中国生物制品学杂志
Chinese Journal of Biologicals 중국생물제품학잡지
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
- 影响因子： 0.41
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1004-5503
- 国内刊号： 22-1197/Q
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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创伤弧菌溶血素蛋白的原核表达及纯化
目的 构建创伤弧菌溶血素(Vibrio vulnificus cytolysin,VVC)基因原核表达质粒,表达并纯化重组蛋白.方法 从创伤弧菌基因组DNA中钓取VVC基因,插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组蛋白用镍离子金属螯合柱纯化,采用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果 重组表达质粒pET-32a(+)-VVC经双酶切及测序证明,VVC基因长度为1 371 bp,与GenBank中登录的VVC基因序列同源性为99%;表达的融合蛋白相对分子质量约为71 000,主要以包涵体形式表达,表达量达菌体总蛋白的50%;纯化的重组蛋白纯度大于90%,可与创伤弧菌免疫的小鼠血清特异性结合.结论 已在大肠杆菌中高效表达了VVC蛋白,并进行了纯化,为创伤弧菌诊断试剂盒的研制提供了材料,也为进一步深入研究其结构功能域、生物学活性及创伤弧菌的致病机制奠定了基础.
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体外培养乳腺癌细胞线粒体差异蛋白的筛选
目的 比较体外培养的乳腺癌细胞与正常乳腺细胞线粒体蛋白指纹图谱,筛选差异蛋白,为乳腺癌亚细胞蛋白标志物的研究奠定基础.方法 提取乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7及正常乳腺细胞株HBL-100线粒体蛋白,表面增强激光解析蛋白飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)检测蛋白表达,Biomarker Wizard Software分析软件统计结果,筛选差异蛋白,并探讨溶剂及长期冻存对结果分析的影响.结果 在相对分子质量2 000～100 000范围内检测到近200个蛋白峰,HBL-100与MDA-MB-231和MCF-7细胞相比,差异蛋白峰分别为45个和36个(P＜0.05),其中相对分子质量9 200、13 800、14 000和22 500的蛋白在2株癌细胞中表达均下降,相对分子质量10 000和11 600的蛋白在2株癌细胞中表达均升高.4‰的TritonX-114及冻存3～6个月对结果分析无影响.结论 SELDI-TOF-MS能够快速、灵敏地检测分析乳腺癌线粒体差异表达蛋白,为亚细胞水平乳腺癌标志物的研究提供了新的思路.
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垂体腺苷酸环化酶激活多肽38及其衍生物的表达、纯化和活性
目的 提高垂体腺苷酸环化酶激活多肽38(Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide 38,PACAP38)的体内稳定性、延长其生物学活性.方法 对PACAP38的氨基酸序列进行改造(命名为PACAP38衍生物cPACAP38),并根据大肠杆菌密码偏爱性设计并合成PACAP38及其衍生物的基因片段;分别将两基因片段克隆至表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;表达的融合蛋白经镍离子亲和层析纯化,肠激酶切割获得目的 多肽;通过小鼠饮食抑制试验比较两多肽的体内活性;长期给药观察小鼠腹腔糖耐量及小鼠血清甘油三酯、HDL、LDL和胆固醇的变化.结果 两种融合蛋白Trx-PACAP38和Trx-cPACAP38的表达量分别占菌体总蛋白的22%和25%,为可溶性表达,纯化后纯度分别为90%和98%;PACAP38及cPACAP38均有抑制小鼠饮食的作用,cPACAP-38的效果优于PACAP38;连续给药10 d后,小鼠腹腔糖耐量、血清甘油三酯、HDL、LDL、胆周醇均无明显变化.结论 已成功获得体内活性更稳定的PACAP38衍生物,为PACAP38的基础研究及应用奠定了基础.
