中国生物制品学杂志
Chinese Journal of Biologicals 중국생물제품학잡지
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
- 影响因子： 0.41
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1004-5503
- 国内刊号： 22-1197/Q
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
-
人白细胞介素-29的生物信息学分析
目的 利用生物信息学技术对人白细胞介素-29(Human nterleukin-29,IL-29)进行分析,为定点突变hIL-29,以提高其生物学活性奠定理论基础.方法 利用生物信息学技术分析克隆得到的hIL-29基因,预测hIL-29基因编码蛋白的理化性质、结构、功能及可能影响其生物学活性的关键氨基酸位点；预测其三维结构,并与IFNλ3的晶体结构进行比对；对检索到的9个物种的IL-29基因同源序列进行比对,并构建系统进化树.结果 hIL-29基因编码蛋白含200个氨基酸残基,其N-末端19个氨基酸为信号肽,成熟肽的相对分子质量为20 018,理论等电点为9.08,肽链中含一个由胞内向胞外的跨膜结构域；hIL-29的空间构象由6个α螺旋(A～F)和无规则卷曲组成,螺旋A、B和F可能是hIL-29与特异性受体结合而发挥生物学效应的活性部位,A、F螺旋中有4个氨基酸残基可能是影响其生物学活性的关键氨基酸位点；系统进化分析显示,hIL-29与狗、猫、大熊猫、马、野猪、黑猩猩、长臂猿的IL-29具有较高的同源性,处于同一个大分枝,而人、黑猩猩、长臂猿的IL-29处于同一个小分枝,在系统进化树中的距离近.结论 关键位点氨基酸的差异可能对hIL-29的生物学活性影响较大,可作为对hIL-29进行分子改造的突变位点.本研究为后续进行hIL-29的定向改构及其构效关系等的深入研究奠定了理论基础.
-
小鼠Hes1基因过表达逆转录病毒载体的构建及其在小鼠Lin-造血细胞中的表达
目的 构建过表达Hes1基因的逆转录病毒载体,并通过感染相对原始的小鼠Lin-造血细胞检测其感染效率.方法 通过RT-PCR法从B6小鼠骨髓细胞中扩增Hes1基因功能区,将扩增产物连接入逆转录病毒载体MSCV-ICN1-IRES-GFP,构建重组逆转录病毒载体MSCV-Hes1-IRES-GFP,瞬时转染293T细胞,设转染空载体的细胞为对照组,流式细胞仪检测转染效率,Realtime PCR检测Hes1基因的表达；将重组逆转录病毒载体MSCV-Hes1-IRES-GFP及空载体与Lipofectamine 2000混合后,转染293T细胞,包装重组逆转录病毒,稳定感染小鼠Lin-细胞,设感染空载体病毒的细胞为对照组,流式细胞仪检测感染效率,Realtime PCR检测Hes1基因的表达.结果 测序证实重组逆转录病毒载体构建正确；转染293T细胞后第3天,重组逆转录病毒的转染效率约为95％,Hes1基因表达量约为对照组的5倍；病毒上清感染Lin-细胞后第4、5天,重组逆转录病毒的感染效率约为7％,Hes1基因的表达量约为对照组的6倍.结论 已成功构建了过表达Hes1基因的重组逆转录病毒载体,并在小鼠Lin-细胞中稳定表达,为研究白血病环境下Hes1对造血干祖细胞的作用奠定了基础.
-
氧化型低密度脂蛋白的内皮损伤作用及其对人脐静脉内皮细胞中OX40L表达的影响
目的 观察氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)的内皮损伤作用及其对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)中OX40L表达的影响.方法 采用CCK-8法检测不同浓度ox-LDL(50、100和150 mg/L)对HUVEC增殖活力的影响；流式细胞术检测100 mg/L ox-LDL处理的HUVEC细胞周期及凋亡率的变化；Western blot法检测不同浓度ox-LDL(50、100和150 mg/L)处理的HUVEC中OX40L蛋白的表达水平；免疫荧光及激光共聚焦检测100 mg/L ox-LDL处理的HUVEC中OX40L蛋白的定位,均设加入等量培养基的HUVEC作为对照组.结果 与对照组相比,随着ox-LDL浓度的升高,HUVEC的增殖活力明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.01)；ox-LDL 100 mg/L组细胞被阻滞在S期,凋亡率明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05)；与对照组相比,随着ox-LDL浓度的升高,HUVEC中OX40L的表达量逐渐升高,差异均有统计学意义(P＜0.05);ox-LDL100mg/L组HUVEC表达OX40L的荧光明显增强,差异有统计学意义(P＜0.01),且OX40L蛋白定位于细胞膜及细胞质上.结论 ox-LDL对HUVEC具有明显的损伤作用,可促进HUVEC中OX40L的表达,影响OX40/OX40L炎症信号通路.
