TRAIL与导向肽融合基因的克隆、表达及其表达产物的生物学活性

目的获得具有生物学活性的与导向肽融合表达的重组TRAIL蛋白,提高TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用.方法构建TRAIL与导向多肽PEPHC1的融合基因,克隆入质粒pGEM-3zf(-)中进行测序,序列正确后,亚克隆人表达载体pBV220中,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达.结果42℃诱导4 h,融合基因得到了表达,SDS-PAGE表明目的蛋白占菌体总蛋白的15%以上,以包涵体形式存在.经包涵体洗涤、变性、复性,并经离子交换层析柱纯化后可得到融合蛋白PE-TRAIL,经体外试验证明具有生物学活性.结论成功克隆并表达了具有生物学活性的与导向肽融合表达的重组TRAIL蛋白.

人蛋白C转基因小鼠的建立及乳腺表达

目的为了获得乳腺定位表达人蛋白C(hPC)的转基因动物.方法采用分步克隆的方法,构建大鼠乳清酸蛋白(WAP)启动子调控的人蛋白C质粒,命名为pWPC.将该质粒系统鉴定后,用PvuⅠ+SmaⅠ双酶切,回收4.6kb的片段(WAP-hPC-PolyA).通过显微注射技术,将其注入昆明小鼠受精卵雄原核内;共注受精卵810枚,存活640枚,移植给28只假孕母鼠,怀孕的18只母鼠共产仔81只.结果提取鼠尾基因组DNA进行PCR检测,34只阳性,再经Southern blot检测,其中20只整合阳性;将7只整合阳性母鼠传代,产仔7日后收集乳汁,进行ELJSA检测,结果均有表达.结论已成功建立了人蛋白C转基因鼠乳腺生物反应器,为hPC乳腺表达研究奠定了基础.

生物信息学方法筛选华支睾吸虫成虫功能基因--钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白

目的本文通过建立华支睾吸虫成虫cDNA文库,筛选其功能基因.方法应用SMART方法构建华支睾吸虫成虫cDNA文库,进行大量EST测序,然后应用生物信息学方法将EST序列与GenBank中登陆的序列进行同源性比对、序列拼接及基因完整性判断;并应用NCBI上的RPSBLAST对所筛选基因的保守域进行搜索比对,利用PredictProtein分析、预测其功能域及二级结构.结果从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选的钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白(CsCBLP)基因,经同源性分析,CsCBLP与褐家鼠钙调神经磷酸酶(CaN)同源性为53%,与尾刺耐格里原虫CaN B同源性为40%,与新小杆线虫属结合蛋白的同源性为51%;保守域的比对及功能域、二级结构的预测显示所筛选的CsCBLP是钙调神经磷酸酶B亚基的的类似物,属于钙结合蛋白家族.结论应用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因.

狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3区缺失转移表达载体的构建及表达

目的构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞系统中高效表达.方法将含狂犬病毒SRV9株糖蛋白(Rgp)cDNA的pGT载体,经双酶切后回收Rgp基因片段,与经双酶切的真核表达载体pIRES1neo连接,得到pIRES1Rgap,再经双酶切后回收2 623 bp片段,与E3缺失载体pBE3L连接,得到含狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体pBE3LCRgp,再转染MDCK细胞.结果pBE3LCRgp转染的MDCK细胞,经间接ELISA和间接免疫荧光法在其培养上清中均能检出Rgp的高效表达.结论已成功构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞中高效表达.

重组人干扰素βSer17的结构及活性分析

目的分析大肠杆菌表达的重组人干扰素βSer17(rhIFN-Ser17)的分子结构及其生物学活性.方法通过Western blot、氨基酸末端测序、质谱及生物学活性分析等,对大肠杆菌表达的rhIFN-Ser17分子进行鉴定.结果大肠杆菌表达的rhIFN-βser17的N末端20个氨基酸及C端2个氨基酸序列与文献报道一致,产物的相对分子质量为19 877.9,比活性超过2×107 IU/mg蛋白.结论大肠杆菌表达的rhIFN-βSer17分子结构与理论推测值完全一致.

