曼氏血吸虫虫卵白细胞介素-4诱导因子的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 原核表达曼氏血吸虫虫卵白细胞介素-4诱导因子(IL-4-inducing principle of schistosoma eggs,IPSE),并制备小鼠多克隆抗体.方法 人工合成IPSE基因,采用PCR技术克隆其成熟体开放阅读框,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-IPSE.转化E coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析后,应用组氨酸标签蛋白纯化柱纯化包涵体蛋白,免疫BALB/c鼠,制备多克隆抗体.结果 克隆的IPSE基因与GenBank中登录的基因序列同源性为100％;重组表达质粒pET-28a-IPSE经PCR及双酶切鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为16 000,以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30％,可与鼠抗His单抗特异性结合；用纯化的包涵体蛋白免疫BALB/c小鼠后,获得的特异性抗血清效价为2× 10-4,该血清可与IPSE蛋白发生特异性反应.结论 已原核表达、纯化了曼氏血吸虫IPSE蛋白,并制备了高滴度的特异鼠抗血清,为进一步从日本血吸虫中筛选相似蛋白及研究其功能奠定了基础.

新型低胆固醇发酵香肠的毒性分析

目的 对新型低胆固醇发酵香肠进行安全性评价.方法 依据GB15193-2003《食品安全性毒理学评价程序和方法》,对低胆固醇发酵香肠进行第一、二阶段的食品毒理学试验,包括急性毒性试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、Ames试验和30 d喂养试验.结果 新型低胆固醇发酵香肠对小鼠毒性极微或无毒性；小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验和Ames试验结果 均为阴性；30 d喂养试验表明,对Wistar大鼠各项指标均无明显影响.结论 新型低胆固醇发酵香肠属实际无毒级,未见任何遗传毒性作用.

蛋白Ⅲ-α-银环蛇毒素融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的 构建适合选择感染性噬菌体( Selectively infective phage,SIP)技术筛选的蛋白Ⅲ-α银环蛇毒素(α-Bungarotoxins,α-BTXs)融合蛋白表达质粒.方法 从银环蛇毒腺中提取总RNA,RT-PCR扩增α-BTXs基因,插入表达载体pTTMIN,转化E.coli XL1-Blue,IPTG诱导表达.经SDS-PAGE、Western blot及竞争抑制ELISA法检测融合蛋白的表达.结果 获得的α-BTXs基因序列与相关报道完全一致；融合蛋白表达质粒构建正确；融合蛋白的表达量可达菌体总蛋白的20％,可与抗蛇毒素血清发生特异性反应,且保持了α-BTXs的抗原性.结论 成功构建了蛋白Ⅲ-α-BTXs融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌中表达了融合蛋白,为利用SIP技术筛选抗α-BTXs人源抗体奠定了基础.

在烟草中瞬时表达人角质细胞生长因子1

目的 在烟草中瞬时表达人角质细胞生长因子1(Keratinocytegrowth factor1,KGF1),旨在寻求一种低成本、方便、大量生产rhKGF1的方法.方法 以重组质粒pET3c-hKGF1为模板,通过PCR法扩增hKGF1基因片段,插入经改造的马铃薯病毒X双元表达载体pGR 107中,冻融法转化感受态农杆菌GV3101,以获得的GV3101-pGR107-rhKGF1侵染烟草.以绿色荧光蛋白基因(smGFP)为报告基因,建立马铃薯X病毒(PVX)瞬时表达体系.用紫外灯连续20 d观察经GV3101-pGR107-smGFP侵染的烟草中smGFP的表达.经RT-PCR法分析烟草中rhKGF1基因mRNA的转录,SDS-PAGE 、Western blot分析烟草中rhKGF1蛋白的表达.结果 重组表达质粒pGR107-rhKGF1经PCR及测序证实构建正确；转化的农杆菌GV3101-pGR 107-rhKGF1侵染的烟草中目的蛋白的表达量在第8天达大.目的蛋白rhKGF1在烟草中获得成功表达.结论 在烟草中瞬时表达了rhKGF1,为其单克隆抗体的制备及产业化奠定了基础.

BubR1在乳腺癌细胞发生紫杉醇耐药中的作用

目的 探讨有丝分裂期检查点蛋白BubR1在乳腺癌细胞发生紫杉醇耐药中的作用.方法 设计并合成针对BubR1基因的特异性干扰RNA(siRNA)片段,连接入穿梭质粒后,包装成腺病毒(Ad-BubR1-siRNA),感染MCF-7细胞,采用实时荧光定量RT-PCR和Western blot法评价BubR1干扰对MCF-7细胞BubR1基因和蛋白表达的影响.分别通过cck8试验、染色体计数分析、细胞集落生成试验、Hochest染色和细胞划痕试验评价干扰BubR1后,MCF-7细胞在紫杉醇作用下增殖、染色体稳定性、凋亡及迁移能力等生物学功能.结果 重组腺病毒的滴度为1010 pfu/ml,其能有效抑制BubR1基因在mRNA和蛋白水平的表达.干扰BubR1表达后,MCF-7细胞在紫杉醇作用下表现为增殖和迁移能力增强,染色体不稳定性增加,集落生成能力增强,凋亡能力下降.结论 下调BubR1基因可能导致乳腺癌细胞MCF-7对紫杉醇的耐药性增强.

