凋亡抑制因子survivin在喉鳞癌中表达及其临床意义

目的探讨凋亡抑制因子survivin在喉鳞癌中的表达及临床意义.方法应用免疫组化SABC方法检测54例喉鳞癌手术切除标本石蜡切片组织中survivin的表达,并以10例声带息肉组织为对照.结果 survivin在声带息肉中不表达;在54例喉鳞癌中,38例(70.4%)表达阳性;survivin阳性表达率与喉癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、临床分型无相关性(P＞0.05),与喉癌临床分期、组织学分级、淋巴结转移呈正相关(P＜0.05).结论凋亡抑制因子survivin的异常表达所引起的凋亡抑制与喉鳞癌的发生发展相关,可作为肿瘤诊断、预后和治疗的一个新指标.

从半合成噬菌体抗体库筛选抗狂犬病毒人单链抗体

目的应用纯化的狂犬病毒抗原从半合成噬菌体抗体库中筛选针对狂犬病毒的人单链抗体(ScFv).方法用固相化的狂犬病毒抗原对半合成抗体库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选,从第3轮洗脱下来的克隆中获得一株有可溶性表达且特异性结合狂犬病毒抗原的ScFv,并进行基因序列测定.结果所获氨基酸序列经blast数据库搜索,与一种抗狂犬病毒免疫球蛋白的氨基酸序列同源性高(82%).经检索kabat数据库,发现其轻、重链可变区分别属于VkⅠ型、VHⅢ型.结论从噬菌体抗体库可以方便快捷地分离到针对狂犬病毒的单链抗体,对狂犬病毒的预防具有重要意义.

成年SPF鸡胃肠道中芽胞杆菌的分离与部分生物学特性鉴定

目的鉴定从SPF鸡分离出的芽胞杆菌的生物学特性.方法从成年SPF鸡胃肠道的不同部位选择性分离13株芽胞杆菌,并进行生物学特性检测.结果 (1)所有菌株均能在含5%、10%和15%NaCl的LB平板上生长,其中11株能在含6%NaCl的LB平板上生长,7株能在含7%NaCl的LB平板上生长.(2)2株能在pH 4.0的LB平板上生长,8株菌能在pH 5.0生长;所有菌株均能在pH 6.0～10生长,其中12株能在pH 11生长,11株能在pH 12生长,而不能在pH 13～14生长.(3)所有菌株在75℃水浴中均能活存2～5 h;11株能活存10 h,9株能活存27 h.所有菌株在100℃水浴中加温,均能活存0.5～2 h,其中11株能活存长达3 h.(4)所有菌株在pH 4.0和pH 11.0的LB培养基中均能存活半年以上,在pH 2.0和13.0环境中能存活1周和3周以上.(5)菌体以沸石粉做载体常温保存,1年之内含量基本不变.(6)所有菌株均具有蜡样芽胞杆菌的特性.(7)所有菌株对链霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素、庆大霉素、红霉素均敏感,对青霉素、土霉素和黄胺药均有抗性.结论所有菌株均有望成为制备微生态制剂的候选菌株.

前带现象导致Rh抗-D菠萝酶试验阴性反应一例

目的通过对输血反应病例的分析,探讨如何防止免疫性输血反应的发生.方法对输血反应患者输血前后血标本进行血型血清学检测.结果患者输血前抗体处在低水平,输血后经相应抗原再刺激,抗体水平迅速提升.高浓度抗-D抗体在菠萝酶法中出现前带现象,而在抗球蛋白法和聚凝胺法中不表现.结论为确保输血安全,输血前检查应严格按卫生部2000年制定的<临床输血技术规范>进行操作.

凋亡相关蛋白Apr-2的融合表达及多克隆抗体的制备

目的融合表达凋亡相关蛋白Apr-2,并用该融合蛋白制备多克隆抗体.方法将凋亡相关蛋白Apr-2克隆入PGEX-4T-2原核表达载体,转化大肠杆菌,IPTG诱导重组蛋白GST-Apr-2表达,用该融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,经ELISA及Western blot检测.结果融合表达蛋白GST-Apr-2主要以包涵体的形式存在,表达的融合蛋白占菌体总蛋白质的40%以上.抗体效价为1∶5 000.结论已成功地进行Apr-2的融合表达,并获得了该蛋白的多克隆抗体.