抗人膀胱癌抗独特型抗体诱导特异性迟发过敏反应的研究

目的研究对抗人膀胱癌抗独特型抗体(BC2)诱导的特异性迟发过敏反应(DTH).方法经过BC2免疫的小鼠,用膀胱癌细胞系进行脚掌注射攻击后,测定脚掌水肿厚度判定DTH反应强度,并进行病理学检查.结果BC2诱导的DTH平均水肿厚度为0.95mm,与膀胱癌组织抗原组比较差异无显著意义(P＞0.05);免疫鼠对胃癌细胞攻击呈阴性反应;BC2诱导的病变内可见大量炎性细胞,呈弥漫性浸润.结论BC2具有抗原模拟作用,可诱导特异性的DTH反应,可能成为膀胱癌防治的新途径.

重组人蛋白C在HEK293细胞中的表达与鉴定

目的获得转染人蛋白C cDNA的工程细胞株,实现重组蛋白C的表达.方法将构建好的重组表达载体pIRES-hPC用脂质体介导的方法转染HEK293细胞,经G418加压筛选、细胞有限稀释法等获得克隆细胞株,收集无血清培养上清,浓缩后进行鉴定.结果经G418筛选得到了21株克隆化细胞,SDS-PAGE和Western blot鉴定表明,表达产物含有人蛋白C,且具有抗凝活性.结论在哺乳动物细胞中已成功表达重组人蛋白C,为进一步深入研究及产业化奠定了基础.

人甲状旁腺素N-端34肽基因的合成、克隆和融合表达

目的构建重组人甲状旁腺素N-端34(PTH34)肽的大肠杆菌融合表达菌株,并对其表达产物进行检测.方法选用大肠杆菌偏爱密码子,设计优化的人甲状旁腺素N-端34肽基因序列,通过6个DNA片段分段合成、片段连接、PCR扩增,经TA克隆到pMD18载体中,经测序验证,构建GST融合表达载体.结果经SDS-PAGE检测PTH(1-34)肽与GST蛋白的融合表达,经Western blot分析具有免疫活性,通过GST亲和层析和Xa因子酶切,利用小分子蛋白电泳可检测到PTH(1-34)肽.结论已获得了能表达GST-PTH(1-34)融合蛋白的菌株.表达产物具有免疫活性,且能被Xa因子消化得到PTH(1-34)肽.

重组人白细胞介素-10在大肠杆菌中的表达及生物学活性分析

目的在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10),并检测其生物学活性.方法将IL-10基因重组到质粒pET11c中,转化BL21(DE),提取质粒,经酶切鉴定和测序分析;在25℃用低浓度的IPTG诱导表达,对包涵体IL-10稀释复性;经ELISA检测其含量,MC/9细胞增殖法检测其生物学活性.结果工程菌IL-10/pET11c/BL21诱导表达的目的蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,Western blot鉴定证实为IL-10蛋白,两种形式的IL-10均具有一定的生物学活性.结论已成功地在大肠杆菌中表达了IL-10,为进一步纯化和制备IL-10的基因工程药物打下了基础.

噬菌体展示技术与肽疫苗的设计

近年来,噬菌体肽库的构建及筛选技术得到迅速发展和推广,现已广泛应用于基因定位、分子识别、疫苗设计等相关领域,尤其在非常规疫苗设计方面具有巨大的潜力.该疫苗设计策略是在分子免疫学抗原呈递的机制研究基础上提出的,具有安全、分子小、周期短、特异性高、易于大规模制备等特点,可以代替传统疫苗.本文就噬菌体展示技术用于肽疫苗设计的原理及前景作一综述.

HIV-1疫苗活病毒载体研究进展

HIV-1重组活病毒载体疫苗的研究已经取得了很大进展,显示很好的应用前景,本文就近年来正在研究应用的几种HIV-1疫苗活病毒载体作一综述.

反转录-嵌套式聚合酶链反应检测乙脑病毒

为进一步发展JEV分子诊断技术,本文应用嵌套式RTPCR方法检测人用猪源性生物制品中外源性JEV,现将结果报告如下.