硫酸乙酰肝素与氢氧化锌复合佐剂对丙型肝炎病毒重组抗原表位多肽疫苗的免疫增强作用

目的 探讨硫酸乙酰肝素( Heparan sulfate,HS)与氢氧化锌复合佐剂对丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)重组抗原表位多肽疫苗诱导小鼠体液免疫的增强作用.方法 将HS( 100 μg)与氢氧化锌(1.0 mg)复合佐剂与高(100 μg/0.1 nl)、中(50μg/0.1 ml)、低(25 μg/0.1 ml)剂量的HCV重组抗原表位多肽疫苗混合后免疫小鼠,并设阴性对照组(生理盐水)、无佐剂组、铝佐剂组、HS单一佐剂组和氢氧化锌单一佐剂组.于免疫后4、8、12、16、20周采血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG抗体滴度.结果 除阴性对照组外,各实验组小鼠血清中均检测出HCV特异性IgG抗体.抗原高剂量复合佐剂组在各时间点的HCV特异性IgG抗体滴度均显著高于无佐剂组、铝佐剂组、HS单一佐剂组和氢氧化锌单一佐剂组(P均＜0.05)；抗原中剂量复合佐剂组小鼠产生的抗体滴度与铝佐剂组相当.结论 HS与氢氧化锌复合佐剂能有效增强HCV重组抗原表位多肽疫苗诱导的小鼠体液免疫应答,且能够在一定程度上降低抗原的使用量.

人轮状病毒vp4全基因原核穿梭表达质粒的构建及鉴定

目的 构建人轮状病毒( Rotavirus,RV)vp4全基因原核穿梭表达质粒,经大肠杆菌表达验证后转化入双歧杆菌.方法 从pMD19-T simple-vp4质粒中扩增RV vp4全基因,克隆至pBEX载体中,构建重组表达质粒pBEX-vp4,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,电转化法将重组质粒转化人双歧杆菌,提取质粒,进行PCR及双酶切鉴定.结果 重组表达质粒pBEX-vp4经酶切、PCR和测序证明构建正确；在大肠杆菌BL21 (DE3)中可表达相对分子质量约87 000的重组VP4蛋白,表达量较低,以包涵体形式表达,可与羊抗人轮状病毒多克隆抗体特异性结合；经PCR及双酶切鉴定,重组质粒pBEX-vp4已成功转入双歧杆菌中.结论 重组表达质粒pBEX-vp4可在大肠杆菌中表达RV VP4蛋白,并可经电转化法有效地将重组表达质粒转化入双歧杆菌,为下一步在双歧杆菌中进行表达及研制基于双歧杆菌表达系统的RV重组亚单位口服活疫苗奠定了基础.

DC-CIK细胞体外抗白血病K562细胞的免疫效应

目的 探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer cell,CIK)与树突状细胞(Dendritic cell,DC)共同培养后获得的DC-CIK细胞体外抗白血病细胞株K562的免疫效应.方法 分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),在细胞因子的作用下诱导成DC和CIK细胞,将两种细胞共同培养3d获得DC-CIK细胞,MTT法检测细胞增殖活性；流式细胞术检测细胞表型；以共培养3d的DC-CIK作为效应细胞,以PBMC、DC、CIK细胞单独培养作为对照,K562细胞作为靶细胞,采用MTT法检测各组细胞的杀伤活性,ELISA法检测各组细胞培养上清中白细胞介素-17(IL-17)水平,并分析IL-17与杀伤细胞间的相关性.结果DC-CIK细胞增殖快；收获的细胞大部分以成熟DC为主,CIK细胞主要是具有杀伤作用的淋巴细胞；DC-CIK细胞杀伤K562细胞的活性和分泌IL-17的水平均明显高于对照组(P＜0.05),且随着IL-17释放量的增加,细胞毒性增强.结论 DC-CIK细胞通过分泌细胞因子的作用杀伤白血病细胞.

