肿瘤抑制基因WWOX真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的 构建肿瘤抑制基因WWOX的真核表达载体,并观察其在人肺腺癌细胞A549中的表达.方法 采用RT-PCR法,从正常人胚肾细胞HEK-293中钓取WWOX基因,将其克隆至pMD18-T载体上,测序后定向连接到真核表达载体pEGFP-C1中,构建真核表达载体pEGFP-C1-WWOX,并用脂质体转染至A549细胞中,采用共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)与WWOX的融合蛋白在A549细胞中的表达.结果 测序结果显示,RT-PCR法获得的WWOX全编码序列与GenBank中报道的序列一致.真核表达载体pEGFP-C1-WWOX转染A549细胞48 h后,共聚焦显微镜观察到细胞中有绿色荧光呈现,RT-PCR观察到WWOX基因得到有效转录.结论 已成功构建了肿瘤抑制基因WWOX真核表达载体pEGFP-C1-WWOX,并在A549细胞中表达了WWOX和GFP融合蛋白.

红色毛癣菌孢子中预存储mRNA的功能

目的 分析红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)孢子中预存储mRNA的功能.方法 通过分析560个孢子中预存储基因与NR和GO数据库中其他线性真菌基因的同源性,对这些基因的功能以及可能参与的生理过程进行探讨.结果 在孢子中的560个基因中,有177个与烟曲霉、构巢曲霉、粗糙链孢菌和红色毛癣菌4类线性真菌基因有同源性,并发现一些可能参与孢子萌发的重要基因及相关的调控途径.结论 为进一步研究红色毛癣菌孢子中预存储基因的作用以及孢子萌发的机理提供了依据.

糖尿病大鼠脑缺血再灌注海马CAl区Fas蛋白的表达

目的 观察糖尿病大鼠脑缺血再灌注海马CA1区病理变化及Fas蛋白的表达.方法 采用链脲佐菌素(STZ)诱导和线栓法建立糖尿病大鼠大脑中动脉闭塞模型,应用HE染色和免疫组化方法,比较糖尿病大鼠脑缺血再灌注组与缺血再灌注组海马CA1区神经元损伤程度及Fas蛋白表达变化.结果 糖尿病大鼠脑缺血再灌注组海马CA1区神经元缺失,且Fas蛋白表达上调,明显高于缺血再灌注组.结论 糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤后,海马CA1区神经元发生严重缺失,Fas介导的细胞凋亡机制可能是糖尿病加重脑缺血再灌注海马区神经元损伤的机制之一.

人乳头瘤病毒结构蛋白L1与白色念珠菌甘露糖蛋白CTL表位嵌合基因在昆虫细胞中的表达

目的 构建携带人乳头瘤病毒(HPV)结构蛋白L1和白色念珠菌甘露糖蛋白(CaMp65)细胞毒性T细胞表位(CTL)基因的重组质粒,并在杆状病毒-昆虫细胞系统中进行表达.方法 分别设计包含HPV6b L1和CaMp65 CTL145-153的引物,经PCR扩增嵌合基因HPV6b L1/CaMp65 CTL145-153,并进一步将其插入杆状病毒表达载体pFastBacTM1.在E.coli DH1OBac中组装成重组杆状病毒,在昆虫细胞sf-9中表达嵌合蛋白,并经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定.结果 HPV6b L1/CaMp65 CTL145-153嵌合蛋白在昆虫细胞sf-9中得到了表达,表达产物的相对分子质量为56 000,与HPV6b L1单抗能产生特异性反应.结论 HPV6b L1/CaMp65 CTL1145-153嵌合蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中得到了成功表达,为防治HPV和白色念珠菌感染的基因工程疫苗的研究奠定了基础.

孕妇IgG类红细胞血型不规则抗体对早期诊断Non-ABO-HDN的意义

目的 探讨孕妇IgG类红细胞血型不规则抗体对早期诊断Non-ABO-HDN的意义.方法 筛查4 200份孕妇血清中红细胞血型不规则抗体,阳性者检测抗体特异性、免疫球蛋白类型及效价;对检测出IgG类不规则抗体者,分娩时取脐血(或新生儿血)检测血清(浆)游离抗体,并进行红细胞直接抗球蛋白试验和红细胞放散试验,以诊断其是否发生HDN.结果 4 200份孕妇血清中检出红细胞血型不规则抗体44份(阳性率为1.05%),其中20份孕妇血清的抗体为IgG类或IgG及IgM混合抗体,脐血(或新生儿血)检测结果,10名婴儿发生了Non-ABO-HDN,1名发生了宫内死胎.致病的抗体特异性分布为:抗-D 2例、抗-c 1例、抗-E 2例、抗-cE 1例、抗-M 4例(其中1例并有抗-A).结论 孕妇体内IgG类的Rh血型系统的抗体及抗-M易引起non-ABO-HDN,检测孕妇IgG类红细胞血型不规则抗体对早期诊断Non-ABO-HDN、鉴别引发HDN的抗体型别、评估HDN的严重程度及制定治疗方案均具有重要意义.

