中国生物制品学杂志
Chinese Journal of Biologicals 중국생물제품학잡지
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
- 影响因子： 0.41
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1004-5503
- 国内刊号： 22-1197/Q
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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重组CHO细胞无血清培养基的研制
目的 研制适合于重组CHO细胞生长的低成本无血清培养基.方法 以无血清培养基SFM为基础,分别向其中加入不同的组分,包括水解物(0.8％大豆蛋白水解物、0.8％超滤植物蛋白栋、0.8％酵母提取物、0.8％谷类水解物、0.4％大豆蛋白水解物+0.4％酵母提取物)、激素(10 μmol/L的地塞米松、氢化可的松)、脂类物质(0.05％脂肪乳剂、50 mg/L氯化胆碱、10 mmol/L磷脂酰胆碱),培养CHOK1细胞(表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白),检测不同添加物质对细胞密度、活力、蛋白表达量及蛋白中聚体含量的影响.结果 添加大豆蛋白水解物和酵母提取物的混合物、地塞米松及脂肪乳剂可增加细胞密度,提高细胞活力,增加目的蛋白的表达量,降低蛋白中的聚体含量.结论 通过对几种关键组分的优化,研制出适合于重组CHO细胞生长的低成本无血清培养基.
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人呼吸道合胞病毒适应株筛选及其生物学特性
目的 建立在Vero细胞上低温传代的人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)适应株,并分析其生物学特性.方法 从155份肺炎儿童痰样中经PCR、测序鉴定出14株RSV,将其在Vero细胞上37℃传代第1次收获的病毒记为野毒株(wild-type,WT),通过逐步降低培养温度的方法在Vero细胞传代获得1株适应株(adapted-strain,AS)KM516-AS.将RSV适应株感染A549细胞后,分别至37、25、32和39 ℃培养,测定其冷适应性和温度敏感性.分别将RSV适应株及其对应的野毒株KM516-WT经鼻腔免疫小鼠,于免疫后第8天,取肺组织制作病理切片,显微镜下观察病变程度;取鼻甲和右肺匀浆组织,制备上、下呼吸道匀浆液,测定上、下呼吸道病毒滴度;于免疫后第13天,经小鼠尾部静脉采血,分离血清,于免疫后第14天,取肺组织制备匀浆液,采用ELISA法测定总抗体滴度,病毒中和试验法测定中和抗体滴度.结果 RSV野毒株KM516-WT的适应温度范围较广,4个不同温度下的病毒滴度变化不大;RSV适应株KM516-AS的适应温度范围较窄,25℃时的病毒滴度高,随着温度的升高,病毒滴度逐渐降低,且仅有温度敏感性而无冷适应性.野毒株组小鼠肺部呈暗褐色,无严重的实质化,且肺泡和毛细血管中有明显的淋巴浸润;适应株组小鼠肺泡和毛细血管中淋巴浸润较少.适应株在体内的复制水平低于野毒株,并同野毒株一样具有较好的免疫原性.结论 获得1株RSV适应株,并具有一定的减毒效果.
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新型水包油佐剂SP01的安全性评价
目的 通过动物实验评价新型水包油佐剂SP01的安全性.方法 通过昆明小鼠安全药理试验、昆明小鼠急性毒性试验、Hartley豚鼠过敏反应试验、溶血性试验、日本大白兔局部刺激性试验、SD大鼠长期毒性试验及BALB/c小鼠致突变、致畸、致瘤试验,对水包油佐剂SP01的安全性进行全面评价.结果 水包油佐剂SP01对昆明小鼠的自主活动无明显影响;急性毒性试验中可观察到水包油佐剂SP01组昆明小鼠给药后无死亡,体重明显增加,且各组织器官无病理变化;水包油佐剂SP01注射豚鼠未见任何过敏反应及症状;溶血性试验结果显示,水包油佐剂SP01在体外对兔红细胞无溶血作用,不引起红细胞凝聚;将水包油佐剂SP01经日本大白兔耳缘静脉注射连续刺激5d后,佐剂组与氯化钠注射液组家兔耳缘静脉给药部位肉眼观察均无明显变化,病理切片显微镜观察均未见炎性浸润、血管周围组织出血及坏死等刺激现象;将水包油佐剂SP01经肌肉连续注射大鼠1个月,佐剂组大鼠体重明显增加,精神状态、食欲、睡眠情况与氯化钠注射液组无明显差异,停药后连续观察3个月,大鼠精神状态、食欲、睡眠情况均良好;将水包油佐剂SP01连续经BALB/c小鼠腿部肌肉注射14d后,其肌肉组织病理切片显示,与氯化钠注射液组小鼠的肌肉组织无明显差异.结论 水包油佐剂SP01对实验动物无急性毒性、过敏反应、局部性刺激、长期毒性及致突变、致畸、致瘤作用,是安全、可应用的油类佐剂,本研究为该系列水包油佐剂的临床应用提供了实验依据.