叉头转录因子1基因沉默对水通道蛋白9在正常人肝细胞中表达的影响

目的 观察叉头转录因子1 (Forkhead transcription factor 1,FoxO1)基因沉默对水通道蛋白9(Aquaporin 9,AQP9)在正常人肝细胞L-02中表达的影响.方法 将4条特异性干扰质粒FoxO1-shRNA1～4及阴性对照质粒FoxO 1-NP经脂质体介导瞬时转染L-02细胞,荧光显微镜下观察转染效率,筛选FoxO1基因沉默效率佳的干扰质粒转染的肝细胞,经RT-PCR及Western blot法从mRNA及蛋白水平检测其对AQP9表达的影响,并在转染后不同时间点,经荧光定量PCR检测AQP9的转录时间谱.结果 4条特异性干扰质粒FoxO1-shRNA1～4均有不同程度的沉默效果,其中以FoxO 1-shRNA2沉默效果佳,与对照组相比,AQP9在L-02细胞中的mRNA及蛋白水平的表达均下降,且差异均有统计学意义(P＜0.05);AQP9的表达随着转染后时间的延长而降低,在转染后60 h达抑制峰值,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 FoxO1基因沉默对AQP9在正常人肝细胞中的表达有明显的影响,为下一步采用染色质免疫共沉淀技术研究不同时间点FoxO1与AQP9启动子区IRE结合水平的动态变化提供了依据.

氢氧化铝佐剂的过敏性反应

目的 研究氢氧化铝佐剂的过敏性反应.方法 取豚鼠42只,随机分为7组:Al( OH)31.5 mg/ml组、Al(OH)3 4 mg/ml组、Al(OH)3 7 mg/ml组、Al(OH)3 10 mg/ml组、Al(OH)3 13 mg/ml组、阴性对照(生理盐水)组和阳性对照(1％ BSA) 组,致敏,12d后,分别经豚鼠静脉注射各浓度的Al(OH)3、生理盐水和1％ BSA,观察各组豚鼠的反应及相关症状出现和消失的 时间.另取豚鼠24只,随机分为4组:Al(OH)31.5 mg/ml组、Al(OH)34 mg/ml组、阴性对照(生理盐水)组和阳性对照(1％ BSA)组,经豚鼠背部皮肤分别皮内注射抗血清,48 h后,各组分别静脉注射1.5 mg/ml、4 mg/ml的Al(OH)3、生理盐水和1％ BSA+1％伊文思蓝染料(v/v=1∶1),进行激发；30 min后,测量豚鼠皮肤内层的蓝色斑点大小.结果 全身主动过敏试验中, 氧氧化铝浓度在4 mg/ml以下,豚鼠无过敏反应,7和10 mg/ml时为过敏反应强阳性,13 mg/ml时为过敏反应极强阳性.皮 肤被动过敏试验中,Al(OH)31.5和4 mg/ml组豚鼠均未出现.过敏反应.结论 氢氧化铝浓度在4 mg/ml以下无过敏反应,较 安全可靠.

适于重组CHO细胞培养的无血清培养基的制备

目的 制备适于重组CHO细胞培养的无血清培养基(Serum-fee medium,SFM).方法 在本室制备的无血清、低蛋白培养基SFMC的基础上,开发支持重组CHO-K1细胞生长的无动物源、无蛋白培养基(Protein-free midium,PFM,以柠檬酸铁、硫酸锌和酵母水解物替换SFMC中的转铁蛋白、胰岛素和动物组织水解物)及化学成分确定的培养基(Chemically defined medium,CDM,以PFM培养基为基础,通过调整和优化氨基酸的浓度和其他部分营养物质浓度制备),评价各种无血清培养基的适应性、稳定性以及冻存、复苏性能,并分别在125 ml摇瓶和1.4L生物反应器中进行培养.结果 CHO-K1细胞在PFM和CDM中生长良好,经125 ml摇瓶培养,高细胞密度分别为9.3× 106和7.3× 106个/ml,大细胞密度与SFMC培养基相比,分别提高了107％和62％.经1.4L搅拌式生物反应器流加培养,PFM培养基的高细胞密度可达9.8×106个/ml,培养216 h时,细胞活性仍维持在80％,重组蛋白表达量达110.5 mg/L;采用CDM培养基经流加培养,CHO-K1细胞大密度可达9.5×106个/ml,但细胞培养时间较PFM培养基短.结论 在SFMC培养基的基础上,成功开发出培养效果更优的PFM和CDM培养基.