-
Hedgehog信号通路对人胃癌SGC-7901细胞体外血管形成的调控
目的 探讨Hedgehog信号通路调控人胃癌SGC-7901细胞体外血管形成的可能分子机制.方法 常规培养SGC-7901细胞和人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),将SGC-7901细胞分为对照组A(未给药)、实验组B(环靶明终浓度5 μmol/L)及实验组C(环靶明终浓度10 μmol/L),培养48 h后,免疫荧光检测各组胶质瘤相关癌基因1 (Glioma-associated oncogene homolog,Gli)和血小板源性生长因子-D(Platelet-derived growth factor D,PDGF-D)在胃癌SGC-7901细胞中的表达；通过小管形成试验和血管拟态试验检测细胞处理前后血管形成能力的变化；RT-PCR和Western blot检测细胞处理前后Gli1、PDGF-D的mRNA和蛋白表达变化,并对二者mRNA和蛋白表达水平进行相关性分析.结果 Gli1和PDGF-D在各组SGC-7901细胞中均有表达；实验组SGC-7901细胞的体外血管形成能力较对照组下降,且呈剂量依赖性,差异具有统计学意义(P＜0.05)；实验组Gli1和PDGF-D的mRNA和蛋白表达较对照组均受到显著抑制,差异有统计学意义(P＜0.05),且二者mRNA和蛋白表达水平呈正相关(r-0.829,r=0.786,P＜O.05).结论 Hedgehog信号通路可能通过Gli1来调控PDGF-D的表达,进而促进肿瘤血管的形成.
-
羊布氏菌vjbR基因的克隆及原核表达
目的 克隆并原核表达羊布氏菌强毒株16M vjbR基因.方法 PCR扩增羊布氏杆菌16M株vjbR基因,亚克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒pET-28a-vjbR,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经His Trap FF纯化后,进行Western blot分析.结果 扩增的vjbR基因大小为708 bp,与预期一致；重组原核表达质粒pET-28a-vjbR经双酶切及测序证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为29 000,诱导4h表达量可达6.84 mg/ml;纯化的重组蛋白纯度为65.7％,能被羊布氏杆菌阳性血清所识别.结论 成功在大肠杆菌中表达了羊布氏菌VJBR蛋白,为其功能的研究、羊布病诊断试剂盒的研制及亚单位疫苗的研发奠定了基础.
-
宇佐美曲霉羧肽酶成熟肽基因的表达及鉴定
目的 克隆、表达宇佐美曲霉(A spergillus usami)羧肽酶成熟肽基因,并检测其酶学性质.方法 根据前期克隆的宇佐美曲霉羧肽酶基因序列设计引物,克隆羧肽酶成熟肽基因AucpA,构建重组表达质粒pPIC9k-A ucpA,电击转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导重组蛋白表达.表达的重组蛋白经Sephadex-50层析纯化后,进行酶活性及其影响因素的检测.结果 重组表达质粒pPIC9K-A ucpA经双酶切及测序证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约81 000,纯化的重组羧肽酶高比酶活为57.15 nkat/mg,适反应温度为45℃,适反应pH为3.5,金属离子、EDTA对重组羧肽酶的酶活性无影响,而PMSF对重组羧肽酶酶活性的抑制率达50％以上.结论 已成功在毕赤酵母中表达了具有较高酶活的宇佐美曲霉羧肽酶,为进一步研究该重组酶的应用奠定了基础.