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PI3K/AKT信号在增强乳腺癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体敏感性中的作用及其机制
目的 分析磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路是否通过长细胞caspase-8样抑制蛋白(cellular FLICE inhibitory protein,c-FLIP-L)的介导来影响乳腺癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)的敏感性,并探讨其机制.方法 用40 nmol/L wortmannin(AKT活化的特异性抑制剂)、100 ng/ml TRAIL、40 nmol/L wortmannin+100 ng/ ml TRAIL处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞,并设空白对照组.MTT法检测药物作用24、48、72 h后的细胞增殖抑制率;流式细胞术检测药物作用48 h后的细胞凋亡率;Westem blot法检测细胞中磷酸化AKT(pAKT)和c-FLIP-L的表达.结果 TRAIL+ wortmannin组24、48和72 h细胞增殖抑制率与其他组比较,均明显升高(P＜0.05);TRAIL+wortmannin组与TRAIL组和wortmannin组比较,可明显促进细胞凋亡(Jp＜0.05);随着wortmannin作用时间的延长,pAKT的表达水平明显降低,同时c-FLIP-L的表达水平也随之下降,而TRAIL对pAKT和c-FLIP-L的表达无明显影响.结论 抑制PI3K/AKT通路可增强乳腺癌细胞对TRAIL的敏感性,这种作用可能是通过c-FLIP-L的介导来实现的.
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人葡萄糖调节蛋白78基因磷酸化位点的真核突变载体的构建及表达
目的 构建人葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)基因编码区磷酸化位点的真核突变载体,并在肝癌SMMC-7721细胞中进行表达.方法 利用定点诱变技术将GRP78基因的两个磷酸化位点进行突变,即203位苏氨酸(T)用丙氨酸(A)替换,466位酪氨酸(Y)用苯丙氨酸(F)替换,以质粒pEGFP-N1-GRP78为模板,进行PCR扩增后,构建突变质粒pEGFP-N1-GRP78(T203A)、pEGFP-N 1-GRP78(Y466F)和pEGFP-N1-GRP78(T203A/Y466F),并进行DNA测序分析.将测序正确的突变质粒转染肝癌SMMC-7721细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,Western blot法检测融合蛋白在细胞中的表达.结果 突变质粒pEGFP-N1-GRP78(T203A)、pEGFP-N1-GRP78(Y466F)和pEGFP-N1-GRP78(T203A/Y466F)经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;突变质粒组荧光蛋白表达分布于细胞质内,细胞核内无表达产物分布;3个突变质粒转染组在相对分子质量约105 000处均可见目的蛋白条带,大小与预期相符.结论 成功构建了人GRP78单突变T203A、Y466F和双突变T203A/Y466F真核表达载体,并可在肝癌SMMC-7721细胞中表达,为进一步研究GRP78基因磷酸化位点T203、Y466在肝肿瘤侵袭和转移中的作用奠定了基础.
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金黄色葡萄球菌表面蛋白的表达及其多克隆抗体的制备
目的 在原核细胞中表达金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A(fibronectin-binding protein A,FnBPA),制备其多克隆抗体.方法 筛选FnBPA抗原表位富集区,优化基因序列,分别克隆至质粒pGEX4T-2和pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pGEX4T-2-fnbpa和pET-28a-fnbpa,分别转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,分别用High Affinity GST-NTA resin和High Affinity Ni-NTA resin进行纯化.以纯化后的FnBPA-His融合蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,以FnBPA-GST融合蛋白为检测抗原,采用间接ELISA法检测血清效价,Western blot法检测特异性.结果 经双酶切及测序鉴定,证明质粒pGEX4T-2-fnbpa和pET-28a-fnbpa构建正确;在相对分子质量约42 000和19 000处,分别可见FnBPA-GST和FnBPA-His融合蛋白的表达,表达量分别约占菌体总蛋白的30％和20％,均以可溶性形式表达,纯度均在90％以上;免疫新西兰大白兔后获得高效价的特异性兔抗血清.结论 2种标签的融合蛋白均具有较好的免疫原性和抗原性,所制备的多克隆抗体具有较好的特异性,为金黄色葡萄球菌检测方法的建立奠定了基础.