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SALL4基因在苦参碱诱导白血病THP-1细胞凋亡过程中的表达
目的 探讨癌基因SALL4在苦参碱诱导人急性单核细胞白血病M5型THP-1细胞株凋亡过程中的表达及其意义.方法 分别以1.0、1.5及2.0 g/L的苦参碱处理THP-1细胞,于24、48及72 h后,电镜观察细胞形态学改变;MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡;RT-PCR检测细胞SALL4基因mRNA的表达.结果 经1.0 g/L苦参碱作用24 h的THP-1细胞呈不同程度的凋亡形态改变;与对照组相比,各浓度苦参碱组均能显著抑制THP-1细胞增殖及促进细胞凋亡,且呈浓度和时间依赖性(P＜0.05);各浓度苦参碱组SALL4基因mRNA的表达水平较对照组均显著下降,且呈浓度和时间依赖性(P＜0.05).结论 LALL4基因表达下降在苦参碱诱导白血病THP-1细胞凋亡过程中可能可能起重要作用.
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人博卡病毒结构和非结构蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备
目的 原核表达、纯化人博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)结构蛋白(VP2)和非结构蛋白(NS1和NP1),并制备多克隆抗体.方法 采用PCR法扩增HBoV VP2、NS1和NP1基因,克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,转化E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经离子交换和Ni2+金属螯合层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析,并免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价.结果 重组原核表达质粒pET-30a-VP2、pET-30a-NS1和pET-30a-NP1经双酶切和测序证实构建正确;重组VP2蛋白以包涵体形式表达为主,重组NP1蛋白以可溶性表达为主,重组NSl蛋白为包涵体形式表达,表达量分别为菌体总蛋白的20%、40%和30%;纯化的重组蛋白纯度分别可达85%、95%以上和80%o,免疫BALB/c小鼠制备的多克隆抗体效价分别为VP2和NP1高于1:16 000,NS1为1:8 000.结论 已成功表达了HBoV VP2、NS1和NP1蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为进一步研究HBoV的致病机制及开展流行病学调查等提供了材料.
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人参皂甙Rh2提高人源肝癌细胞HepG2对桦木酸敏感性的作用机制
目的 探讨人参皂甙Rh2(G-Rh2)提高人源肝癌细胞HepG2对桦木酸(Bet A)敏感性的作用机制.方法 将对数生长期的HepG2细胞分为4组:G-Rh2组(加入7.5 μg/ml G-Rh2)、Bet A组(加入10 μg/ml Bet A)、G-Rh2+Bet A组(加入7.5μg/ml G-Rh2和10 μg/ml Bet A)及以不加药的细胞作为对照,荧光显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术分析细胞凋亡,并检测细胞Caspase-3活性,Western blot检测细胞Caspase-3底物多聚(ADP-核糖)聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]断裂和Caspase-9激活情况.结果 与G-Rh2和Bet A组相比,G-Rh2+Bet A组超过75%的细胞可见凋亡特征,且处于subG1期细胞的比例增加,Caspase-3活性增强,PARP和Caspase-9断裂明显.结论 G-Rh2提高HepG2细胞对Bet A的敏感性是通过细胞凋亡实现的,且涉及线粒体途径.
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广东眼镜蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及其酶活性质
目的 从广东舟山眼镜蛇毒中分离纯化磷脂酶A2(Phospholipase A2,PLA2)组分,并分析其理化性质、酶活性质以及影响其酶活力的因素.方法 采用化学沉淀、Sephadex G-50凝胶过滤及UND Sphere S阳离子交换层析法对PLA2进行分离纯化;采用BCA法测定其蛋白浓度,HPLC法测定其纯度,SDS-PAGE测定其相对分子质量,PLA2测定方法测定其活力;并考察反应温度、反应pH值及金属离子对酶活性的影响及其热稳定性.结果 从广东舟山眼镜蛇毒中分离的PLA2蛋白浓度为0.6mg/ml,回收率为9.5%,HPLC纯度为99%,相对分子质量为14 300,比活力为133 μmol/(mg·min);适反应温度及pH值分别约为60℃C和8.5;Ca2+和Mg2+可增强酶活力,K+、Ni2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Co2+和Cr2+对酶活力均有抑制作用;该酶具有较高的热稳定性.结论 从广东舟山眼镜蛇毒中分离纯化出一种高纯度的PLA2,该酶具有较高的适反应温度和热稳定性.