-
肠道病毒71型中和抗体的保护水平
目的 通过检测乳鼠模型、健康婴幼儿和疫苗免疫后目标人群的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)中和抗体效价,为确定EV71疫苗保护水平提供基础数据.方法 6份不同EV71病毒株免疫血清经中和抗体准确定量后,分别通过两个EV71乳鼠攻毒模型,检测EV71中和抗体保护水平.采用标准化的中和抗体检测法和EV71中和抗体定值标准品,分别对健康婴幼儿及疫苗免疫后血清进行中和抗体准确定量.结果 在2个乳鼠攻毒模型中,6份免疫血清的中和抗体保护水平接近,ED50分别为10 ～ 50 U和6.1～54.2U；婴幼儿人群7、12和24月龄抗体阳性率分别为45.0％、48.8％和56.8％,阳性人群的抗体效价分别为113.8、120.3和330.6 U/ml(均值为173.2U/ml),母亲抗体阳性率和效价分别为86.7％和114.3 U/ml；中、高剂量疫苗2针免疫后,婴幼儿抗体阳性率均为100％,效价为356.0和1 136.2 U/ml,较婴幼儿人群自然感染水平高2.1～6.6倍.结论 应用标准化的中和抗体检测法和EV71中和抗体定值标准品,确定了以U/ml为单位的乳鼠攻毒抗体保护水平及婴幼儿人群抗体水平和疫苗免疫后抗体水平,为EV71疫苗免疫人群中和抗体保护水平的确定提供了依据.
-
糖皮质激素或抗菌药物联合治疗脓毒症大鼠的疗效与血清喹啉酸水平的相关性
目的 探讨糖皮质激素(地塞米松)或抗菌药物联合治疗(阿莫西林+庆大霉素+甲硝唑)脓毒症大鼠的疗效与血清喹啉酸(Quinolinic acid,QUIN)水平的相关性.方法 采用盲肠结扎穿孔法复制大鼠脓毒症模型,分别给予地塞米松和抗菌药物(阿莫西林+庆大霉素+甲硝唑)联合治疗,并设假手术组.分别于术后4、12、36、72和144 h记录大鼠死亡情况,并计算存活率；进行白细胞及分类计数；采用气质联用法检测血清QUIN水平.结果 模型组大鼠术后4h开始血中白细胞总数及中性粒细胞比例明显升高,12h达峰值并出现动物死亡；血清中QUIN水平术后12h开始明显升高,72 h达峰值并持续保持高水平.抗菌药物联合治疗可显著降低大鼠的死亡率、血中白细胞总数及中性粒细胞比例,显著抑制血清中QUIN水平的升高.地塞米松单用无明显降低脓毒症大鼠死亡率的作用,但可显著降低血中白细胞总数和QUIN水平,而升高中性粒细胞比例.结论 血清QUIN水平与脓毒症的炎症进程密切相关,其变化可能是预测脓毒症转归的有效指标之一.
-
高表达转录因子ZNF191基因的慢病毒颗粒的构建及鉴定
目的 构建转录因子ZNF191基因的慢病毒颗粒,为进一步研究ZNF191的生物学功能及其在肿瘤基因治疗方面的应用奠定基础.方法 从HEK293细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增ZNF191基因,亚克隆至pLVX-AcGFP-N1质粒中,经酶切及DNA测序鉴定正确后,将含有ZNF191基因的重组质粒pLVX-ZNF191结合辅助质粒转染HEK293T细胞,包装重组慢病毒,Western blot检测感染的293T细胞内ZNF191蛋白的表达.结果 酶切及测序鉴定pLVX-ZNF191质粒构建正确,Westem blot检测重组慢病毒能显著提高293T细胞的ZNF191蛋白表达水平.结论 已成功构建了ZNF191基因重组慢病毒表达载体pLVX-ZNF191,为进一步研究ZNF191的生物学功能及肿瘤的基因治疗奠定了基础.
-
猪附红细胞体ORF2蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位的预测
目的 预测猪附红细胞体[亦称猪嗜血支原体(Mycoplasma suis,M.suis)]ORF2基因编码蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位.方法 应用生物信息学软件DNAstar的Editseq将M.suis中ORF2的基因核苷酸序列翻译成氨基酸序列,与GenBank中登录的氨基酸序列进行比对,通过Protean模块预测ORF2蛋白的二级结构及其亲水性区域、柔韧性区域、抗原指数、表面可及性等特性,并预测B细胞优势抗原表位.结果 ORF2蛋白具有规则的二级结构,多处于亲水性区域、柔韧性区域、表面可及性较大和抗原指数较高的区段,潜在的优势B细胞抗原表位为17～23、121 ～ 127、138 ～ 144、192 ～ 200氨基酸区段.结论 预测了ORF2蛋白二级结构和B细胞抗原表位,为M.suis 表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研发奠定了理论基础.