转换酶抑制剂和长效钙拮抗剂对动脉硬化相关因子TNF、IL-6的影响

目的探讨卡托普利和氨氯地平对动脉粥样硬化相关因子TNF、IL-6的影响.方法动态观察各模型组动物血浆中TNF、IL-6水平.结果卡托普利、硒维尔+VE和氨氯地平均对TNF和IL-6有抑制作用,但对TNF卡托普利作用较强.结论两种药皆可抑制动脉粥样硬化的发生发展,但在动脉斑块的稳定方面转换酶抑制作用较强.

两种甲型肝炎病毒培养法和病毒滴定法的比较

目的比较不同细胞培养方法和不同滴定方法的甲型肝炎病毒的滴度.方法采用小方瓶细胞培养法和24孔板培养法培养单层细胞,待细胞病毒培养至高峰期,用胰酶消化收集细胞病毒,再用细胞裂解液裂解细胞释放病毒,用ELISA法和间接免疫荧光法检测病毒滴度.结果用两种检测方法检测同一样品,结果差异无显著意义.用两种细胞培养方法,用相同检测方法,结果差异亦无显著意义.结论两种细胞培养方法及两种检测方法检测的病毒滴度差异无显著意义,但应用ELISA法,操作简便,结果准确.

甲型肝炎病毒恒河猴模型的评估

目的对国产恒河猴作为甲型肝炎病毒(HAV)的动物模型做出全面评估.方法用HAV野型株和H2株减毒HAV感染恒河猴,检测分析猴体的各种反应.结果 14只恒河猴经4株野型病毒感染后,全部血清抗体阳转,效价为1∶2～1∶1 280,13只猴(92.9%)的血清酶异常升高和粪便排毒,2只猴(14.3%)有肝脏组织病理学极轻度改变;352只恒河猴分组接种68批H2株及其子代病毒后,血清抗体阳转率为99.7%,血清酶异常升高率为2.8%,粪便排毒率为58.3%(14/24),无肝脏组织病理学变化.结论国产恒河猴是HAV的敏感动物,其ALT等血清酶指标能有效反映HAV的强毒或弱毒性质,可作为实验动物用于监测甲肝减毒活疫苗株的残余毒力.

豚鼠致死性球虫性肠炎病理学观察

目的了解豚鼠致死性艾美尔球虫性肠炎的病理形态学特征.方法剖检卡介苗安全试验中发病及死亡豚鼠11只,并进行肠内容物细菌分离鉴定、寄生虫形态学检查以及病理组织学观察.结果主要病变在盲肠和结肠,尤以结肠为重.表现肠壁增厚、肠粘膜上皮与腺上皮细胞广泛地被不同发育阶段的球虫侵害,致使上皮变性、肿胀、坏死或脱落,形成表浅溃疡,肠粘膜和固有层均有程度不等的水肿、充血和为数不多的炎性细胞浸润.粘膜下层、肌层和浆膜均未见发育期球虫寄生,也未见炎症反应.胃和小肠的粘膜,部分动物有轻度炎症反应.其它脏器如肝、肾、心可见变性等病理改变.结论豚鼠艾美尔球虫偶尔也会引起严重的致死性感染.盲肠和结肠粘膜广泛病损及其粘膜上皮和腺上皮细胞内有发育期球虫寄生具有特征性,可作为豚鼠球虫性肠炎的病理诊断依据.

核素治疗骨转移瘤患者免疫学指标与预后的关系

目的研究放射性核素89SrCl2治疗骨转移瘤前后机体免疫功能变化及免疫学指标与预后关系.方法选择经89SrCl2治疗的患者17例及正常对照20例.分别检测治疗组治疗前、后及正常对照组CD+4、CD+8、CD+4/CD+8、TNF-α和IL-2值,并对死亡患者与存活患者各项指标进行比较.结果正常对照组与治疗组治疗前后各项指标差异均有显著意义(P＜0.05).死亡患者与存活患者之间各项指标差异均有显著意义(P＜0.05).结论通过对CD+4、CD+8、CD+4/CD+8、TNF-α及IL-2水平监测,为进一步选择治疗药物和治疗时机提供良好的指标.

鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的以鸡脾细胞mRNA为模板扩增编码鸡IL-18成熟蛋白的cDNA,并在大肠杆菌中进行表达.方法用PHA和LPS激活的AA肉鸡脾细胞,提取mRNA,以RT-PCR法扩增出编码鸡IL-18成熟蛋白的cDNA并测序,与pET-28b载体构建重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达,用SDS-PAGE检测表达产物.结果所克隆的核苷酸片段包含了鸡IL-18全部成熟蛋白编码基因,其大小为507个核苷酸,编码169个氨基酸;构建的重组表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达出相对分子质量为19 000的重组蛋白.结论已成功克隆和表达了鸡IL-18成熟蛋白基因.

绿色荧光蛋白融合表达HBsAg基因载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建绿色荧光蛋白融合表达HBsAg基因的载体,并检测其在COS-7细胞中的表达.方法采用PCR获得HBsAg基因;利用该基因片段和质粒pEGFP 3.1的HindⅢ/ KpnⅠ限制性酶切位点构建融合表达载体pGHBs 3.1;通过脂质体介导的方法将该载体转染到COS-7细胞中,用PCR法检测基因转染,ELISA检测HBsAg的瞬时表达,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达.结果融合表达载体pGHBs 3.1转染COS-7细胞后,在细胞中检测到HBsAg基因片段,转染细胞培养上清中检测到HBsAg表达,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达.结论表达载体pGHBs 3.1在COS-7细胞中获得了表达,表达的融合蛋白具有HBsAg和绿色荧光蛋白的双重活性,该载体可用绿色荧光蛋白作为报告基因观察HBsAg的表达及定位.

重组人白细胞介素-10融合表达载体的构建及其在BL21(DE3)pLysE细菌细胞中的表达

目的构建重组人白细胞介素10(recombinant human interleukin 10,rhIL-10)融合蛋白的表达载体,并在大肠杆菌中表达.方法应用RT-PCR方法扩增IL-10基因,克隆PCR产物,构建PCR(R)T7/NT-TOPO(R)-IL-10重组质粒,以Appied Biosystems 3 700 DNA分析仪进行分析.构建成功的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysE细胞,经12%SDS-PAGE鉴定融合表达蛋白.结果 PCR(R)T7/NT-TOPO(R)质粒已载入rhIL-10基因,其序列与理论设计完全一致,表达质粒在BL21(DE3)pLysE中得到高效表达,产物主要以包涵体形式存在.结论已成功构建重组PCR(R)T7/NT-TOPO(R)-IL-10质粒载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysE细胞内高效表达.

应用凝胶过滤筛选纯化甲型肝炎病毒介质

目的筛选适合甲肝病毒疫苗大规模纯化凝胶过滤层析的介质.方法采用柱层析法,分别以Sepharose 4 FF,Sepharose 6 FF及Sephacryl S-500 HR三种不同的凝胶过滤介质对经过阴离子交换层析纯化的甲肝病毒样品进行纯化.结果三种凝胶介质分离甲肝病毒的图谱不相同,其中以Sepharose 4FF纯化甲肝病毒,抗原回收率达69%,纯化倍数为4.4倍.结论 Sepharose 4FF凝胶过滤层析可以用于甲肝灭活疫苗的大规模纯化.

细菌多糖疫苗苯酚污染的分析及其检测方法

目的确定细菌多糖疫苗苯酚污染及其质量控制方法.方法采用分光光度法,改良Lowry氏标准加入法和HPLC法.结果正常的脑膜炎球菌多糖在260 nm波长附近有一个大吸收峰λmax(260 nm),而苯酚的特征吸收波长为λmax(270 nm);5批正常的脑膜炎球菌多糖A260/A270值在1.07～1.12之间.当正常多糖原液有苯酚污染时,大吸收波长红移(260 nm→270 nm),导致A260/A270值由大于1变为小于1.当苯酚增加到20 μg/ml时,A260/A270降至0.88,纯的苯酚为0.62;采用内标加入法定量测定出伤寒Vi多糖残留苯酚含量为0.101 μg/ml;HPLC法定量测定1型肺炎球菌多糖、Hib多糖和卡介菌多糖核酸样品中的苯酚含量分别为0.28、0.96和0.63 μg/ml.结论①多糖原液的A260/A270值可判断多糖原液是否被苯酚污染.当A260＞A270或A260/A270=1.1(或＞1.07)时为正常,无苯酚污染或苯酚污染可接受;当A260=A270或A260/A270=1时为介于正常和不正常之间;当A260＜A270或A260/A270=0.9或以下时为不正常或有苯酚的污染.②内标加入法可定量测定细菌多糖中残留苯酚的含量.③HPLC法亦可精确地测定细菌多糖中残留苯酚的含量.