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产朊假丝酵母尿酸酶脂质体的酶学性质及其免疫原性
目的 研究脂质体介导的产朊假丝酵母尿酸酶(Uricase,UC)的酶学性质及其免疫原性.方法 采用逆向蒸发法制备UC脂质体,测定UC脂质体和UC的适反应温度、适pH值、酸碱稳定性以及部分金属离子和有机化合物对酶活力的影响;并以其为抗原免疫SD大鼠,制备抗血清,通过间接ELISA法检测血清抗体效价.结果 UC脂质体和UC的适反应温度均为40℃;适反应pH值分别为8.0和8.5;UC脂质体的稳定性明显高于UC;UC脂质体和UC的血清抗体效价分别为1:500和1:8 000.结论 产朊假丝酵母UC脂质体的酶学性质明显优于UC,免疫原性明显低于UC,为该酶的临床应用提供了实验依据.
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大鼠1,25(OH)2D3膜相关快速反应类固醇结合蛋白的原核表达及纯化
目的 原核表达并纯化大鼠1,25(OH)2D3膜相关快速反应类固醇结合(1,25D3-Membrane associated rapid response steroid binding,1,25D3-MARRS)蛋白.方法 经RT-PCR扩增大鼠1,25D3-MARRS基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,M-NTA亲和层析纯化目的 蛋白,并进行Western blot鉴定.结果 重组原核表达质粒pET-32a-1,25D3-MARRS经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为77 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%;纯化的重组蛋白纯度达90%以上,且具有良好的反应原性.结论 已成功表达并纯化了重组1,25D3-MARRS蛋白,为进一步研究其性质、功能及分布特点奠定了基础.
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重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体的构建与鉴定
目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HA标签的SH2基因重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体Ad5-hSH2mt-EGFP,并观察其对K562细胞增殖的影响.方法 设计并化学合成引物,采用RT-PCR法扩增hSH2基因,重叠PCR法扩增hSH2mt基因,分别克隆至pAdTrack-CMV,构建穿梭质粒,经Pme I酶切,转化感受态pAdEasy-BJ5183,在细菌内同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGPF和pAd5-hSH2mt-EGPF.Pac Ⅰ酶切后转染AD293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,扩增病毒,测定滴度并经PCR和Western blot鉴定.重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测病毒对K562细胞增殖活性的影响.结果 重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGFP和pAd5-hSH2mt-EGFP经酶切鉴定构建正确;重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP的滴度均可达1.6×1012;PCR结果表明,2种重组腺病毒包装和扩增成功,Western blot结果表明,重组腺病毒携带的目的 基因能够在AD293细胞中表达;MTT检测证实,Ad5-hSH2-EGFP 对K562细胞的增殖具有明显的抑制作用.结论 已成功构建重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,Ad5-hSH2-EGFP能在体外明显抑制K562细胞的增殖,为进一步探讨SH2基因对慢性粒细胞白血病的治疗作用及其机制奠定了基础.
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肠道病毒71型类病毒颗粒在昆虫细胞Sf9中的表达
目的 构建含有肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)P1和3CD基因的嵌合型重组杆状病毒质粒,探讨3CD蛋白酶对P1蛋白的切割作用及形成类病毒颗粒(Virus-like particles,VLPs)的可能性.方法 将EV71的P1和3CD基因克隆至同一pFastBac Dual质粒上,转化感受态大肠杆菌DH10,构建重组杆状病毒质粒Bac-P1-3CD,转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒,经SDS-PAGE、Western blot及电镜对目的 基因表达产物进行分析.结果 重组杆状病毒质粒Bac-P1-3CD经PCR鉴定证明构建正确.重组杆状病毒感染的Sf9细胞经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约39 000、32 000和26 000的特异条带,大小与EV71的VP1、VP0、VP3蛋白相符;Western blot分析可见与EV71 VP1蛋白大小相近的特异条带;电镜观察可见EV71类病毒颗粒.结论 EV71的P1和3CD嵌合基因可以通过重组杆状病毒在昆虫细胞中表达,3CD蛋白酶可以切割P1蛋白得到VP1抗原,并能形成类病毒颗粒.