-
肺炎链球菌dnaJ基因缺陷对小鼠肺炎感染模型天然免疫应答的影响
目的 探讨肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.Pn)dnaJ基因缺陷对肺炎感染模型小鼠天然免疫应答的影响.方法 将BALB/c小鼠随机分为空白对照组、D39感染组和△dnaJ感染组,分别经鼻腔滴注30μl无菌PBS、30 μl含2×107 cfu的S.pn D39和△dnaJ(dnaJ基因缺陷株)菌液,复制小鼠肺炎感染模型.于感染后6、12、24、36和48 h处死小鼠,取肺组织,匀浆后分离上清,ELISA检测促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFNγ的表达水平,HE染色观察感染12 h的小鼠肺组织炎症反应变化；将小鼠巨噬细胞株RAW264.7体外感染S.pn D39和△dnaJ,细菌与细胞的比例为100∶1,感染1、2、3h后分离细胞培养上清液,ELISA检测TNF-α和IL-6的表达水平.实时定量PCR和 Western blot分别检测感染12 h的小鼠肺组织中模式识别受体TLRs基因mRNA的转录水平和炎症相关信号p38MAPK的磷酸化水平.结果 与D39感染组相比,△dnaJ感染组小鼠肺组织炎症反应强度下降,TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎因子水平达峰时间延迟,且峰值降低,RAW264.7细胞感染3h分泌TNF-α和IL-6显著减少(P＜0.01或P＜0.05)；小鼠肺组织Tlr2和Tlrl3基因mRNA转录水平显著降低(P＜0.05),p38MAPK的磷酸化水平也明显下降.结论 肺炎链球菌dnaJ基因缺陷可下调肺炎感染模型小鼠的炎症反应、促炎因子分泌及胞内信号分子的激活,也可影响小鼠感染后肺组织中Trl2和Tlrl3基因mRNA的表达,为进一步研究机体对肺炎链球菌DnaJ蛋白的天然免疫应答分子机制奠定了基础.
-
瓣状内切核酸酶1基因重组真核表达质粒的构建及鉴定
目的 构建瓣状内切核酸酶1 (Flap endonuclease 1,FEN1)基因重组真核表达质粒,并进行鉴定.方法 提取L02细胞总RNA,逆转录合成cDNA,经巢式PCR扩增FEN1基因,定向克隆至载体pcDNA3.1,构建重组真核表达质粒,经酶切及测序进行鉴定.将鉴定正确的真核表达质粒转染293T细胞,Western blot检测FEN1蛋白的表达.结果 FEN1基因重组真核表达质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确；在相对分子质量约47 000处可见目的蛋白条带,转染细胞中FEN1蛋白表达量较空载体转染组及空白细胞对照组提高约3倍.结论 已成功构建了FEN1基因重组真核表达质粒,并可在293T细胞中过表达FEN1.
-
日本血吸虫亮氨酸氨基肽酶的原核表达及纯化
目的 原核表达并纯化日本血吸虫亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase of Schistosomajaponicum,SjLAP).方法 从日本血吸虫成虫中RT-PCR扩增LAP基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,转化感受态E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达,表达的重组曲LAP蛋白(rSjLAP)经SDS-PAGE和Western blot分析后,经His Binding Purification Kit 层析纯化,纯化的rSjLAP蛋白经SDS-PAGE分析纯度,Bradford法测定浓度.结果 克隆的SjLAP基因与GenBank中登录的基因序列比较有2个碱基发生置换,导致对应的2个氨基酸发生置换,但均不在关键区域；重组表达质粒pET-28a/SjLAP经双酶切鉴定证实构建正确；表达的rSjLAP蛋白相对分子质量约45 000,诱导4h表达量高；纯化的rSjLXP蛋白纯度较高,浓度达5.0 mg/ml,并可被抗小鼠His-tag单抗及血吸虫感染的患者血清和兔血清特异性识别,具有良好的反应原性.结论 成功在大肠杆菌中表达了rSjLAP蛋白,纯化的rSjLAP纯度较高,为血吸虫病的诊断和预防等研究奠定了基础.