人IgG Fc标签融合表达载体的构建及H5HA1融合蛋白的表达

目的 构建人IgG Fc标签融合表达载体,表达并纯化H5 HA1融合蛋白.方法 以pCAGGS载体为基础,依次插入IL-2信号肽及人IgG Fc片段,构建人IgG Fc标签融合表达载体.将H5 HA1克隆至含人IgG Fc标签的融合表达载体pCAGGS-F-IL-2/Fc中,瞬时转染293T细胞,进行融合蛋白的表达.表达的蛋白经Protein G亲和层析一步法纯化.结果 人IgG Fc标签融合表达载体经酶切及测序证明构建正确；在293T细胞中分泌表达的H5 HA1与人IgG Fc的融合蛋白HA1-Fc相对分子质量约75 000,转染后72和96 h表达量高；纯化的融合蛋白纯度达90％以上,含量为1.63 μg/ml.结论 成功构建了人IgG Fc标签融合表达载体,表达并纯化了HA1-Fc融合蛋白,为流感病毒侵入及免疫机制的研究奠定了基础.

2-苯氧乙醇对无细胞百日咳原液及无细胞百白破联合疫苗安全性及免疫原性的影响

目的 探讨2-苯氧乙醇对无细胞百日咳(aP)原液及无细胞百白破联合疫苗( DTaP)安全性及免疫原性的影响.方法 分别制备以2-苯氧乙醇和硫柳汞作为防腐剂的aP原液,并配制以2-苯氧乙醇作为防腐剂的DTaP疫苗,对其安全性及免疫原性进行检测,并检测DTaP疫苗中2-苯氧乙醇的抑菌效果.结果 分别以2-苯氧乙醇和硫柳汞作为防腐剂制备的aP原液的安全性及免疫原性各项指标比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)；以2-苯氧乙醇作为防腐剂的DTaP疫苗各项检定指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求,DTaP疫苗及于37℃放置1个月的DTaP疫苗经无菌检查均合格.结论 2-苯氧乙醇可替代硫柳汞用作DTaP疫苗的防腐剂.

STAg与BCG-DNA和氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠的免疫效果

目的 观察弓形虫可溶性速殖子抗原(Soluble tachyzoite antigen,STAg)与BCG-DNA和Al(OH)3佐剂联合免疫小鼠的免疫效果.方法 将BALB/c小鼠随机分为5组,分别经小鼠头背部皮下注射20 μg STAg、50 μμg BCG-DNA+20μgSTAg、50 μg Al(OH)3+ 20 μg STAg、50 μg BCG-DNA+ 50 μg Al(OH)3+ 20 μg STAg,对照组注射生理盐水,共免疫4次.末次免疫后1周处死小鼠,采血分离血清,并制备脾细胞悬液,ELISA法测定小鼠血清IgG值及抗体效价；ELISPOT法检测分泌特异性IFNγ的淋巴细胞数量.结果 Al( OH)3+BCG-DNA+STAg组小鼠血清抗体效价和IgG值及产生特异性IFNγ的淋巴细胞数量均显著高于STAg组、BCG-DNA+ STAg组和Al(OH)3+STAg组(P＜0.05).结论 STAg联合BCG-DNA和Al(OH)3佐剂能诱导小鼠产生更强的体液免疫和细胞免疫应答,Al(OH)3与BCG-DNA佐剂对弓形虫STAg具有免疫协同效应.

博尔纳病病毒磷蛋白的原核表达及纯化

目的 构建博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)磷蛋白(p24蛋白)基因重组表达质粒,原核表达p24蛋白,并进行纯化.方法 通过RT-PCR法从BDV感染的少突胶质细胞株(Oligodendrocyte,OL)中扩增p24基因片段,构建重组表达质粒pET-41a-p24,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达,并对表达的重组蛋白进行亲和层析纯化.结果 经双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pET-41a-p24构建正确；表达的重组p24蛋白相对分子质量约24 000,表达量占菌体总蛋白的30％以上,主要以可溶形式表达；纯化的重组蛋白纯度达85％左右,可与鼠抗BDV p24单克隆抗体特异性结合.结论 已成功原核表达并纯化了重组BDVp24蛋白,为进一步建立BDV相关免疫学检测方法 奠定了基础.

乙型肝炎病毒核心抗原的原核表达及纯化

目的 原核表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg),纯化HBcAg病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP),并对其理化性质进行鉴定.方法 根据大肠杆菌密码子偏爱性对HBcAg基因进行密码子优化,全基因合成优化基因,克隆至载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-HBcAg,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达.重组蛋白经盐析和层析纯化后,经SDS-PAGE、Western blot、电镜观察、等电点分析、高效液相色谱(HPLC)分析和N-末端氨基酸测序等进行鉴定.结果 重组表达质粒经酶切和测序鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为21 000,为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的21.6％；纯化后其纯度可达99.4％,具有良好的反应原性,VLP形成良好,结构均一,等电点在pH6.0～6.9之间,HPLC分析形成T3和T4两种不同结构,N-未端序列正确,无氨基酸降解.结论 已成功构建了HBcAg原核表达质粒,并获得了高纯度的HBcAgVLP,为进一步研究HBcAg VLP的生物学特性奠定了基础.