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人P115基因重组真核表达质粒的构建及其对肝癌细胞增殖的影响
目的 构建人P115基因重组真核表达质粒,并探讨其过表达对人肝癌细胞HepG2增殖活性的影响.方法 采用RT-PCR从HepG2细胞中扩增人P115基因,插入pEGFP-N1 Vector(+)载体,构建重组真核表达质粒pEGFP-N1 Vector(+)-USO1,将重组质粒转染至HepG2细胞,免疫荧光及流式细胞术检测转染效率;RT-PCR及Western blot检测转染细胞中P115基因及蛋白的表达;MTT法检测转染细胞的增殖活性、流式细胞术检测细胞周期变化.结果 重组真核表达质粒pEGFP-N1 Vector(+)-USO1经酶切鉴定及测序证明构建正确;重组质粒转染HepG2细胞的转染效率达84.83%;重组质粒转染的HepG2细胞中P115基因和蛋白的表达水平及细胞增殖活性均明显高于空载体转染和未转染的细胞;重组质粒转染的细胞G1/G2期比例明显减少,S期比例明显增加.结论 已成功构建了人P115基因重组真核表达质粒,其在肝癌细胞中过表达P115可促进肝癌细胞增殖.
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大鼠骨髓间充质干细胞向肌成纤维母细胞的体内诱导
目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在不同疾病模型中分化为肌成纤维母细胞的可能性.方法 取大鼠股骨和胫骨,采用全骨髓差异贴壁法分离纯化BMSCs,并体外传代,取第3代BMSCs,经流式细胞仪鉴定细胞表面抗原,并对其进行成骨、成脂诱导.将35只SD大鼠分为5组:正常对照组(A组)、肝纤维化模型组(B组)、溃疡性结肠炎模型组(C组)、BMSCs肝纤维化移植组(D组)和BMSCs溃疡性结肠炎移植组(E组),每组7只.B组和D组大鼠经皮下注射40%四氯化碳复制肝纤维化模型,建模8周后,D组大鼠通过尾静脉移植经DAPI标记的大鼠BMSCs 1×106个;C组和E组大鼠采用三硝基苯磺酸(TNBS)-乙醇溶液灌肠,复制溃疡性结肠炎模型,灌肠后24 h,E组大鼠通过尾静脉移植DAPI标记的大鼠BMSCs1×106个.于移植BMSCs 2周后处死所有大鼠,取B组和D组大鼠肝组织,经HE、VG染色观察肝脏病理变化;取C组和E组大鼠结肠组织,经HE染色观察肠组织病理变化;所有组织经免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)的表达,激光共聚焦显微镜观察BMSCs在肝脏和肠道的分布,并观察α-SMA的分布.结果 BMSCs表达CD29、CD166和CD90,不表达CD45,并可进行成骨、成脂诱导.B组和D组大鼠肝组织建模10周后可见大鼠肝索排列紊乱,在门脉区有大量的胶原纤维增生,形成假小叶;C组和E组大鼠结肠可见黏膜增厚,形成溃疡,黏膜及黏膜下层可见大量炎性细胞浸润.DAPI标记的BMSCs主要分布在D组大鼠肝脏纤维条索中,并同时表达α-SMA;而E组大鼠结肠黏膜及黏膜下层中可见DAPI标记的BMSCs,这些细胞同时也表达α-SMA.结论 BMSCs在肝纤维化大鼠肝脏和溃疡性结肠炎大鼠结肠中均可分化为肌成纤维母细胞.