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SF/COL/PLCL静电纺丝三维纳米纤维支架与人脐带血间充质干细胞的细胞相容性研究
目的 研究SF/COL/PLCL静电纺丝三维纳米纤维支架与人脐带血(human umbilical cord blood,hUCB)间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的细胞相容性.方法 分离、培养hUCBMSCs,并进行传代,取第3代hUCBMSCs,茜素红染色和Von Kossa染色检测其体外诱导成骨分化的能力;流式细胞术检测其表面相关抗原的表达.制备SF/COL/PLCL静电纺丝三维纳米纤维支架,扫描电镜观察其形貌表征,并检测其力学性能.将hUCBMSCs接种于静电纺丝三维纳米纤维支架上,观察细胞在支架上的生长及增殖情况.结果 hUCBMSCs具有成骨诱导分化能力,其表达CD44、CD29、CD90和CD105,不表达CD45和CD34.SF/COL/PLCL复合纳米纤维的纤维形貌良好,随着PLCL含量的增加,纤维的直径和力学性能均逐渐增加.hUCBMSCs能够在三维纳米纤维支架上很好地黏附,并相互连接向周围扩展,三维纳米纤维支架能很好地促进细胞黏附和增殖,与常规培养的细胞相比,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01),当SF/COL与PLCL的质量比为30∶70时,有利于细胞的生长.结论 hUCBMSCs能够在SF/COL/PLCL静电纺丝纳米纤维支架上生长、增殖,这种支架材料具有良好的力学性能及细胞相容性,有望成为一种新型组织工程支架材料.
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重组白喉毒素无毒突变体CRM197柱复性及纯化工艺的优化
目的 优化重组白喉毒素无毒突变体CRM197(recombinant cross reacting material 197,rCRM197)柱复性及纯化工艺.方法 将Sephacryl S-200凝胶柱复性和Q Sepharose FF强阴离子交换层析结合,复性和纯化rCRM197;通过正交试验L9(34)考察凝胶层析复性时流速、离子交换层析纯化的pH值、淋洗液中NaCl浓度和洗脱液中NaCl浓度4种因素对rCRM197纯度及回收率的影响,筛选rCRM197复性及纯化的佳工艺.结果 包涵体经Sephacrvl S-200凝胶柱复性后,相对分子质量小于36 000的杂质已被去除;经Q Sepharose FF离子交换层析后,rCRM197纯度达95％以上;在复性时流速为10 ml/min、离子交换层析纯化的pH值为7.5、淋洗液为50 mmol/L Tris-Cl+ 30 mmol/L NaCl、洗脱液为50 mmol/L Tris-Cl+ 50 mmol/L NaC1的条件下,rCRM197能达到纯度和回收率的共平衡.结论 已筛选出rCRM197复性及纯化的佳工艺,该工艺操作简便,制备的rCRM197纯度高,适用于rCRM197的产业化.
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屋尘螨变应原制品中铝含量微波消解-电感耦合等离子体原子发射光谱检测方法的建立
目的 建立微波消解-电感耦合等离子体原子发射光谱(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry,ICP-AES)法检测屋尘螨变应原制品中铝含量,并进行验证.方法 采用微波消解法对样品进行消解处理后,用ICP-AES法测定样品中的铝含量,并对建立的方法进行线性范围、精密度、准确性验证,确定低检出限和低定量限;用建立的方法检测2批次屋尘螨变应原制剂中的铝含量.结果 该方法铝元素浓度在0 ～0.30μg/ml范围内与分析线的响应值具有良好的线性关系(r=0.999 552);0.10 μg/ml标准品溶液连续进样11次,铝含量平均值为0.100 2 μg/ml,相对标准偏差(RSD)为1.2％;6份样品溶液的铝含量平均值为10.90 μg/ml,RSD为1.4％;3份样品溶液的平均加标回收率为95.5％,RSD为4.9％;该方法低检出限为0.008 5 μg/ml,低定量限为0.028 μg/ml.2批次共5份屋尘螨变应原制剂样品中铝含量测定结果均符合该企业注册标准中铝含量标准要求.结论 微波消解法对样品消解完全,采用微波消解-ICP-AES法可以对屋尘螨变应原制品中的铝含量进行准确定量,该方法操作简便,灵敏度、精密度、准确度良好.