-
粪肠球菌HX-3-6产γ-氨基丁酸发酵条件的优化
目的 优化粪肠球菌HX-3-6产γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)的发酵条件,提高GABA的产量.方法 通过单因素试验和正交试验对产GABA的粪肠球菌HX-3-6发酵条件进行优化,采用Plackett-Burman(PB)试验设计法筛选产GABA的培养基主要影响因素,应用Box-Behnken设计及响应面分析对影响发酵产GABA的主要培养基因素进行优化；用终优化的配方进行3次验证试验.结果 佳发酵条件为底物浓度30 g/L,起始pH5.5,发酵时间72 h,温度35℃；PB法筛选出了培养基中有显著效应的4个因素为MnSO4.H2O、NaCl、柠檬酸三胺和葡萄糖,经Box-Behnken设计及响应面分析,确定该4个主要影响因素的佳浓度分别为0.100 785、0.224 459、0.215 355及12.335 95 g/L.3次验证GABA的产量平均可达16.027 g/L,比优化前(11.006 g/L)提高了45.62％.结论 优化的粪肠球菌HX-3-6发酵条件和培养基可显著提高GABA产量,为其工业化生产奠定了基础.
-
小鼠血清乙型肝炎病毒前S2抗体间接ELISA检测方法的建立
目的 建立小鼠血清乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)前S2抗体间接ELISA检测方法.方法 以HBV前S2(1～26)多肽包被酶标板,利用方阵滴定法确定间接ELISA法的适工作条件,验证该方法的精密度、灵敏度和特异性,并与商品化试剂盒进行比较.结果 确定佳抗原包被浓度为2 μg/ml;血清稀释度为1∶10,37℃反应30 min;HRP标记的羊抗小鼠IgG佳稀释度为1∶10000,37 ℃反应30 min;TMB底物37℃显色15 min,以2.1×阴性对照血清A450均值(阴性对照血清小于0.05时按0.05计算)为Cut-ff值.该方法具有良好的试验内和试验间精密度；与商品化试剂盒比较,灵敏度为100％,特异性为97.3％,二者符合率为98.5％.结论 已成功建立HBV前S2抗体间接ELISA方法,可用于小鼠血清中前S2抗体的检测.
-
猪呼吸道疾病综合征4种病原菌复合PCR方法的建立及其初步应用
目的 建立检测猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)中肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)、猪链球菌(Streptococcus suis,SS)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus Paraasuis,HPS)和猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)的四重PCR方法.方法 根据GenBank中登录的Mhp的P36基因序列设计引物,同时参考文献分别合成SS、HPS和Pm的特异性引物,通过4因素(Taq酶、Mg2+、引物、dNTPs)4水平的L16(4a)正交试验优化PCR反应体系,建立检测Mhp、SS、HPS和Pm的四重PCR方法,并进行特异性、敏感性及重复性验证.运用该方法及单一PCR方法,对PRDC猪的鼻腔拭子及肺脏组织样品进行检测,另对肺脏组织样品进行SS、HPS和Pm的常规分离鉴定.结果 确立了四重PCR方法适反应体系及反应条件；应用建立的四重PCR方法在568、294、821和457 bp处均可见与预期相符的特异性条带,8次重复扩增后的电泳结果一致,低检测限量分别为560、260、280和200 pg,表明该方法特异性、敏感性及重复性较好；PRDC猪的鼻腔拭子及肺脏组织样品的四重PCR方法检测结果与单一PCR方法相比,差异无统计学意义(P＞0.05),四重PCR及单一PCR方法的HPS的检出率则显著高于常规细菌分离鉴定(P＜0.05).结论 所建立的四重PCR方法,可直接用于临床PRDC 4种病原菌的鉴定,为开展PRDC流行病学调查提供了有效的技术手段.
-
新城疫病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及初步应用
目的 建立新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)一步法RT-PCR检测方法,并进行验证及初步应用.方法 根据NDV F基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立一步法RT-PCR检测方法,并验证其特异性及敏感性；应用建立的方法对23份疑似新城疫(Newcastle disease,ND)病料进行检测,并与血凝及血凝抑制试验检测结果进行比对.结果 建立的一步法RT-PCR同时检测NDV、传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)和禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV) H9亚型,仅NDV为阳性,IBDV和AIV H9均为阴性；该方法低可检出约4 pg的NDV RNA; 23份疑似ND病料,一步法RT-PCR检出11份阳性,血凝及血凝抑制试验检出13份阳性,两种方法的阳性符合率为85％.结论 建立了NDV一步法RT-PCR检测方法,该方法特异性良好,敏感度较高,用时较短,可从分子水平上对NDV进行早期快速诊断和流行病学调查.