超氧化物歧化酶缓释片的制备及体外释放度检测

目的制备超氧化物歧化酶缓释片,并研究其体外释放.方法采用邻苯三酚自氧化法检测超氧化物歧化酶的释放度,并进行影响因素研究.结果超氧化物歧化酶缓释片体外释放曲线符合一级动力学方程,骨架材料的种类、用量、粒度及压片压力对药物释放有明显影响.结论制备的超氧化物歧化酶缓释片具有明显缓释作用.

采用乙醇分级沉淀制备Cu,Zn-SOD

目的探讨用乙醇分级沉淀制备Cu,Zn-SOD制品的可行性.方法采用热变性、乙醇分级沉淀和超滤的方法,对低纯度的猪血Cu,Zn-SOD制品进一步纯化.结果Cu,Zn-SOD制品比活可达3 600 U/mg蛋白,回收率为78%,纯化倍数为3.0,达到电泳纯,亚基相对分子质量为16 200.结论采用乙醇分级沉淀纯化Cu,Zn-SOD是可行的.

重组人干扰素α2b内毒素检查法的研究

目的研究鲎试剂法与家兔法检测重组人干扰素α2b内毒素结果的相关性,并参照家兔热原试验的阈值量,来确定本制品质量标准中内毒素的限量标准.方法分别用不同浓度的内毒素溶液和含不同浓度内毒素的供试品溶液进行家兔热原质试验,确定供试品内毒素限值,并在此限值下进行内毒素检测,方法均参照2000年版<中国药典>和2000年版<中国生物制品规程>进行.结果在含不同浓度内毒素溶液的家兔热原质试验中,致热阈值小于5.0 EU/ml.在含不同浓度内毒素供试品溶液的家兔热原质试验中,致热阈值小于1.25EU/ml.以此确定本品内毒素限值,检测该制品的内毒素含量,结果均符合规定.结论本品在内毒素含量小于3.5 EU/500万单位/dose的范围内,根据具体的对照实验及制品的用途来规定细菌内毒素限值,可用鲎试剂法代替家兔法检测注射用重组人干扰素α2b冻干制剂的热原质.

猴空泡病毒(SV40)PCR检测方法的建立与初步应用

在应用猴肾细胞制备的脊髓灰质炎减毒活疫苗中有SV40污染的可能.根据T-ag,t-ag和VP1三段基因,设计3对引物LT2:上游2 805～2 822 bp,下游3 946～3 964 bp;ST:上游4 638～4 663 bp,下游5 113～5 137bp;VP1b:上游2 022～2 042 bp,下游2496～2 517bp.通过PCR方法对猴肾脏、肺脏、脾脏及脊髓灰质炎减毒活疫苗进行检测,确定是否存在SV40感染或污染.

泌尿道致病性大肠埃希菌PapG重组蛋白对小鼠尿道上行感染的免疫保护作用

目的探讨泌尿道致病性大肠埃希菌(UPEC)P菌毛粘附素PapG重组融合蛋白对小鼠尿道上行感染的免疫保护作用.方法纯化蛋白按一定程序免疫BALB/c雌性小鼠,末次免疫后第7天用UPEC临床分离株进行尿道上行攻击;攻击后第5天检测尿液和肾脏培养菌,同时测定血清抗体效价.结果经GST-PapG重组蛋白和GST纯化蛋白免疫的小鼠体内均产生了相应的抗体,而仅经重组蛋白免疫的小鼠具有一定的抵抗毒株上行感染的能力,表现为肾脏培养菌量均明显减少.结论 PapG粘附素与GST构成的重组融合蛋白对小鼠尿道上行感染具有一定的免疫保护作用.