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霍山石斛提取物对人喉癌细胞Hep-2增殖和凋亡的影响及其机制
目的 探讨霍山石斛提取物(Water extracts from Dendrobium huoshanense,WEDH)对人喉癌细胞株Hep-2增殖和凋亡的影响及其机制.方法 分别用3.75、7.50、15.00、30.00和60.00mg/ml的WEDH处理Hep-2细胞,采用MTT法检测各组细胞的增殖水平;倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化;Annexin V-FITC/PI双染色激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡;Fluo-3 AM标记激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i);分光光度法检测细胞的Caspase-3活性.结果 WEDH可明显抑制Hep-2细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性,作用24、48和72 h的IC50值分别为48.54、26.67和14.93 mg/ml;经WEDH作用48 h的细胞形态均发生显著改变,呈现典型的细胞凋亡特征,且呈浓度依赖性,细胞内[Ca2+]i浓度和Caspase-3活性均显著高于阴性对照组(P＜0.05).结论 WEDH对Hep-2细胞具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用,其机制可能与升高细胞内[Ca2+];浓度,激活Caspase-3有关.
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VEGF-SLC融合基因的克隆与原核表达
目的 构建血管内皮生长因子(Vascular endothelial growthfactor,VEGF)-次级淋巴组织趋化因子(Secondary lymphoid-fissue chemokine,SLC)融合基因(VEGF-SLC)的原核表达质粒,表达并纯化重组VEGF-SLC融合蛋白.方法 利用Gene SOEing法扩增VEGF-SLC基因,将融合基因插入载体pQE30,构建重组表达质粒pQE30-VEGF-SLC,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化.结果 重组表达质粒经双酶切和测序证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约28 000,诱导5 h表达量高,约占菌体总蛋白的19%,主要以包涵体形式存在,可与鼠抗人VEGF单抗特异性结合;纯化的重组融合蛋白纯度可达90%以上.结论 已成功在大肠杆菌中表达并纯化了重组VEGF-SLC融合蛋白,为进一步研究其生物学活性及其靶向抗肿瘤效应以及开发肺癌等肿瘤的靶向生物制剂奠定了基础.
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甜菜碱与蛋氨酸螯合铬对三江白猪血清生化指标及皮下脂肪组织脂肪酸合成酶基因mRNA表达的影响
目的 探讨甜菜碱与蛋氨酸螯合铬对三江白猪血清生化指标及皮下旨肪组织脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)基因mRNA表达的影响.方法 选取81头平均体重约52 kg的三江白猪,采用3×3(蛋氨酸鳌合铬×甜菜碱)二因子三水平有重复试验设计,将其分成9组,每组3个重复,每个重复3头猪.在玉米-豆粕型日粮基础上,添加不同水平的蛋氨酸螯合铬(以铬计,0、200、400μg/kg)和甜菜碱(0、1 000、1 250 mg/kg),研究二者对肥育猪血清生化指标及皮下脂肪组织FAS基因mRNA表达的影响.结果 甜菜碱与蛋氨酸螯合铬均可降低肥育猪血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHO)和胰岛素(INS)含量及FAS基因mRNA的表达水平,提高生长激素(GH)水平,复合添加9组血清TG浓度与对照组相比,差异显著(P＜0.05),并存在交互作用.复合添加6组血清CHO、GH和INS浓度与对照组相比,差异显著(P＜0.05),并存在交互作用,复合添加8组FAS基因mRNA的丰度与对照组相比,差异显著(P＜0.05),并存在交互作用.结论 甜菜碱与蛋氨酸螯合铬均能减少脂肪沉积,且以复合添加效果较好,并存在一定的交互效应.