-
生物反应器培养Vero细胞生产肠道病毒71型
目的 研究利用微载体技术规模化制备肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的方法.方法 利用NBSCelliGen 310 5 L生物反应器进行Vero细胞微载体培养,考察了不同微载体Cytodex-1浓度(3、10、15、20 g/L)对Vero细胞生长代谢及细胞密度的影响,并且与细胞工厂(Cell factory,CF)中Vero细胞染毒后的病毒繁殖进行比较.分别采用上清液、洗涤液、洗脱液模式收毒,比较不同收毒方式中EV71的抗原含量及病毒滴度(CCID50).结果 采用10 g/L微载体浓度,批次培养方式培养Vero细胞120 h后,细胞密度可达5.47×106个/ml;当微载体浓度大于15 g/L时,由于葡萄糖消耗速度快,需采用灌注模式培养.按MOI 0.2染毒后,微载体培养的收毒时间比CF慢48 h,但其病毒滴度可达8.8 Log10CCID50/ml,约为CF的5倍.EV71与微载体存在离子交换吸附作用,按上清液加洗脱液方式收毒,抗原总量可达12 61 U/ml,约为CF的3倍.结论 已成功建立了生物反应器微载体5L发酵培养Vero细胞生产EV71的方法,为进一步EV71大规模培养以及疫苗研发奠定了基础.
-
鸡BF1和BF2基因实时荧光定量PCR检测方法的建立
目的 建立鸡主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)BF1和BF2基因实时荧光定量PCR[Real-time fluorescent quantitative(FQ)-PCR]检测方法.方法 从鸡外周血淋巴白细胞(Peripheral blood leukocytes,PBLs)中提取细胞总RNA,以其为模板,根据BF1、BF2和GAPDH基因相对保守序列各设计一对引物,应用RT-PCR法扩增目的基因,分别克隆至pGM-T载体上,制备重组质粒标准品,经PCR、EcoR Ⅰ酶切及测序鉴定；优化反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立Real-time FQ-PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性.结果 重组质粒标准品经PCR、酶切及测序鉴定构建正确；建立的定量标准曲线临界循环数(Threshold cycle,Ct)与BF1、BF2和GAPDH起始质粒DNA拷贝数的对数之间线性关系良好,相关系数分别为1.00、0.98、0.99,扩增效率分别为0.8、1.1、1.1；该方法的敏感性可达101 copies/μl；融解曲线分析表明扩增效率一致,特异性较好；质粒DNA标准品3次检测的CV值误差不超过0.5,均小于5％.结论 已成功建立了鸡BF1和BF2基因实时荧光定量PCR检测方法,为下一步应用该法检测BF1和BF2基因的转录水平奠定了基础.
关键词： 主要组织相容性复合体 实时荧光定量PCR -
干扰素聚乙二醇修饰的研究进展
干扰素(Interferon,IFN)是一类具有抗病毒、免疫调节、抑制细胞增殖等多种生物活性的细胞因子,而体内循环半衰期短限制了其在临床上的应用.聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)修饰可以有效地改善干扰素的理化性质和生物学特性,延长体内循环半衰期.本文综述了聚乙二醇修饰干扰素的研究进展,着重介绍了聚乙二醇修饰化学的发展,α、β、γ干扰素各自不同的聚乙二醇化学修饰方法,并对聚乙二醇化干扰素的发展趋势进行了展望.
-
重组抗体高效表达的研究进展(Ⅱ)
2 抗体基因序列的优化越来越多的研究表明,抗体基因序列中存在的剪接信号、二级结构、GC含量以及密码子偏爱等影响抗体的表达水平.信号肽会影响抗体折叠、组装和修饰的效率,进而影响其分泌水平.2.1 密码子优化 提高目的蛋白表达的另一种策略是将目的基因的密码子更换成宿主细胞的偏爱密码子.Ward等[44]对FⅧ基因序列的密码子进行优化后,表达水平提高了29 ～ 44倍,该策略也能应用于提高抗体表达水平.