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胃酶消化马血浆工艺参数的优化
目的 应用DOE试验优化破伤风抗毒素(tetanus antitoxin,TAT)生产中胃酶消化马血浆过程的工艺参数.方法 以破伤风类毒素免疫后的马血浆为原料,通过AKTA avant25中UNICORN 6.0软件设计4因子2水平全因子DOE试验模型,并以抗体F(ab')2含量为评价指标,对影响胃酶消化的主要因子即胃酶加量、消化反应pH值、反应温度和反应时间进行优化.结果 胃酶消化马血浆的适工艺参数为:胃酶加量为13 ～ 15 U/ml,消化反应pH值为3.0～3.1,反应温度为35～37℃,反应时间为90 ～ 120 min,在该条件下进行6次稳定性试验,制备的TAT抗体F(ab')2含量平均值达83.1％,标准偏差为2.47％.结论 DOE试验优化了TAT生产中胃酶消化马血浆过程的工艺参数,建立了有效的消化工艺,为降低过敏反应,提高TAT制品的质量提供了实验依据.
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米糠谷蛋白提取工艺的优化及其亚基组成分析
目的 优化米糠谷蛋白提取工艺,并分析其亚基组成.方法 以温度、NaOH浓度、时间和液料比为响应因子,以米糠谷蛋白提取率为响应值,利用Design Expert软件,采用中心组合实验Box-Behnken设计方案,制作响应曲面图,并分析米糠谷蛋白的亚基组成.结果 米糠谷蛋白的佳提取工艺为:提取温度55℃,NaOH浓度0.03 mol/L,时间46 min,液料比16∶1;模型预测米糠谷蛋白提取率为18.83％,实际得率为18.37％;米糠谷蛋白由相对分子质量约52 350、35 960、19 420和13 980的4个亚基组成,其中相对分子质量约35 960的亚基含量高.结论 实际结果与模型相符,表明拟合方程可靠,能够得到较高提取率的米糠谷蛋白.
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固化床反应器大规模灌注培养CHO-C28细胞生产乙型肝炎病毒表面抗原
目的 开发一种应用固定化反应器大规模培养CHO-C28细胞的灌注培养工艺,用于制备重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg).方法 利用自行研发的微型反应器以轴向旋转模拟固化床内培养基流经载体表面,分析固化床反应器灌注培养CHO-C28细胞表达HBsAg的可行性;使用AP20小型固化床反应器进行小试工艺;将AP20反应器消化后收集的2.3×1010个细胞接种至AP200固化床反应器,对灌注工艺进行中试放大,收获培养液,测定溶氧、pH、葡萄糖、乳酸及HBsAg蛋白浓度,并与转瓶培养工艺进行比较.结果 预装无纺纸片的微型反应器接种CHO-C28细胞后,可连续灌注培养60 d,HBsAg表达水平为1 100 ng/ml.AP20反应器接种CHO-C28细胞后,HBsAg表达水平在维持期约1 100 ng/ml;将AP20反应器培养至第10天的CHO-C28细胞消化后,收集2.3×1010个细胞,接种AP200反应器,可连续灌注培养60 d,生长期中,葡萄糖消耗速率高可达450 g/d,维持期葡萄糖消耗速率降至250 g/d,整个维持期内葡萄糖浓度维持在约1.5 g/L,收液中乳酸积累量为22 mmol/L,HBsAg表达水平约1 200 ng/ml.固化床灌注培养工艺的工艺条件控制精度高,培养环境更适合CHO-C28细胞生长,培养周期与转瓶工艺相当.结论 固化床反应器灌注培养CHO-C28细胞工艺与转瓶工艺HBsAg表达水平相当,具备较高的产业化应用价值.