白细胞介素-2基因佐剂对乙型肝炎疫苗免疫效果的影响

目的研究白细胞介素-2基因佐剂对乙型肝炎疫苗免疫效果的影响.方法利用分子生物学技术构建含IL-2基因的重组质粒pcDNA3.1/IL-2,经测序鉴定、碱裂解法大量提取及Sepharose 4FF柱层析纯化,得到重组质粒pcDNA3.1/IL-2和pcDNA3.1/S,免疫豚鼠后,经ELISA检测豚鼠血清中抗HBsAg滴度,CTLL-2细胞株/MTT法检测IL-2活性.结果序列测定和分析结果表明重组质粒pcDNA3.1/IL-2构建正确.血清中抗HBsAg抗体滴度:铝佐剂+HBsAg组为2 116 mIU;IL-2+HBsAg组为1 987 mIU;质粒pcDNA3.1/IL-2+HBsAg组为2 252 mIU;质粒pcDNA3.1+IL-2+pcDNA3.1/S组为67.19 mIU;质粒pcDNA3.1/S组为50.88 mIU.重组质粒pcDNA3.1/IL-2免疫1周后,IL-2表达水平达高峰,以后逐渐降低,但1个月后IL-2水平仍高于空白对照组.对抗HBsAg抗体滴度和IL-2活性的检测结果进行统计学分析表明,各组间差异有显著意义(P＜0.05).结论 IL-2基因佐剂可以增强乙肝重组疫苗和乙肝DNA疫苗的免疫效果.

小鼠接种重组乙型肝炎疫苗引起的细胞因子释放反应

目的观察小鼠接种重组乙型肝炎疫苗(rHB)后,脾T淋巴细胞释放细胞因子的免疫反应.方法80只BALB/c小鼠随机分为4组,1组小鼠接种5 μg佐剂,2、3、4组小鼠分别腹腔接种0.65、1.25和5.0μg的rHB,其中一半小鼠2周后加强免疫1次.分别在初次免疫后4周和加强免疫后2周,分离小鼠脾T淋巴细胞,体外用rHB刺激,检测释放IL-2及IFN-γ的水平.结果单次免疫后和加强免疫后各组IL-2和IFN-γ均显著升高,且有随剂量增加而升高的趋势.结论小鼠接种rHB后,脾T淋巴细胞分泌IL-2及IFN-γ显著增加,并与接种剂量密切相关.

聚乙二醇交联的透明质酸衍生物的细胞毒性

目的利用聚乙二醇(PEG)作为交联剂制备透明质酸(HA)衍生物,并检测其细胞毒性,从而探讨其应用于临床医学的可行性.方法将PEG-HA衍生物配制成1 mg/ml的生理盐水溶液作为供试液,在培养瓶中加入含有50%供试液的细胞培养液,分别在培养2、4和7 d时检测细胞毒性,并利用SPSS10.0统计软件包分析细胞的相对增殖度.结果PEG-HA衍生物作为细胞培养液成分之一,使细胞在培养过程中生长形态正常,贴壁情况良好,L-929细胞呈梭型,细胞相对增殖度为95.49%,细胞毒性为1级,评定为合格.结论PEG-HA衍生物对人体无毒副作用,可应用于临床医学.

利用HCV多表位复合抗原制备高效价抗体

目的利用HCV多表位复合抗原免疫家兔制备高效价抗HCV多克隆抗体,为改进丙型肝炎病毒抗原的诊断试剂盒提供必要条件.方法HCV多表位复合抗原与完全弗氏佐剂混合免疫家兔,获得高效价抗血清,经硫酸铵沉淀及PrintA/G亲和层析纯化.结果已获得效价大于1:16 000的抗HCV多克隆抗血清,经纯化后达电泳纯.该抗体能与HCV NS3、NS5及C抗原特异性结合.结论HCV多表位复合抗原具有较好的免疫原性,可用于改进HCV病毒抗原诊断试剂.

干扰素脂质体的药代动力学和生物利用度

目的研究干扰素α2b脂质体药代动力学和生物利用度.方法采用旋转逆相蒸发法制备干扰素α2b脂质体.将小鼠分成2组,分别尾静脉注射干扰素α2b脂质体(L-IFN)和干扰素α2b(IFN),给药后分8个时间点采血,并取肝脏组织检测干扰素α2b含量.计算药代动力学参数和生物利用度.结果L-IFN组小鼠血液及肝脏组织中干扰素α2b消除速度低于IFN组,血中相对生物利用度为237.47%,肝脏中相对生物利用度为191.73%.结论干扰素α2b脂质体可明显提高小鼠的吸收和利用.