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犬MC4R基因原核表达质粒的构建与表达
目的 构建犬MC4R基因的原核表达质粒,并表达重组蛋白.方法 以重组质粒pcDNA3.1-myc-his/A-cMC4R 为模板,PCR扩增MC4R基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-30a(+)-MC4R,转化入E.coli Transetta(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果 重组表达质粒pET-30a(+)-MC4R经双酶切鉴定证明构建正确,DNA测序证实插入序列与GenBank中登录序列的同源性为99%,只有编码区777位碱基T变成了C;表达的重组蛋白相对分子质量约为37 000,诱导4 h表达量高,占菌体总蛋白的8%;重组蛋白可与抗His单抗特异性结合.结论 已成功构建犬MC4R基因原核表达质粒,并表达了重组蛋白,为犬MC4R蛋白多克隆及单克隆抗体的制备提供了抗原.
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H5N1大流行流感疫苗的研究进展
高致病性H5N1流感病毒可导致严重的致死性疾病,对人类健康造成了极大威胁.尽管目前尚未发生人与人之间传播,但该病毒一旦与人流感病毒重组,即有可能转变为可在人与人之间传播的高致死性流感病毒,从而导致新的流感大流行.此外,H5N1流感病毒经过不断变异后可突破种属屏障,从禽类传播给哺乳动物及人类,并进一步在病毒和宿主的多种因素作用下导致宿主发病乃至死亡.本文对H5N1大流行流感疫苗的研究进展作一综述.
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基因治疗类产品安全性评价的研究进展
基因治疗作为一种全新的疾病治疗手段,日益受到人们的关注.而作为一种新型药物,基因治疗类产品的安全性已成为基因治疗评价的首要内容.本文仅从载体和基因表达产物两方面对基因治疗类产品的安全性及其评价的研究进展作一综述.
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响应面法优化桦褐孔菌发酵培养基
目的 利用响应面分析法对桦褐孔菌发酵培养基进行优化,提高多糖产量.方法 应用Plackett-Burman设计和响应面法,对桦褐孔菌发酵培养基成分进行优化.用Design-Expert软件对实验数据进行多元回归分析,并建立3种主要因素(淀粉、酵母粉和磷酸二氢钠)与多糖产量之间的函数关系.用终优化的配方进行3次验证实验.结果 通过快速"登高法"对3个显著因素进行寻优,培养基中3因素佳浓度为:淀粉7.5 g/L,酵母粉1.71 g/L,磷酸二氢钠1.35 g/L,胞外多糖产量高可达9.12 g/L.3次验证实验所测得的多糖产量分别为9.08、8.96和9.12 g/L,平均值为9.05 g/L,与预测结果基本一致.结论 优化的桦褐孔菌发酵培养基可显著提高胞外多糖产量.
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Vero细胞LTR基因的克隆及其DNA定量PCR检测方法的建立
目的 克隆Vero细胞基因组DNA的长串联重复序列(Long tandem repeats,LTR),并建立vero细胞DNA定量PCR检测方法.方法 提取Vero细胞基因组DNA,经HindⅢ酶切后,克隆至pET-30a(+)载体上,酶切及测序鉴定,并与GenBank中登录的序列进行同源性比较.以172 bp序列为靶基因设计定量PCR引物和Taq探针,建立Vero细胞DNA定量PCR检测方法,并进行特异性验证.结果 经酶切及测序鉴定,共获得8个阳性克隆质粒pET-30a-172,与GenBank中登录的基因序列同源性在98.3%～99.4%之间;建立的Vero细胞DNA定量PCR检测方法的灵敏度可达1×10-6ng/μl,线性范围为1 ng/μl～1 × 10-6ng/μl;以建立的方法检测鸡胚细胞、CHO细胞和地鼠肾细胞DNA,均未见扩增曲线,仅人二倍体细胞(MRC-5)DNA有明显的扩增曲线,表明该法特异性良好.结论 已成功建立了以172 bp LTR为靶基因的Vero细胞DNA定量PCR检测方法,可用于疫苗中Vero细胞DNA残留量的检测.