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重组人IL-12病毒去除/灭活工艺的建立及验证
目的 建立重组人白细胞介素-12 (recombinant human IL-12,rhIL-12)的病毒去除/灭活工艺,并进行验证.方法 采用预过滤器(Viresolve Shield,纳米滤膜3.1 cm2)和除细小病毒过滤器(Viresolve Pro,纳米滤膜3.1 cm2)串联过滤,样品体积为90 ml,过滤时间为2h,安全系数为1.88,压力为30 psi,建立rhIL-12病毒去除工艺,分析该工艺对产品的比活性及回收率的影响,并以猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)作为指示病毒,对该工艺进行病毒去除效果验证;采用低pH孵放法(用1 mol/L HC1调pH值至3.8±0.1,室温放置180 min后,用1 mol/L NaOH调pH值至7.4)建立rhIL-12病毒灭活工艺,分析该工艺对产品的蛋白含量及比活性的影响,并分别以水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)和伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)作为指示病毒,对该工艺进行病毒灭活效果验证.结果 纳米膜串联过滤病毒去除工艺中,蛋白回收率为95.14％,比活性为过滤前的95.12％,对rhIL-12活性基本无影响;当滤出液达90 ml时,PPV下降滴度均大于4 log10,符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求.低pH孵放法病毒灭活工艺中,rhIL-12的蛋白含量在病毒灭活前后分别为359和338μg/ml,生物学活性分别为3.392×106和3.356×106 IU,均无明显变化;室温处理180 min后,指示病毒PRV、VSV的下降滴度均＞4 log10,符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求.结论 建立的rhIL-12膜过滤病毒去除工艺和低pH孵放法病毒灭活工艺均可有效地去除/灭活病毒,保证了产品的质量及安全性.
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原位杂交试剂盒在临床诊断领域的应用
原位杂交(in situ hybridization,ISH)技术是用于细胞内检测和定位某一特定靶核苷酸的新兴分子诊断技术,随着荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)和显色原位杂交(chromogenic in situ hybridization,CISH)技术的问世和发展,其在灵敏度、特异性、实验室安全性等方面均有了较大进步,并逐渐开发出商品化的试剂盒,应用于微生物检测、产前诊断、肿瘤的鉴别诊断及个体化用药等多个领域.本文将对ISH技术的概况、特点及该类试剂盒在临床诊断中的应用作一综述.
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假单胞菌属合成环脂肽分子的研究进展
假单胞菌属合成的环脂肽是一类由脂肪酸和肽链组成、通过酯键成环、具有两亲性的分子.环脂肽有多种生理功能,除具表面活性外,还具有抗细菌、抗病毒、抗真菌、抑制肿瘤细胞等活性,可作为潜在的抗生素类药物被开发.本文就假单胞菌属所合成环脂肽的种类、功能和生物合成机制进行总结,同时对分子生物学、生物信息学等新兴学科技术结合传统分离鉴定技术在发现新型环脂肽类物质方面的运用作一综述.
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两种不同配方含前S表位乙型肝炎疫苗的免疫原性及抗原活性比较
目的 对共表达的含前S1(PreS1)和前S2(PreS2)表位的乙肝表面抗原(SS1S2)及分别表达的含PreS1表位乙肝表面抗原(SS1)和含PreS2表位乙肝表面抗原(SS2)混合物的免疫原性及抗原活性进行比较,为疫苗配方的选择提供依据.方法 将SS1S2抗原、SS1抗原与SS2抗原的混合物(1∶1混合,以下简称SS1+SS2)分别用氢氧化铝佐剂吸附,制成SS1S2疫苗和SS1+ SS2疫苗,总抗原含量均为20 μg/ml,分别经BALB/c小鼠腹腔单次注射两种疫苗1.0、0.25和0.06μg,免疫后1、2、4周采血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中HBV S、PreS1和PreS2抗体水平.分别以纯化的SS1抗原或SS2抗原为参考品,采用ELISA法检测6批SS1S2抗原所对应的SS1或SS2抗原含量.结果 免后1、2、4周,3个剂量的SS1S2疫苗S抗体阳转率均高于同剂量的SS1+SS2疫苗,0.25 μg剂量的SS1S2疫苗PreS1抗体阳转率高于同剂量的SS1+SS2疫苗;免后1、2周,3个剂量的SS1S2疫苗PreS2抗体阳转率与SS1+SS2疫苗相近;免后4周,1.0和0.25μg剂量的SS1S2疫苗PreS2抗体阳转率高于SS1+SS2疫苗.免后4周,3个剂量的SS1S2疫苗的S和PreS1几何抗体平均滴度(GMT)均高于同剂量的SS1+SS2疫苗;1.0和0.25μg剂量的SS1S2疫苗的PreS2抗体GMT高于同剂量的SS1+ SS2疫苗.6批SS1S2抗原中,每10 μg SS1S2抗原所包含的PreS1抗原活性相当于(12.1±0.84) μg的SS1,每10 μg SS1S2抗原所包含的PreS2抗原活性相当于(7.0±0.52) μg的SS2;SS1S2抗原中SS1和SS2抗原活性之和远超过100％.结论 共表达的SS1S2抗原比单独表达的SS1抗原、SS2抗原具有更强的免疫原性;共表达的SS1S2抗原中PreS1和PreS2抗原活性也得到增强.