4对猴空泡病毒40核酸检测引物的生物信息学分析

目的 从引物设计的合理性、扩增片段的保守性、检出目的 片段的敏感性等方面比较4对猴空泡病毒40(SV40)核酸检测引物之间的差异,为寻找保守性好、稳定高效的SV40核酸序列检测法提供理论基础.方法 以目前已知的23个不同SV40毒株完全基因组为基础数据,用DNAMAN 6.0.40软件对4对引物及其扩增片段的保守性进行分析;用clust-alX1.83软件对23个SV40基因组序列进行多重序列对齐分析;用Tree View 1.6.6软件构建系统进化树;用Oligo 6.71软件对4对引物的特性进行分析.结果 对于接受号为DQ218418病毒株而言,4对引物的序列均不保守;对于接受号为J02400、NC_001669、AF316139和AF316141的4个病毒株而言,引物对GCVp1和GCT的序列是保守的;对于除了DQ218418之外的病毒株而言,引物对VP1的序列是保守的;对于除了DQ218418、AF180737之外的病毒株而言,引物对T的序列是保守的.结论 目前通用的SV40核酸检测引物针对的SV40病毒株只有4个,本室合成的检测引物针对的病毒株有21个;本室设计的SV40检测引物和通用引物相比具有保守性好、适用性广、参数理想等优点;对于某些高度变异的毒株,应单独进行引物设计.

融合结构域MM蛋白在杆状病毒中的表达和细胞定位

目的 将C-Myb的DNA结合域与MEF的AML1结合区组合成的MM融合基因在杆状病毒中进行表达和细胞定位.方法 将氨基酸融合有绿色荧光蛋白的MM基因插入到杆状病毒转移载体中,通过重组质粒和亲本病毒AcPak6共转染昆虫Tn5细胞,获得重组病毒AcNPV-GFP-MM,并对该重组病毒在Tn5细胞中进行表达和定位观察.结果 通过荧光显微镜观察,在病毒感染48 h后的Tn5细胞中,可见表达产物大量集聚在细胞核内,Western blot证明表达的融合蛋白在相对分子质量约60 000处出现特异条带,与预计的蛋白理论值相符.结论 由杆状病毒表达系统表达的MM蛋白比较稳定,能正确地趋向于核内.可以通过这种表达方式获得大量产物.

益生菌的研究进展

益生菌对人体有多种保健作用,本文就益生菌定义演变、菌株选择标准、研究方法、常用菌株、存在问题及前景进行了综述.

酶立体选择性的定向进化策略

酶立体选择性定向进化的基本方法是用合适的分子生物学手段使酶基因发生随机突变,然后进行基因表达和高通量筛选.本文主要对引入突变技术和高通量筛选方法做一简要综述.

猪链球菌2型的分离与鉴定

目的 对从四川省某猪场分离到的5株细菌进行系统鉴定.方法 观察菌体的形态、培养特性、动物致病性和生化反应,并采用PCR法鉴定其血清型和毒力因子.结果 5株细菌均为猪链球菌2型,均有毒力因子MRP和EF,其中S1株、S2株和S5株对BALB/c小鼠有致病性,另2株无致病性.结论 该猪场的疫情是由猪链球菌2型引起的.本研究为进一步预防和控制猪链球菌2型的流行提供了依据.

Real-time PCR检测核酸疫苗中宿主基因组残留DNA

目的 建立Real-time PCR方法,用于定量检测核酸疫苗中宿主基因组的残留DNA.方法 以Lightcycler平台为基础,选择大肠杆菌23S核糖体RNA基因为靶标基因设计扩增引物,建立基于SYBR Green I荧光染料的Real-time PCR 检测方法,并用于核酸疫苗纯化过程中间产物的检测.结果 整个检测过程可在30 min内完成,特异性强,检测灵敏度可达10 fg/μl,其标准曲线的相关系数为-0.99.结论 该方法可用于核酸疫苗中宿主基因组残留DNA的检测.