微小RNA在肝细胞肝癌发生发展中的作用及其在治疗中应用的研究进展

抗体分子内的自由巯基和三硫键修饰

IgG抗体分子由两条重链和两条轻链通过链间二硫键共价交联,重链和轻链的每个结构域还各含有1对链内二硫键.含完整二硫键的天然IgG不应含有自由巯基,但抗体分子内含少量自由巯基是一种普遍现象,而且在不同IgG分子内甚至具有相似的分布形式.在人各种IgG分子内均检测到了三硫键的存在.本文对IgG分子内的自由巯基和三硫键修饰作一综述.

血浆蛋白质组学研究中样品前处理技术的研究进展

蜜蜂黑蜂王台病毒RT-PCR快速检测方法 的建立

目的 建立蜜蜂黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)的RT-PCR快速检测方法.方法 根据BQCV全基因组序列,在其3’端1000bp的区域内设计1对特异性PCR引物,从受BQCV感染的蜜蜂的蛹样品中提取总RNA,进行RT-PCR,并对该法的特异性、敏感性及重复性进行验证.结果 从BQCV全基因组序列中可扩增出700 bp的基因条带.该方法 可扩增0.1ng的BQCV DNA;仅能在BQCV中扩增出700 bp的目的基因条带,在蜜蜂急性麻痹病病毒、残翼病病毒、蜜蜂囊状幼虫病病毒中均未扩增出目的基因条带；对相同样品进行多次检测,均在700 bp处出现目的条带.结论 已成功建立BQCV RT-PCR快速检测方法,该方法 特异性强,敏感性高,重复性好,可用于黑蜂王台病的快速诊断和混合感染的鉴别诊断.

脱氧胆酸钠酸沉淀法定量测定b型流感嗜血杆菌结合疫苗中游离多糖的含量

目的 建立一种b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)结合疫苗中游离多糖含量新的检测方法.方法 分别对标准蛋白溶液、多糖溶液和标加衍生多糖(A H-PRP)的结合物原液进行脱氧胆酸钠(NaDC)酸沉淀处理,观察该方法 对蛋白和多糖的沉淀效果.分别采用NaDC酸沉淀法和乙醇分步沉淀法测定结合疫苗原液中的游离多糖含量.结果 不同浓度的标准蛋白溶液经NaDC酸沉淀法处理后,沉淀中蛋白的回收率在96％～ 99％之间；不同浓度的多糖溶液经NaDC酸沉淀法处理后,上清中的多糖回收率在99％～106％之间；该方法 对结合物中的游离多糖能起到很好的分离效果；两种方法 测定结合疫苗原液中的游离多糖含量差异有统计学意义(P＜0.01).结论 NaDC酸沉淀法能专一性地沉淀蛋白物质,对游离多糖无沉淀作用,该方法 具有良好的重复性和准确性,可用于测定Hib结合疫苗中的游离多糖含量.

高产蛹虫草菌株的选育

目的 选育高产蛹虫草菌株,提高蛹虫草菌种的菌丝体产量和活性成分含量.方法 以蛹虫草CGMCC5.699为 原始菌株,采用亚硝基胍对其进行诱变,以菌丝体生长速度和菌落大小进行初筛,以菌丝体干重和菌丝体中腺苷、多糖蛋白和甘 露醇(虫草酸)含量为指标,采用摇瓶方法 进行复筛,得到高产蛹虫草诱变株,连续传代考察其遗传稳定性.结果 共筛选出33 株菌丝体干重和腺苷、多糖、蛋白、甘露醇含量均较高的诱变菌株,其中有8株能获得稳定遗传突变特征,H4025株菌丝体干重 和腺苷、多糖、蛋白、甘露醇含量较未经诱变的原始菌株分别提高了103％、545％、43.5％、51.9％和42.7％.结论 已成功选育 出1株高产蛹虫草诱变菌株H4025.

免疫亲和层析法快速纯化猪瘟病毒抗体

目的 应用免疫亲和层析技术快速纯化猪瘟病毒抗体.方法 将猪瘟病毒接种于猪传代肾细胞PK-15中培养,收获并纯化猪瘟病毒,将其与环氧氯丙烷活化的Sepharose-4B偶联,制备免疫亲和层析柱,从猪瘟病毒高免疫猪血清中纯化猪瘟病毒抗体,分别应用SDS-PAGE和ELISA进行抗体纯度和活性检测.结果 自制免疫亲和层析柱的偶联率为0.36 mg抗原/g载体；纯化的猪瘟病毒抗体纯度高,活性强,抗体回收率占猪血清总蛋白的2.45％.结论 已建立了成本低、可快速有效纯化猪瘟病毒抗体的免疫亲和层析法.