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水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株)在人二倍体细胞(2BS株)中感染复数的分析
目的 探讨水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株)在人二倍体细胞(2BS株)上的感染活性,确定感染复数(MOI).方法 使用100 ml小方瓶培养人二倍体细胞(2BS株),待长成致密单层后,接种病毒滴度为5.5 lgPFU/ml的水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株),每瓶接种量分别为0.02、0.1、0.3、0.5、0.8、1、1.5和2 ml,于显微镜下连续观察细胞病变情况及病变比例,并连续记录收获时间;采用蚀斑法测定病毒滴度.结果 当病毒接种量为0.02 ml时,细胞大部分生长正常,呈极性排列,无形态典型、广泛的病变,通过延长收获时间也无法获得形态典型、广泛的病变;当病毒接种量不低于0.1ml时,呈典型、广泛的病变,随着病毒接种量的增加,收获时间逐渐缩短;仅病毒接种量为0.02 ml组细胞的病毒滴度低于3.7 lgPFU/ml;确定MOI在0.004 0 ～0.019 9之间,均可制备出质量稳定、符合成都生物制品研究所有限责任公司《水痘减毒活疫苗制造及检定规程》要求的毒种.结论 确定了水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株)感染人二倍体细胞(2BS株)合适的MOI,为水痘疫苗生产工艺的优化提供了参考依据.
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抗人细胞间粘附分子-1嵌合抗体的制备及其生物学活性
目的 构建抗人细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)嵌合抗体的真核表达质粒,在CHO-dhfr-细胞中进行表达,并检测其生物学活性.方法 采用RT-PCR法从特异性分泌抗人ICAM-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F2中扩增抗体VH和VL基因,从人淋巴细胞RNA中扩增人κ、IgG1的轻、重链恒定区序列,再通过重叠延伸PCR连接鼠源性可变区基因片段与人源性恒定区基因片段,获得人-鼠嵌合抗体基因;将轻、重链基因连接至pIRES双表达载体,构建嵌合抗体真核表达质粒;将质粒在脂质体LipofectAMINE介导下转染CHO-dhfr细胞进行表达,表达的嵌合抗体经Protein A-Sepharose 4B亲和层析柱纯化后,紫外分光光度法测定抗体浓度,ELISA法检测嵌合抗体的特异性抗原结合活性及人源性,并进行还原性SDS-PAGE分析、Western blot分析及抑制细胞间黏附活性分析.结果 嵌合抗体真核表达质粒pIRES-anti-ICAM-1经双酶切鉴定构建正确;嵌合抗体在真核细胞CHO-dhfr-中高效表达,培养上清中表达量可达0.5 mg/L;纯化的嵌合抗体经10％还原性SDS-PAGE分析,可见相对分子质量分别约为25 000的IgG轻链和50 000的IgG重链,相对分子质量约25 000的蛋白可被羊抗人IgG κ链所识别,而相对分子质量约50 000的蛋白可被羊抗人IgG γ链所识别;纯化的嵌合抗体可与羊抗人κ链或羊抗人IgG多抗呈强阳性反应,可与人ICAM-1抗原特异结合;该嵌和抗体具有良好的抑制内皮细胞与单核细胞黏附的活性.结论 成功制备了抗人ICAM-1嵌合抗体,并在真核细胞中实现高表达,该抗体减少了鼠源性成分,降低了其免疫原性,为ICAM-1相关的炎性疾病的抗体治疗奠定了基础.