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化

目的 优化HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达条件.方法 通过改变重组质粒的宿主菌、培养基、诱导温度、诱导剂、诱导剂浓度、诱导时间等条件,利用SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件,分析以上条件改变对表达产物表达量的影响.将重组质粒连续传100代,检测融合蛋白的表达稳定性.结果 重组质粒在大肠杆菌BL21菌株、GS培养基、28℃、0.5 mmol/L IFFG或1.5 mmol/L乳糖诱导4 h时,目的 蛋白的表达量高,占菌体总蛋白的43.5%.重组质粒传代100代,融合蛋白的表达稳定.结论 已确定出了融合蛋白在大肠杆菌中表达的佳条件.

重组日本血吸虫14-3-3蛋白的纯化和鉴定

目的 观察两次切胶、两次电洗脱的方法纯化重组日本血吸虫14-3-3(sj 14-3-3)蛋白的效果.方法 采用两次切胶、两次电洗脱的方法(与经典的切胶、电洗脱有所不同),纯化Sj 14-3-3蛋白,并与柱层析纯化方法进行比较.结果 采用两次切胶、两次电洗脱方法纯化的目的 蛋白条带单一,浓度达3 mg/ml,而柱层析法纯化的蛋白浓度仅为1 mg/ml.Westernblot证实纯化目的 蛋白的特异性.结论 两次切胶、两次电洗脱法可获得高纯度、高特异性的目的 蛋白,不失为一种经济有效的蛋白纯化方法.

基因治疗用质粒DNA的制备工艺

目的 探索基因治疗用质粒DNA的制备工艺.方法 以CaCl2沉淀法去除大分子RNA,Q-Sepharose和SOURCE两步离子交换层析法去除染色体DNA、小分子RNA、蛋白质等杂质,并对各步骤样品进行检测.结果 质粒pIRVP3HNIL18终产品的产量为1.638 mg质粒DNA/g细菌,纯度为1.839,相对回收率为12.55%,蛋白质含量为0.002 8 mg/ml,未检测到RNA和染色体DNA.结论 此工艺可有效去除质粒DNA制备过程中产生的杂质,可应用于药剂水平质粒DNA的制备.

接种无细胞百白破疫苗致全身抽搐反应2例

本中心预防接种门诊从2003年开始,推广使用吸附无细胞百白破联合疫苗(APDT),至2006年底,共计接种4 375人份.通过使用该疫苗4年来的观察发现,接种APDT引起的发热、局部红肿、硬结等反应的发生率均较接种全细胞百白破联合疫苗明显减少,但期间相继出现过2例全身抽搐反府.

重组鸡痘病毒对豚鼠的生物安全性

目的 检测重组鸡痘病毒在妊娠豚鼠及其子代豚鼠体内的安全性.方法 重组鸡痘病毒以正常剂量和超大剂量同时免疫妊娠豚鼠和子代豚鼠,通过临床观察、病理组织学、PCR等方法,检测重组鸡痘病毒对妊娠豚鼠的毒性和子代豚鼠生长的影响以及子代豚鼠的病毒DNA残留.结果 临床观察和病理组织学检测表明在整个实验期间,免疫重组鸡痘病毒的妊娠豚鼠精神状态、饮水、采食等临床表现一切正常,未表现出临床症状和不良反应,未造成早产、流产、死胎、弱胎;用正常和超大剂量免疫重组鸡痘病毒的子代豚鼠均未出现任何临床症状,内脏器官未见明显的病理变化,且未检测到病毒DNA.结论 构建的重组鸡痘病毒生物安全性好,对妊娠豚鼠和子代豚鼠无安全威胁.

多表位DNA壳聚糖微球疫苗的体液免疫应答

目的 研究多表位DNA壳聚糖微球疫苗的体液免疫应答.方法 制备多表位DNA壳聚糖微球疫苗pcD-NA3.1-HME-3C3d,经鼻腔免疫小鼠,蛋白检测微孔试剂盒检测小鼠特异性IgG抗体水平.结果 经免疫的小鼠均能产生针对各表位的特异性IgG抗体,DNA壳聚糖微球疫苗的抗体水平明显高于DNA疫苗.结论 壳聚糖微球疫苗投递系统可提高多表位DNA疫苗的免疫应答效果.