分子尺寸排阻高效液相色谱法检测戊型肝炎类病毒颗粒

目的 采用分子尺寸排阻高效液相色谱(Size-exclusion HPLC,SE-HPLC)法检测戊型肝炎类病毒颗粒(Hepatitis E virus-like particle,HE VLP).方法 分别采用超速离心法和Sephacryl S-200HR凝胶层析法制备HE VLP,对两种方法 制备的HE VLP进行SDS-PAGE、Western blot、电镜观察、动态光散射及SE-HPLC分析,建立SE-HPLC定性、定量分析HE VLP的方法,并利用该方法 对不同时间点培养上清HE VLP进行定量分析.结果 SDS-PAGE及Western blot分析显示,两种方法 制备的HE VLP均可见相对分子质量约为50 000的目的蛋白条带,浓度和纯度基本一致,且具有相同的反应原性；电镜观察可见,超速离心法制备的HE VLP为直径约30 nm的均匀空心颗粒,层析纯化的HE VLP则为大量不规则的团块及少量空心颗粒；动态光散射分析显示,超速离心法制备的HE VLP只有1个峰,颗粒直径为27.2 nm,纯度大于98％,层析纯化的HE VLP颗粒半径2 ～120 nm不等；SE-HPLC分析显示,HE VLP含量在1～ 40 μg范围内与峰面积呈线性相关,且精密性良好；利用该法能够对病毒细胞培养液中的HE VLP进行实时定量.结论 SE-HPLC可以对HE VLP进行定性、定量分析.

艰难梭菌B毒素的纯化及其生物学特性

目的 纯化艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)B毒素,并鉴定其生物学特性.方法 将艰难梭菌V PI10463株经透析培养,50％饱和硫酸铵盐析,酸沉淀,收集上清液浓缩后,先采用分子筛Sephacryl S-300层析,收集目标蛋白峰,再进行DEAE Sepharose FF和DEAE Sephadex A-25离子交换层析,并对纯化产物进行各项生物学特性鉴定.结果 终纯化的艰难梭菌B毒素蛋白浓度为1.25 mg/ml;Vero细胞毒性为8.0×109CU/mg;经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈单一条带,相对分子质量约为220 000,纯度为99.9％；免疫双扩散试验显示单一沉淀线.结论 成功纯化了艰难梭菌B毒素,获得的B毒素纯度和细胞毒性较高,免疫反应性良好,为艰难梭菌毒素及其相关疾病的研究和防治奠定了基础.

3种方法 提取的B群脑膜炎奈瑟菌外膜囊泡组分的免疫原性、毒性及杀菌活性

目的 采用3种方法 提取B群脑膜炎奈瑟菌(Serogroup B Neisseria meningitidis,MenB)的外膜囊泡(Outer membrane vesicle,OMV),并分析其免疫原性、毒性和杀菌活性.方法 分别采用去污剂+EDTA、EDTA、从培养上清液中离心提取3种方法 获得MenB的OMV,即dOMV、nOMV和sOMV,SDS-PAGE分析OMV主要蛋白组分,Lowry法测定蛋白浓度,LAL试验测定内毒素含量.将3种OMV免疫小鼠,采用ELISA法测定小鼠血清中IgG抗体滴度,杀菌力试验测定3种OMV诱导针对MenB补体依赖的杀菌反应.结果 dOMV、nOMV和sOMV的主要蛋白成分基本一致,内毒素含量分别为5.0× 103、7.5× 104和4.0× 106EU/mg,产率分别为11.640、10.210和4.135 μg/10m个细菌；dOMV、nOMV和sOMV组小鼠血清抗体滴度分为3.98×106、2.51×107和5.62× 104,与阴性对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05),杀菌抗体滴度分别为501.70、697.11和55.39.结论 用3种不同的方法 成功制备了3种MenB的OMV,并对其免疫原性、毒性和杀菌活性进行了比较,为研发B群脑膜炎OMV疫苗提供了理论依据.

风疹病毒疫苗株RA27/3全基因组序列测定及其基因组的遗传稳定性

目的 对5个代次的风疹病毒疫苗株RA27/3进行全基因组序列测定与分析,以阐明该疫苗株在传代过程中基因组的稳定性.方法 提取疫苗株基因组RNA,反转录合成cDNA,分为10个片段进行RT-PCR,并测定全长cDNA序列.比较这5个代次毒种之间的全基因组序列的差异.结果 仅有中间代次P30和P31毒种的个别位点发生了突变,并在之后的代次中出现了恢复.P30的2429位点核苷酸的变异导致了氨基酸水平的变化,但该变化出现在基因组的非结构蛋白编码区域；而P31的3181位点核苷酸的变异未导致氨基酸水平的变化,为同义突变.结论 RA27/3疫苗株在传代过程中基因组保持了较高的稳定性,在分子水平上保证了该毒株及其生产疫苗的安全性.