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第一批赖氨酸升压素国家标准品的制备
目的 制备第一批赖氨酸升压素国家标准品.方法 以英国国家生物制品检定所(National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)提供的WHO第一批赖氨酸升压素国际标准品作为标准,选择4个实验室,采用《中国药典》二部(2010版)附录ⅫA升压素生物测定法对第一批赖氨酸升压素国家标准品待标品的生物效价进行协作标定,并比较二者的高效液相色谱(HPLC)主峰保留时间;按照《中国药典》二部(2010版)附录ⅧM水分测定法,第一法(费休氏法)B.库仑滴定法测定第一批赖氨酸升压素国家标准品待标品的水分含量.结果 第一批赖氨酸升压素国家标准品待标品经协作标定,确定其生物效价为4.0IU/支;其HPLC主峰保留时间与第一批赖氨酸升压素国际标准品一致;其水分含量为2.9％.结论 本批待标品可作为第一批赖氨酸升压素国家标准品,以供赖氨酸升压素效价测定、鉴别及升压物质检查使用.
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福建省麻疹疫苗强化免疫前后非目标人群麻疹流行病学特征分析
目的 分析2006 ～ 2011年福建省麻疹疫苗强化免疫前后非目标人群麻疹流行病学特征,为消除麻疹策略提供依据.方法 采用描述性流行病学方法,分析国家疾病监测信息报告系统中福建省麻疹疫苗强化免疫前(2006～2008年)和强化免疫后(2009 ～ 2011年)非目标人群麻疹病例的流行病学特征.结果 麻疹疫苗强化免疫后,福建省全人群麻疹年均报告发病率下降了95.65％,非目标人群麻疹年均报告发病率下降了92.97％;麻疹强化免疫后,非目标人群麻疹发病呈高度散发,但仍以春季为主,占病例总数的53.75％;所有地市非目标人群报告发病率均大幅下降,下降幅度在84.61％～ 98.59％之间,地区分布以经济发达地区福州市,经济欠发达地区宁德、南平市为主;发病人群以异地户籍为主,占病例总数的66.87％,与强化免疫前差异有统计学意义(P＜0.05);性别、年龄、职业构成与强化免疫前差异无统计学意义(P＞0.05).结论 强化免疫有正向外延效应,能大幅降低非目标人群发病率,后续应加强常规免疫、强化监测和应急处置,维持高群体免疫力,特别要关注人员流动频繁、边远贫困的地区以及流动人口,才能实现消除麻疹的目标.
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呋喃唑酮代谢物单克隆抗体及其新型免疫层析检测试纸条的制备
目的 制备呋喃唑酮代谢物AOZ单克隆抗体及其胶体金与荧光淬灭免疫层析试纸条.方法 将AOZ衍生成CPAOZ后,与载体蛋白BSA偶联,制备完全抗原CPAOZ-BSA,经皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,共5次,取小鼠睥细胞与SP2/0细胞融合,获得稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株.利用获得的抗CPAOZ单克隆抗体制备胶体金及荧光淬灭免疫层析试纸条,并对试纸条的灵敏度及特异性进行验证.结果 制备的完全抗原经紫外扫描鉴定偶联成功.共获得3株能稳定分泌抗CPAOZ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中效价和特异性好的1株2H11针对CPAOZ的50％抑制质量浓度(IC50)为0.88 ppb.以该抗体制备的胶体金及荧光淬灭免疫层析试纸条的低检测限分别为7.5和0.062 5 ppb;两种试纸条与其他3种硝基呋喃类代谢物CPAMOZ、CPAHD、CPSEM均不存在交叉反应.结论 成功制备了抗CPAOZ单抗及其胶体金免疫层析和荧光淬灭免疫层析试纸条,两种试纸条均具有较高的灵敏度和较强的特异性,其中荧光淬灭免疫层析试纸条的灵敏度较胶体金免疫层析试纸条高约100倍,具有良好的应用前景.
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关于加强生物制品生产用胰酶质量控制的思考
采用细胞培养技术获得疫苗抗原成分或重组表达的目的蛋白,是当前世界各国生物制品普遍采用的生产方式.细胞培养过程中,通常使用适宜浓度的胰蛋白酶(简称胰酶),将细胞从培养容器表面消化下来,进行细胞传代培养,或者将组织消化成含有单个细胞的悬液,再形成次代细胞.胰酶除了具有消化细胞的功能外,在某些病毒性疫苗生产过程中,如细胞培养制备的流感疫苗[1]和轮状疫苗[2],往往在病毒增殖培养阶段加入适量的胰酶作用于病毒抗原,暴露与细胞结合的受体位点,可以增加病毒的活性.对于某些重组制品,如重组胰岛素,通常使用胰酶作为剪切酶,将胰岛素原转化为具有生物活性的胰岛素[3].
| 年 | 期数 |
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