关键词： -
人呼吸道合胞病毒蛋白F1片段在大肠杆菌中的表达及纯化
目的 在大肠杆菌中表达人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白主要抗原表位集中的137 ～ 523 aa片段,并对其进行纯化,检测其免疫原性.方法 采用RT-PCR扩增RSV F1基因片段,与pThioHisA载体连接,构建重组表达质粒pThioHisA-RSV F1,转化大肠杆菌Topl0,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析；表达的融合蛋白经稀释复性、离子交换及亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析；将纯化的融合蛋白RSVF1经皮下多点注射分别免疫ICR小鼠,实验分为3组:RSV F1无佐剂组(RSV F1,50μg/只)、RSV F1佐剂组(50 μg RSV F1+5μg nOMV佐剂)和阴性对照组(PBS,100μl/只),于第3周加强免疫1次,第4周尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法检测其免疫原性.结果 经双酶切鉴定及DNA测序证明重组表达质粒pThioHisA-RSV F1构建正确；表达的融合蛋白相对分子质量约56 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占细胞总蛋白的36％；纯化的融合蛋白纯度可达95％,并可与RSV-F1多克隆抗体发生特异性抗原抗体反应；与阴性对照组相比,RSV F1免疫的小鼠血清特异性IgG水平明显提高(P＜ 0.05).结论 已成功地在大肠杆菌中高效表达了RSV FI片段,纯化的融合蛋白在小鼠体内具有良好的免疫原性,为进一步研究RSV F蛋白亚单位疫苗奠定了基础.
-
H5N1亚型禽流感病毒样颗粒的构建及鉴定
目的 构建同时含有禽流感H5N1疫苗株NIBRG-14的血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)及基质蛋白(Matrix protein,M1)3种基因的重组杆状病毒,并研究其表达产物的生物学特性.方法 利用RT-PCR法从禽流感H5N1疫苗株NIBRG-14中扩增HA、NA及M1基因片段,并同时亚克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBacDual中,构建重组杆状病毒穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒Bacmid-HA-NA-M1a.Western blot法和血凝试验检测HA、NA及M1蛋白在Sf9细胞中的表达；表达的重组蛋白经超速离心浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化后,透射电镜观察病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)的形态结构,并通过单向免疫扩散(Single radial immunodiffusion,SRID)试验检测HA的含量.结果 已成功构建了重组杆状病毒,该病毒可同时表达HA、NA及M1蛋白,3种蛋白可自行组装成VLPs,并分泌至细胞培养上清中,血凝效价可达1∶64;重组杆状病毒表达的蛋白形成的VLPs与NIBRG-14标准抗血清形成沉淀环,浓缩及纯化后的重组蛋白HA含量分别为36和27 μg/ml;透射电镜观察可见直径约100 nm的典型流感VLPs.结论 构建的重组杆状病毒可表达VLPs,为禽流感新型疫苗的研制奠定了基础.
-
呼吸道合胞病毒截短G蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性
目的 构建呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)截短G蛋白的原核表达载体,并对表达、纯化后的蛋白进行免疫原性及相关免疫指标的检测.方法 人工合成G蛋白基因的部分核酸序列,采用重叠PCR法将CX3C模序替换为RSV M蛋白上的CTL表位,构建原核表达载体GCX3C-pET22b和GCTL-pET22b,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE鉴定后,采用Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白.纯化产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,免疫昆明小鼠,实验分GCC组(100μg GCX3C)、GCTL组(100μg GCTL)、阴性对照组(100μl PBS),分别于0、1、4周经小鼠双后侧肌肉注射免疫,经尾梢静脉取血,分离血清,检测IgG水平及嗜酸性粒细胞的数量,并通过小鼠体外淋巴细胞杀伤试验鉴定RSV特异性CTL应答.结果 重组原核表达载体经双酶切及测序鉴定,证明G蛋白基因改造成功；重组蛋白的相对分子质量约14 000,表达量约占菌体总蛋白的40％,主要以可溶性形式表达；纯化的重组蛋白纯度达90％以上,可与抗RSV血清发生特异性反应；小鼠血清中的特异性IgG水平随免疫次数的增加而升高(P＜0.01),GCX3C蛋白和GCTL蛋白的几何平均滴度分别为1 584.89和1 995.26; GCX3C组较GCTL组小鼠血清中嗜酸性粒细胞数量明显增加(P＜0.01)；GCTL蛋白免疫小鼠后可产生RSV特异性的CTL应答效应.结论 已成功原核表达了GCX3C蛋白和GCTL蛋白,两种蛋白均有较好的免疫原性,GCTL蛋白可消除由CX3C模序引起的嗜酸性粒细胞增多,并增强了CTL效应,G蛋白基因的改造达到了预期效果.