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人凝血酶原复合物短波紫外灭活细小病毒验证及对产品质量的影响
目的 应用短波UVC对人凝血酶原复合物(Prothrombin complex concentrate,PCC)进行灭活处理,验证病毒灭活效果及对产品质量的影响.方法 以猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)作为指示病毒,采用短波UVC对PCC样品进行灭活,紫外辐射剂量分别为200、250和300 J/m2,微量细胞培养法检测病毒滴度,对未出现病变的样品盲传3代,验证灭活效果;应用二维电泳(2-DE)、高效液相色谱技术(HPLC)及活性检测方法对PCC样品的结构和功能及活性进行评价.结果 短波UVC法可使PPV滴度降低4.0log以上,所有样品在肓传第3代时均检测到细胞病变.在无保护剂的情况下,凝血因子活性回收率大于70%;HPLC分析结果证实,UVC照射后,凝血因子蛋白聚合体含量无明显改变,与照射前比较,蛋白的色谱行为基本一致;2-DE检测显示,样品照射前后,图谱蛋白斑点数量基本相等,其中300 J/m2UVC处理组有2个蛋白点群出现位置和灰度值的变化.结论 短波UVC对无胞膜病毒灭活效果较好,且该灭活方法对PCC制品蛋白活性影响较小.
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应用篮式生物反应器制备Vero细胞人用狂犬病疫苗
目的 应用篮式生物反应器制备Vero细胞人用狂犬病疫苗.方法 以人用狂犬病疫苗株aGV为毒种,Vero细胞为培养基质,利用14 L生物反应器(500g片状载体置于载体篮内)灌流式培养,连续收获的病毒液经超滤浓缩、灭活、柱层析纯化后,加入冻干保护剂,制备冻干人用狂犬病疫苗,检测冻干前后及37℃放置28 d后的疫苗效价.结果 细胞密度高可达1.0×107个/ml;病毒收获液毒力为7.5×106～3.4×108FFU/ml;纯化后总蛋白质含量小于80μg/0.5ml,Vero细胞蛋白质残留量≤3.5μg/0.5 ml,Vero细胞DNA残留量小于100 pg/0.5ml,疫苗效价大于5.0IU/0.5 ml.结论 应用篮式生物反应器可制备高质量的人用狂犬病疫苗.
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肺炎链球菌溶血素△A146Ply黏膜免疫的保护效果
目的 探讨肺炎链球菌146位氨基酸缺失的溶血素△A146Ply蛋白的保护作用,评价其作为肺炎链球菌疫苗候选蛋白的可行性.方法 将BALB/c小鼠分为2组:试验组(15μg△A146Ply蛋白与1 mg/ml CT佐剂的混合物30μl)和对照组(PBS与CT佐剂的混合物30μl),经鼻腔免疫小鼠,每周1次,连续4周.末次免疫1周后,ELISA检测免疫小鼠血清及唾液中特异性抗体水平;并进行△A146P1y对多种血清型肺炎链球菌感染的主动保护试验及其特异性抗血清的被动保护试验;Western blot分析Ply蛋白在肺炎链球菌中的保守性;间接ELISA检测免疫小鼠血清IgG抗体亚型和细胞因子IL-17A水平.结果 试验组小鼠血清中IgG效价为5.12×105,唾液中IgG及IgA效价分别为4.0×103和4.8×103;△A 146Ply黏膜免疫可有效延长小鼠的生存时间,并提高其生存率;其对肺炎链球菌NCTC7466、CMCC(B)31436、CMCC(B)31614和CMCC(B)31207的保护率分别为50.0%、41.7%、50.0%和41.7%;被动免疫保护试验试验组小鼠的存活率为70%;△A146Ply黏膜免疫诱导的抗体亚型主要为IgG1和IgG2b,IL-17A的水平高达(678.55±189)pg/ml,于刺激后48 h达峰值.Ply在4种菌株中均具有良好的保守性.结论 △A146Ply黏膜免疫可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应,能有效抵抗多株致病性肺炎链球菌的感染,提示△A146Ply是肺炎链球菌较好的疫苗候选蛋白.