LHRH-PE40对宫颈癌细胞株细胞周期及Ki-67、Bcl-2的影响

目的观察LHRH-PE40对宫颈癌Hela细胞系凋亡及增殖的影响,为其临床应用提供理论依据.方法采用人宫颈癌Hela细胞株进行培养,在培养液中分别加入不同浓度的LHRH-PE40,作用48h后,观察Hela细胞形态的变化,并通过结晶紫染色法检测宫颈癌Hela细胞株对LHRH-PE40的感受性;用流式细胞仪及免疫组化法检测LHRH-PE40对Hela细胞周期、Ki-67及Bcl-2的影响.结果LHRH-PE40对Hela细胞活性的抑制作用呈剂量依赖性,通过量效曲线可以看出,LHRH-PE40的小有效剂量为0.625 μg/ml;半数致死剂量为0.969 μg/ml.在1.0μg/ml浓度下,癌细胞中的Ki-67阳性细胞(用药前80%,用药后42%)及Bcl-2阳性细胞(用药前66%,用药后43%)比率均下降,凋亡细胞比率增加(由0增加到3.7%).在1.0 μg/ml浓度下,细胞的G0/G1期细胞比率增加15.21%;S期细胞变化不大,而G2/M期减少38.28%.结论LHRH-PE40可以有效地抑制宫颈癌细胞的增殖,诱发肿瘤细胞凋亡,是一种很有应用前景的抗肿瘤药物.

重组人14-3-3 zeta亚型单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的制备重组人14-3-3 zeta亚型单克隆抗体(McAb),并检测14-3-3蛋白在人体组织器官的分布.方法将筛选出分泌抗人14-3-3 zeta的杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔,制备腹水McAb,用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化,并鉴定其效价、纯度、浓度、特异性以及与天然抗原的亲和力,再用此单抗检测14-3-3蛋白在人体组织器官的分布.结果腹水及纯化后的单克隆抗体的效价分别为1:107和1:106.纯化后的纯度达97%,浓度为5 mg/ml,能识别天然的人14-3-3蛋白,并能有效地识别兔和鼠脑组织的14-3-3蛋白.在人脑、肾、肺、肝、胃、卵巢、乳腺、结肠、胰腺等组织器官中,均检出14-3-3蛋白.结论已成功制备出重组人14-3-3 zeta亚型单克隆抗体,并应用于实际检测,为研究14-3-3蛋白在机体生理和病理情况下的作用机制奠定了基础.

不同层析方法纯化重组人干扰素α2a的效果比较

目的提高干扰素的纯度,降低热原,提高质量.方法应用4种不同层析方法,对同一批同一数量重组干扰素α2a粗提样品提纯,并对提纯后的纯度、收率及热原进行比较,以建立一种高纯度、高收率、低热原的提纯方法.结果采用阴离子交换层析-阳离子交换层析-凝胶过滤的提纯方法收率高,纯度好,热原低,易于放大,是较为理想的纯化方法.结论已建立了比较理想的提纯方法.

深圳市福田区健康人群风疹抗体水平及疫苗免疫效果观察

目的了解福田区健康人群风疹抗体水平和风疹疫苗(RM)的免疫效果.方法对部分健康人群及接种风疹疫苗的婴儿采用ELISA检测风疹IgG抗体.结果433人中抗体阳性328人,阳性率75.8%,几何平均滴度(GMT)1:40.1.以2～20岁抗体阳性率高(88.5%～95.5%).接种风疹疫苗的1岁儿童56人,免疫成功率为94.6%.结论风疹疫苗具有良好的免疫效果.

我国自行研制的冻干水痘减毒活疫苗的临床效果评价

目的考核和评价我国自行分离毒株研制的冻干水痘减毒活疫苗的安全性和免疫原性.方法采用随机、双盲、对照的原则进行设计,在2～6岁健康人群中进行开放式临床观察.结果试验疫苗共接种易感儿童738人,接种后的总体中/强发热反应率为5.96%(44/738),皮疹/水痘样皮疹发生率为0.68%(5/738);易感者接种39810PFU、2000PFU以及500PFU病毒量的疫苗后,抗体GMT分别为36.4、34.3和18.6;抗体阳转率分别为100%、98.77%和85.42%.结论我国自行研制的水痘疫苗具有较好的安全性和免疫原性.

《免疫接种的反应和处理》征订启事

《免疫接种不良反应300例》征订启事