乌司他丁和泰索帝对人原代乳腺癌细胞增殖、侵袭、凋亡的影响及其机制

目的 探讨乌司他丁( Ulinastatin,UTI)单独和联合泰索帝(Taxotere,TXT)对人原代乳腺癌细胞增殖、侵袭、凋亡和环氧合酶-2( Cyclooxygenase-2,COX-2)、前列腺素E-2( Prostaglandin E-2,PGE-2)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)表达的影响.方法 采用酶消化法提取人乳腺癌组织中的癌细胞,进行原代培养,将细胞随机分为4组:空白对照组、UTI组(800 IU/ml)、TXT组(3.7 μg/ml)、UTI+ TXT组,采用MTT法、Transwell小室试验和流式细胞术分别检测细胞的增殖、侵袭和凋亡；半定量RT-PCR和Western blot检测细胞COX-2、IL-10基因和蛋白水平的表达；ELISA检测细胞PGE-2的分泌.结果 与对照组相比,UTI和TXT均能抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭,并促进凋亡,UTI与TXT联合作用更显著；UTI、TXT单独和联合处理后,细胞COX-2、IL-10的表达均较对照组明显下降,并有效降低了PGE-2的分泌水平.结论 UTI和TXT均能抑制乳腺癌细胞的体外生长,UTI可增强TXT的抑制作用,其机制可能与UTI降低COX-2、PGE-2、IL-10的水平有关.

肌氨肽苷注射液病毒去除/灭活工艺的验证

目的 验证肌氨肽苷注射液生产工艺对病毒的去除/灭活能力.方法 以鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)作为指示病毒,采用超滤、高温灭菌法去除/灭活病毒,用SPF鸡胚和鸡成纤维细胞进行病毒去除/灭活效果验证,并进行质量检测.结果 超滤和高温灭菌后,指示病毒均未检出,盲传复壮无隐性感染,各样品的质量检测结果 均符合肌氨肽苷注射液国家药品标准规定.结论 在肌氨肽苷注射液生产工艺中,采用超滤和高温灭菌联合法去除/灭活病毒有效.

姜黄素对慢性脑缺血大鼠脑组织海马CA1区损伤的修复作用及其机制

目的 探讨姜黄素(Curcumin)对慢性脑缺血大鼠脑组织海马CA1区损伤的修复作用及其机制.方法 采用双侧颈总动脉永久性结扎建立慢性脑缺血大鼠模型,术后24 h,将模型大鼠随机分为单纯缺血组、姜黄素高剂量(100 mg/kg)治疗组和姜黄素低剂量( 50 mg/kg)治疗组,另设假手术对照组和正常对照组.姜黄素高、低剂量治疗组分别经腹腔注射100和50 mg/kg姜黄素,单纯缺血组、假手术组和正常对照组腹腔注射等量的DMSO,每天1次,连续14 d.给药14d后,取各组大鼠脑组织,HE染色和尼氏染色观察海马CA1区的形态学变化,免疫组化法观察海马CA1区神经胶质微丝酸性蛋白(Glial fib-rillaryacidic protein,GFAP)和巢蛋白(Nestin)的表达.结果 与假手术组相比,单纯缺血组大鼠海马CA1区锥体细胞和尼氏小体丢失,细胞核固缩,星形胶质细胞肥大并大量增生；经姜黄素治疗后,神经元损伤明显减轻,同时伴有GFAP和Nestin阳性细胞大量增加,姜黄素高剂量治疗组与单纯缺血组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 姜黄素能显著增强慢性脑缺血大鼠脑组织海马CA1区GFAP和Nestin蛋白的表达,减轻神经元损伤,对慢性脑缺血损伤有一定的治疗作用.

二甲双胍对脂肪变性成肌细胞内甘油三酯含量的影响

目的 探讨二甲双胍对棕榈酸诱导的脂肪变性成肌细胞内甘油三酯(Triglyceride,TG)含量的影响.方法 取Wistar大鼠乳鼠骨骼肌进行原代细胞培养,取第5代成肌细胞,分为5组:对照组(加入正常培养基)、模型组(PA组,加入0.25 mmol/L棕榈酸诱导24h)、干预组(Met 1、2、3组,加入0.25 mmol/L棕榈酸诱导24h后,分别加入2.5、5.0和7.5 μg/ml的二甲双胍,继续培养24h).油红O染色观察细胞内脂滴的变化,计算脂肪变性率；并检测细胞内TG的含量.结果 成功建立了成肌细胞脂肪变性模型.模型组较对照组脂变细胞数量明显增多,细胞内TG含量显著增加(P＜0.01),而经不同浓度二甲双胍作用后,各干预组脂变细胞数量减少,细胞内TG含量显著下降(P＜0.01),与二甲双胍浓度呈正相关.结论 二甲双胍可显著减少TG在成肌细胞内的沉积,促进成肌细胞的脂代谢,抑制脂肪变性的形成,具有明显的降脂作用.