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因(ureI)的克隆及其表达和纯化

目的对幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因ureI进行克隆、测序,并在昆虫细胞中表达及进行产物纯化.方法克隆ureI基因,经测序正确后,酶切、连接到pFASTBACHb质粒上,与穿梭载体DH10BAC转座,获得Bacmid-ureI质粒,转染Sf9细胞,采用Ni2+螯合琼脂糖亲和层析纯化,经SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果克隆了ureI基因,并在昆虫细胞Sf9中表达纯化,蛋白纯度达85%以上,并与6-His单抗特异结合.结论表达及纯化的ureI蛋白为进一步研究打下了基础.

生物素标记UTP及温度值对HCV细胞外聚合酶分子复制模型的影响

目的研究建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型使用的生物素标记UTP浓度及温度值,为筛选药物创造条件.方法使用高保真PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR,从我国HCV RNA阳性病人血清中扩增出HCV NS5b RNA聚合酶全长基因序列,构建原核表达载体pET-30a-NS5b.在多个载体中选取pET-30a作为表达载体,选择诱导表达条件.利用Ni2十金属离子螯和亲和层析将其纯化,对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究.利用96孔DNA-BAND培养板, 建立生物素标记检测HCV NS5b聚合酶活性的模型.结果测序及读码框架分析结果表明,已得到相关HCV NS5b RNA聚合酶全基因序列.在佳表达条件下,诱导表达的融合蛋白(相对分子质量65 000),纯度大于92.83% HCV聚合酶活性集团完整.建立了细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型使用的佳生物素标记UTP浓度及温度值.结论 HCV 聚合酶得到高效表达和有效纯化,以及HCV聚合酶作用模板及温度的佳条件分别为0.5 mmol/L及37℃.

重组人载脂蛋白A-I(米兰变体)的复性及纯化

目的从大肠杆菌中获得载脂蛋白A-I(米兰变体)的包涵体,对包涵体进行复性、纯化,终获得具有生物活性的载脂蛋白A-I(米兰变体).方法包涵体以尿素溶解后,以疏水层析法复性重组蛋白;以离子交换层析对其进一步纯化,并对所得的蛋白进行生物活性分析.结果经复性纯化的蛋白纯度达95%,体外生物活性检测显示其具有生物活性.结论本法能快速有效地对目的蛋白进行复性、纯化,并且有望放大至工业生产规模.

双价肾综合征出血热纯化疫苗(Vero细胞)的纯化工艺

目的研究肾综合征出血热抗原的纯化工艺.方法用Vero细胞繁殖肾综合征出血热病毒,经过灭活、浓缩,Sepharose 4FF凝胶过滤纯化.结果用Sepharose 4FF柱层析纯化时,280nm监测收集到3个吸收峰,其中第1峰为抗原峰,将第1峰稀释配制后进行动物实验,表明按照该工艺制备的Vero细胞纯化疫苗安全有效. 结论本研究为肾综合征出血热纯化疫苗的研制奠定了基础.

免疫毒素研究及临床应用进展(二)临床研究

免疫毒素的临床应用按肿瘤细胞表面靶抗原分类的不同予以排列,正在临床试验中的免疫毒素/嵌合毒素,见表1.

关于疫苗临床研究中的伦理学要求和考虑

接种疫苗是预防控制疾病的发生和流行的重要措施.近年来,随着生命科学的飞速发展,新型疫苗不断出现,疫苗的应用范围不断扩大,疫苗临床研究的工作显著增多.随着社会伦理学的不断发展和人类自我保护意识的不断增强,对在临床研究中受试者的保护越来越受到重视.

高致病性禽流感及其公共卫生学

禽流感的暴发和流行主要是由高致病性的H5和H7亚型AIV引起的.近年来高致病性禽流感的先后暴发和流行,特别是出现有人因感染而死亡的病例,更突出地显示了禽流感特别是高致病性禽流感的公共卫生学意义.对高致病性禽流感的流行病学、分子生物学等的研究为其预防和控制奠定了坚实的基础.

我国重组(CHO细胞)乙肝疫苗免疫预防效果已达世界先进水平