编码SARS-CoV S1和S2蛋白的DNA疫苗对小鼠的免疫应答

目的 构建编码SARS-CoV S蛋白亚单位S1和S2的核酸疫苗,并检测其对小鼠的免疫应答.方法 依据GenBank中SARS-CoV基因组序列,人工合成SARS-CoV S1和S2亚单位基因,分别与CTL表位基因重组后,克隆至表达载体pIRESlneo中,构建DNA疫苗pIRCTL-S1和pIRCTL-S2.将构建的DNA疫苗转染BHK-21细胞,采用间接免疫荧光试验检测其在真核细胞中的表达.免疫小鼠后,用流式细胞仪测定CD4+、CD8+T淋巴细胞亚类数,用ELISA试剂盒检测免疫小鼠血清中抗SARS-CoV抗体水平.结果 所构建的DNA疫苗pIRCTL-S1和pIRCTL-S2转染BHK-21细胞后,均能表达抗原蛋白,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖,并诱导产生抗SAILS-CoV特异性抗体.结论 所构建的两种DNA疫苗在小鼠体内均产生了体液和细胞免疫应答,为SARS核酸疫苗的研制奠定了基础.

乙型脑炎减毒活疫苗病毒SA14-14-2株经三带喙库蚊胸腔接种后的生物学和分子生物学特性

目的 研究乙型脑炎病毒减毒活疫苗SA14-14-2株经三带喙库蚊胸腔接种繁殖后的生物学和分子生物学特性,进一步评价该株病毒的稳定性和安全性.方法 将乙型脑炎病毒减毒活疫苗SA4-14-2株胸腔接种的三带喙库蚊研磨,离心收集上清液,接种于BHK21细胞中培养,得到SA14-14-2 MIC1病毒液.应用空斑形成单位法测定病毒滴度,再进行小鼠脑内毒力测定和乳鼠脑内回传后毒力返祖试验.提取病毒RNA,RT-PCR扩增E基因片段,测序后与SA14-14-2原株的E基因序列进行比较分析.结果 SA14-14-2 M1C1病毒液滴度达1.4×107 PFU/ml,小鼠脑内毒力测定结果无小鼠发病死亡,乳鼠脑内传代对小鼠的脑内致病力很低,毒力为1.9 LgLD50/0.03ml,小于《中国药典》规定的3.0 LgLD50,且皮下注射未见小鼠发病死亡.扩增出的E基因片段序列与原株相比较,只有E区1 340位一个核苷酸的变化A→G,导致E447位1个氨基酸的改变D(Asp)→G(Gly),此差异位点不是SA14-14-2株发生基因变异的8个位点之一.结论 SA14-14-2疫苗株病毒经三带喙库蚊胸腔接种繁殖后,其生物学(弱毒)特性和基因特征(E区8个氨基酸突变)未发生改变,进一步证实了该病毒的稳定性.

AoGDW肽抑制血小板聚集的活性及特异性

目的 研究精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)肽衍生物--ω-氨基辛酸甘氨酸天门冬氨酸-色氨酸(AoG-DW)抗血小板聚集的活性及特异性.方法 采用比浊法测定AoGDW肽抑制人血小板聚集的活性,体外细胞脱黏附试验及MTF法检测AoGDW对人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)的脱黏附作用.结果 AoGDW和RGDS抑制人血小板聚集的IC50分别为(4.71±2.51)μmol/L和(61.82±8.08)μmol/L,AoGDW使HUVEC产生脱黏附的IC50为(16.50±0.68)mmol/L.结论 AoGDW具有高活性的抗血小板聚集作用,并保留了其特异性,有可能避免或减少毒副作用的发生.对于抗血小板药物的临床应用将具有重要的现实意义.

针刺分离术联合重组人α2b干扰素球结膜下注射治疗包裹性囊状滤过泡的疗效

目的 观察针刺分离术联合滤过泡旁注射α2b干扰素治疗小梁切除术后包裹性囊状滤过泡的疗效.方法 对12名小梁切除术后并发包裹性囊状滤过泡的患者行针刺分离术,术后滤过泡旁注射α2b干扰素.随访观察眼压和滤过泡形态.结果 治疗前平均眼压为(27.67±2.96)mmHg,治疗后为(15.25±3.02)mmHg,治疗前后眼压比较,差异有显著意义.治疗后I型滤过泡3眼,Ⅱ型滤过泡8眼,Ⅲ型滤过泡1眼.结论 针刺分离术联合干扰素可以治疗早期治疗失败的滤过泡,增加滤过手术的成功率,值得临床上推广应用.

吉林省微生物学会第六次全省会员代表大会暨吉林省第二届青年科学家论坛(微生物专场)会议纪要

抗蛇毒血清、抗狂犬病病毒血清国际会议纪要

2007年1月,WHO在瑞士日内瓦专门召开了抗蛇毒血清、抗狂犬病病毒血清国际会议.本次会议规格较高,不仅有多个国家、厂家、研究机构代表参加,而且WHO多个部门主任也参加了会议.