感性、标准化程度均与国际一致.

甲肝-麻疹二联疫苗的稳定性

目的观察甲肝-麻疹二联疫苗的稳定性.方法取5批甲肝-麻疹二联疫苗于2～8℃、室温(22℃±2℃)及37℃放置不同时间后,分别进行甲肝病毒和麻疹病毒滴度测定.结果该二联疫苗于2～8℃放置22个月、室温放置4个月及37℃放置7 d,疫苗中两种病毒滴度基本保持不变.结论甲肝-麻疹二联疫苗具有与其相应单价疫苗同样良好的稳定性.

SARS灭活疫苗的研制及其质量控制

目的研究适合SARS病毒灭活疫苗的生产工艺及其质量控制.方法连续制备3批疫苗,按拟定规程进行疫苗原液和疫苗各项指标检测.结果各项检测指标均符合拟定规程规定.结论我所生产的SARS灭活疫苗工艺稳定,质量可控.

甲型肝炎灭活疫苗抗原剂量的优化

目的通过体内效力实验,优化甲肝灭活疫苗抗原适免疫剂量.方法用1.0 mg/ml Al(OH)3将不同梯度剂量的实验苗及参比苗4倍递增系列稀释,经腹腔免疫小白鼠,4周后采血,检测各免疫组小鼠血清甲肝抗体阳转率,用ReedMuench法计算半数有效稀释倍数,比较抗原免疫剂量与半数有效稀释倍数之间的剂量-效应关系.结果甲肝灭活疫苗实验苗抗原免疫剂量与半数有效稀释倍数之间存在着良好的剂量-效应关系.结论半数有效稀释倍数可用于不同品牌甲型肝炎灭活疫苗效力的评价及适抗原免疫剂量的优化.

汉坦病毒DNA疫苗pVAX/G2诱导小鼠的免疫应答

目的探讨含汉坦病毒L99株G2糖蛋白基因的DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的免疫应答.方法重组质粒pVAX/G2转染cos-7细胞,用间接免疫荧光法(IFA)检测瞬时表达产物.经碱裂解法提取质粒pVAX/G2,Sepharose CL-4B柱层析纯化后,免疫BALB/c小鼠(SPF),并采用含有人IL-2基因的重组质粒pVAX/IL-2及重组人IL-2蛋白作为DNA疫苗的佐剂,检测小鼠的体液免疫和细胞免疫应答.结果重组质粒pVAX/G2能够在真核细胞中表达.免疫小鼠血清中能够检测到抗汉坦病毒中和抗体、酶标抗体和荧光抗体.淋转刺激指数和脾淋巴细胞上清液中IL-2活性,与空载体pVAX1阴性对照比较差异有显著意义.质粒佐剂pVAX/IL-2能显著提高DNA疫苗的细胞免疫水平.结论含汉坦病毒L99株G2糖蛋白基因的DNA疫苗能诱导BALB/c小鼠产生一定强度的体液免疫和细胞免疫应答.

短棒状杆菌有效成分的分离及其作用

目的减轻短棒状杆菌全菌体制剂接种后的局部疼痛等副作用.方法采用超声破碎、蛋白水解及脱脂的方法提取了细胞壁,通过脾激活试验及抑瘤试验,检测纯化的短棒状杆菌细胞壁活性对家兔股四头肌的局部刺激作用及热原反应.结果纯化的短棒状杆菌细胞壁可使小鼠脾激活指数达到4.8,能抑制艾氏腹水瘤的生长,生存率达到80%;家兔股四头肌肌肉注射后未见局部充血坏死;家兔热原试验未见明显发热.结论纯化的短棒状杆菌细胞壁不仅保留了全菌体制剂所具有的活性,而且明显减轻了局部的刺激作用.

发光试剂与酶联免疫试剂检测丙型肝炎抗体的临床评价

目的对丙型肝炎抗体的酶联免疫试剂和化学发光试剂进行临床考核和比较.方法用国外进口注册的抗HCV酶联免疫试剂和化学发光试剂检测丙型肝炎试剂国家参考品和283份可疑丙肝感染者血样,对不一致样品再用HCV RI-BA和HCV RNA PCR试剂进行确证.结果两种试剂均可达到国家标准,酶联免疫试剂特异性较好,化学发光试剂灵敏度较高.结论两种试剂均可用于丙型肝炎抗体检测.

介绍一种简便的DNA胶回收方法

目前DNA的回收方法主要有柱回收法、玻璃奶回收法等,这些方法回收效率较低,难以保证DNA的回收率及纯度.我们介绍一种简单经济适用,而且回收率较高的方法,并与传统的回收方法进行了比较.

疫苗临床研究阶段医学伦理学原则的应用

医学伦理学原则的应用已成为新疫苗审批的基本要求.疫苗临床研究中必须体现尊重、受益、公正等原则.实践中暴露的伦理学问题主要表现在研究对象选择、临床反应观察、研究结果告知、副反应处理等环节.成立伦理委员会,认证研究者资格,开展宣传教育,签署知情同意书及处理不良事件等措施,可保障疫苗临床研究中伦理学原则的体现.

单克隆抗体RhD血型定型试剂质量要求及临床应用要点

本文结合目前我国临床安全输血和新生儿溶血病诊断、预防以及人群血型普查等工作的需要,对临床常规应用的单克隆抗-D人血型定型试剂(单克隆抗体)的质量要求和应用要点提出了具体的意见.

目前收录《中国生物制品学杂志》的数据库

2006年《肿瘤防治杂志》开办国家级Ⅱ类学分继续医学教育通知

WHO主持我国SARS疫苗临床研究专项研讨会

由北京科兴生物制品有限公司研制的SARS灭活疫苗已于2004年12月在中日友好医院完成随机、双盲对照的Ⅰ期临床研究,取得了较好的预期结果.

第八届全国生物制品学术研讨会征文及会议通知(第二轮)