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表面改性聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维的生物安全性评价
目的 评价表面改性聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate,PET)纤维的生物安全性.方法 参照相关国家标准对表面改性PET纤维进行细胞毒性试验,比较改性前后PET纤维的细胞毒性;对该表面改性PET纤维材料的浸提液进行急性毒性试验、溶血试验、热原试验和致敏试验,评价其生物安全性.结果 与阴性对照组相比,改性前PET纤维的细胞毒性为Ⅲ～Ⅳ级(P＜0.05),表面改性PET纤维无细胞毒性(P＞0.05);表面改性PET纤维无全身急性毒性反应,溶血率为0.07%,＜5%(P＜0.05),热原反应符合规定,对豚鼠皮肤无致敏反应.结论 表面改性PET纤维无毒性,生物相容性合格,达到了国家规定的生物安全性标准,为进一步进行人工韧带组织工程的研究提供了依据.
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Rh阴性血型筛查及不规则抗体检测的临床意义
目的 通过Rh阴性血型筛查及不规则抗体的检测,对抗体阳性的Rh阴性患者选择相合的血液输注,并分析其临床意义.方法 采用微柱凝集法对363例RhD阴性输血患者进行抗体筛查及Rh血型鉴定,选择Rh因子相合的血液输注,对有抗-c和抗-e抗体Rh阴性患者在血源紧缺的情况下,选择O型ccdEE和CCdee表型红细胞输注,观察临床输血效果.结果 在363例RhD阴性患者中,不规则抗体阳性21例,其中抗-D抗体5例,抗-E抗体8例,抗-c抗体3例,抗-c、E抗体2例,抗-C抗体2例,抗-e抗体1例,对存在不规则抗体的患者选择Rh因子相合的血液输注,临床效果良好.结论 根据抗体筛查及Rh血型鉴定结果,选择Ph因子相合的血液输注,可避免不规则抗体的产生,提高临床输血的有效性,减少输血不良反应的发生.
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百日咳丝状血凝素单克隆抗体的制备及ELISA定量检测方法的建立
目的 制备百日咳丝状血凝素(Filamentous hemagglutinin,FHA)单克隆抗体,并建立双抗体夹心ELISA法用于检测FHA的含量.方法 采用杂交瘤技术制备FHA单抗,并对其进行鉴定;优化ELISA系统反应条件,建立FHA双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对其进行精密性及准确性验证;应用建立的方法检测本所12批无细胞百日咳疫苗生产中间样品中FHA的含量.结果 获得4株稳定分泌抗FHA单抗的杂交瘤细胞株,抗体亚型分别为IgG1和IgG2b,抗体腹水ELISA效价达1:105～1:106,均能与FHA发生特异性反应,而与百日咳毒素和流感病毒血凝素未发生交叉反应;建立的双抗体夹心ELISA法的线性检测范围在1.56～100.00ng/ml之间,板内和板间变异系数均小于10%;FHA高、中、低浓度的回收率分别为94.73%、108.67%和116.37%;12批无细胞百日咳疫苗生产中间样品中FHA的含量在(-X)±2SD范围内比较稳定.结论 已成功制备了抗FHA单抗,并建立了精密性和准确性均较好的定量检测FHA的双抗体夹心ELISA法,可用于无细胞百日咳疫苗生产中间产品中FHA的定量检测.
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新病毒灭活疫苗研发早期及审评的关注点
我国目前上市的疫苗中,大多数是采用传统工艺,直接利用病原体或病原体的某些组分制备.随着现代科学技术的发展,现代生物技术已开始应用于疫苗的研发,但所占比例仍较小.
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| 2019 | 01 02 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
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| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
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| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 |
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| 2001 | 01 02 03 04 |
| 2000 | 01 02 03 04 |