特异性和非特异性猪脾转移因子的制备及其免疫活性比较

目的 制备特异性和非特异性猪脾转移因子(Transfer factor,TF),并比较二者的理化特性及免疫活性.方法 采集免疫猪和非免疫猪脾脏,采用冻融-透析法提取猪脾特异性和非特异性转移因子,检测二者的理化性质；E-玫瑰花环试验检测二者的活性；利用环磷酰胺复制小鼠免疫抑制模型,MTT法检测二者对小鼠淋巴细胞转化的影响.结果 特异性及非特异性猪脾转移因子蛋白含量分别为0.392和0.026 mg/ml,核酸含量分别为1.1306和0.987 7 μg/μ1,无菌试验、热原试验和安全试验均未出现异常,符合相关规定要求.特异性和非特异性猪脾转移因子均可增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,增加E-玫瑰花环的形成率.特异性猪脾转移因子对免疫抑制小鼠、生理盐水组小鼠及正常小鼠外周血淋巴细胞转化均有明显的免疫增强作用,与对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01),且特异性猪脾转移因子的免疫增强作用显著高于PHA组(P＜0.01)；而非特异性猪脾转移因子对免疫抑制小鼠、生理盐水组小鼠及正常小鼠外周血淋巴细胞转化均无明显的免疫增强作用(P＞0.05),且明显低于PHA对照组(P＜0.05).结论 特异性猪脾转移因子比非特异性猪脾转移因子具有更明显的免疫增强作用.

卡舒宁联合流感疫苗对老年性慢性支气管炎合并急性感染的防治效果

目的 观察卡舒宁联合流感疫苗对老年性慢性支气管炎合并急性感染的防治效果.方法 选择多年反复感染、咳嗽、咳痰、不同程度哮喘的老年慢性支气管炎患者138人,随机分为观察组73人,对照组65人.观察组接种流感疫苗后2周注射卡舒宁,每周2次,疗程3个月；对照组仅注射卡舒宁,方法 同观察组.1年后,对两组病例统一进行电话或人户随访,内容包括慢性支气管炎急性感染次数、急性感染时住院次数及急性感染时抗生素治疗疗程.结果 观察组患者慢性支气管炎急性感染次数和住院总次数明显减少,抗生素治疗疗程明显缩短,与对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 卡舒宁联合流感疫苗可明显提高老年性慢性支气管炎合并急性感染的防治效果.

第1代国家人源抗百日咳血清参考品的制备

目的 制备第1代国家人源抗百日咳血清参考品.方法 制备1批冻干候选人源抗百日咳血清参考品,以WHO第1代人源抗百日咳血清标准品(06/140)为标准,组织各单位进行协作标定,并对候选参考品进行稳定性分析.结果 各协作实验室检测结果 的室内和室间变异系数(CV)均低于15％；经统计学分析,终确定候选参考品中含抗PT抗体94 IU/ml,抗FHA抗体52 IU/ml,抗Prn抗体106 IU/ml;候选参考品于-20℃放置15个月及37℃放置7、14、21和28 d后,各种百日咳抗体的酶标单位数均未出现显著下降.结论 该候选参考品符合国家参考品的各项要求,可用于百日咳疫苗临床评价和临床实验室血清学诊断.

肺炎支原体重组P1蛋白多克隆抗体的制备及纯化

目的 制备肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)重组P1蛋白多克隆抗体,为Mp抗原诊断试剂的制备奠定基础.方法 用Mp重组P1蛋白免疫家兔,ELISA法测定免疫血清抗体效价；硫酸铵沉淀及离子交换层析法纯化抗体；紫外分光光度法测定抗体的浓度；SDS-PAGE分析抗体的纯度；量子点标记纯化抗体,分析抗体的免疫活性；直接免疫荧光法检测抗体的特异性.结果 重组P1蛋白兔免疫血清抗体效价为1:25 600;纯化的抗体浓度为3.689 μg/μl; SDS-PAGE显示相对分子质量58 000的重链条带；用量子点标记纯化的抗体仍保持较高的免疫活性,与其他呼吸道常见病原菌均未发生特异性结合.结论 获得的纯化Mp P1蛋白IgG抗体具有较高的免疫活性和特异性,可用于临床Mp感染的抗原诊断.