-
内含肽介导的重组人干扰素α2a的原核表达及其生物学活性
目的 原核表达内含肽介导的重组人干扰素α2a(rhIFNα2a)融合蛋白,并检测其生物学活性.方法 以质粒pBV220-IFN-α2a为模板PCR扩增rhIFNα2a基因,将其插入原核表达载体pTWIN1的内含肽Ssp DnaB基因下游的多克隆位点,构建重组表达质粒pTWIN1-rhIFNα2a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行SDSPAGE及Western blot分析,并对裂菌上清的生物学活性进行测定.结果 双酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入表达载体中；rhIFNα2a蛋白的相对分子质量约44 300,表达量占全菌总蛋白的30％,在裂菌上清中的表达量占目的蛋白的25％,可与小鼠抗hIFNα单克隆抗体特异性结合；裂菌上清中rhIFNα2a蛋白的活性为5.57×107 IU/ml,表明该重组蛋白具有良好的IFN抗病毒活性.结论 已成功在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达了具有生物学活性的可溶性重组rhIFNd2a与内含肽Ssp DnaB融合蛋白,为大量生产IFNα2a提供了新的思路.
-
肝癌组织中Wnt通路上下游因子的表达及其临床意义
目的 探讨Wnt通路Wif-1、C-myc、Cycling-D1mRNA及蛋白在正常肝组织、肝硬化及肝癌组织中的表达及其与肝癌临床病理参数的相关性.方法 运用免疫组织化学SP法与原位杂交技术检测100份肝癌组织、50份肝硬化组织、50例正常肝组织中Wif-1、C-myc、Cycling-D1蛋白及mRNA的表达,并测定肝癌组织中的Wif-1、C-myc和Cycling-D1的阳性率、敏感性及特异性.结果 肝硬化与肝癌组织中Wif-1 mRNA及蛋白的阳性细胞表达率明显低于正常肝组织(P＜0.05),C-myc和Cycling-D1mRNA及蛋白的阳性细胞表达率明显高于正常肝组织(P＜0.05).肝癌组织中Wif-l、C-myc和Cycling-D1 mRNA及蛋白的阳性表达均与HBV分级、TNM分期及β-catenin异质表达显著相关(P＜0.05).Wif-1、C-myc和Cycling-D1mRNA及蛋白在肝癌组织中的表达呈正相关(rWff-1=0.892,rCmyc=0.354,rcyding-D1=0.378).肝癌组织中mRNA及蛋白的敏感性:Wif-1:9.09％、11.11％,C-myc:91.38％、89.66％,Cycling-D1:91.67％、82.5％,特异性:Wif-1:97.75％、95.6％,C-myc:82.5％、85.71％,Cycling-D1:92.86％、81.82％.结论 肝癌的侵润和β-catenin的异质表达均与Wif-1下降,C-myc及Cycling-D1上调相关.
-
抗博尔纳病病毒磷蛋白多克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备抗博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)重组磷蛋白(p24)多克隆抗体,并对其进行鉴定,为BDV血清免疫学检测方法的建立奠定基础.方法 用本课题组前期制备的重组BDVp24蛋白经背腿部多点皮下注射免疫新西兰大白兔,共免疫4次,末次免疫后第7天采血,分离血清,采用抗原亲和纯化法纯化抗血清,ELISA法测定抗血清效价；Western blot和免疫荧光鉴定其特异性.结果 制备的抗BDV p24多克隆抗体的纯度为98％,ELISA效价达1∶128000,该抗体与重组p24蛋白和BDV感染OL细胞表达的p24蛋白均能发生特异性反应.结论 成功制备了灵敏性和特异性良好的抗BDV p24多克隆抗体,为研发相关的诊断试剂和研究该病毒的感染发病机制奠定了基础.
| 年 | 期数 |
| 2019 | 01 02 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 |
| 2000 | 01 02 03 04 |
