人颗粒溶素活性片段原核表达载体的构建与鉴定

目的 构建人颗粒溶素(GMLY)活性片段原核表达载体.方法 采用RT-PCR技术从健康人外周单个核细胞中扩增出颗粒溶素活性片段cDNA,将其与表达载体pGEX-4T-1经限制性核酸内切酶双酶切后连接,转化E.coli BL21,挑取阳性菌落,抽提重组质粒并鉴定.IPTG诱导表达GST融合蛋白,亲和层析纯化,SDS-PAGE分析表达和纯化结果,抑菌圈法鉴定表达产物的活性.结果 重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶素活性片段cDNA.表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量29000处出现一明显条带,与理论结果相符.抑菌试验表明,融合蛋白分子凝血酶切产物对革兰阳性的金黄色葡萄球菌ATCC25938有抑制作用.结论 已成功构建了人颗粒溶素活性片段原核表达载体,为进一步研究其抗菌、抗肿瘤作用奠定了基础.

布鲁菌BP26基因的克隆、表达及纯化

目的 克隆布鲁氏菌BP26基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化BP26蛋白.方法 提取布鲁氏菌基因组DNA,用PCR扩增出BP26基因,并克隆到pMD18-T载体上,测序正确后,再亚克隆至pET-28a(+)载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPIG诱导表达,经组氨酸结合树脂柱纯化,并对纯化后的表达产物进行Westem blot鉴定.结果 重组质粒pETBP26经Nde I与Sal I酶切后,可见大小分别为5400和700bp的片段,与理论值相符.转化大肠杆菌BL21(DE3)后,37℃诱导4h,经SDS-PAGE分析,高效表达出带有His-tag标签的融合蛋白BP26,纯化后的蛋白纯度达96%,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性.结论 已成功克隆了BP26基因,且表达并纯化了布鲁氏菌BP26蛋白.

LFA-1基因对胶原诱导小鼠关节炎关节局部引流淋巴结T细胞活性的影响

目的 探讨淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)在类风湿性关节炎形成中的作用.方法 采用Ⅱ型胶原诱导小鼠关节炎模型,观察LFA-1基因敲除小鼠引流淋巴结T细胞增殖和细胞因子水平.结果 LFA-1基因敲除小鼠在应用Ⅱ型胶原免疫后,引流淋巴结和关节局部Th1型细胞因子IFN-γ和IL12 p40 mRNA水平明显低于野生型对照小鼠,Th2型细胞因子IL-4 mRNA水平无明显变化.LFA-1基因敲除小鼠引流淋巴结来源的CD4+T细胞在体外受Ⅱ型胶原刺激后,其特异性增殖和细胞因子IFN-γ的产生也明显低于野生型对照小鼠.结论 LFA-1基因缺失抑制了辅助性T细胞的活化和向Th1方向的分化,进而抑制关节炎的发生.

骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑组织中的迁徙、定居及组织修复作用

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植后,在缺血性脑损伤大鼠脑组织中的迁徙、定居及组织修复作用.方法 体外分离、纯化及培养MSCs.线栓法制备Wester大鼠脑缺血模型,经颈动脉移植DAPI标记的MSCs,通过激光共聚焦显微镜,分别在24h、5d及10d观察MSCs在脑组织内的迁徙及定居.采用三苯四氮唑活组织脑片染色方法,观察MSCs治疗对脑组织损伤的修复作用.结果 MSCs经颈动脉移植后,在24h即出现在脑损伤区域血管内,第5天在血管周围组织内开始弥散,第10天在损伤区域可见广泛弥散.MSCs治疗20d后,脑片染色显示坏死区域减少.结论 动脉移植MSCs后,MSCs首先出现在大鼠缺血性脑损伤区域血管内,然后在周围组织弥散,并可能参与损伤区血管及组织的修复.

人源抗乙型肝炎病毒表面抗原基因工程IgG全抗体的表达、纯化及初步鉴定

目的 对人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体进行表达、纯化及初步鉴定.方法 用含Fc片段抗-HBsAg Fab抗体基因的载体pAC-HBs-Fc,与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞sf9,产生重组抗-HBsAg的全抗体.以不同浓度的HBsAg包被酶标板孔,用间接ELISA法检测培养上清中抗体的表达及特异性;用蛋白G亲和层析柱进行抗体的纯化,并对纯化的抗体进行SDS-PAGE、Western blot和竞争性ELISA分析.结果 上清中表达的重组IgG抗体仅与HBsAg呈阳性反应,特异性良好,纯化后其纯度达97.1%.经SDS-PAGE和Western blot分析可见,IgG抗体轻链和重链的相对分子质量分别约为27000和55000,为人源IgG抗体.CHO表达的HBsAg和血源性HBsAg能竞争性抑制该重组IgG抗体与E.coli表达的HBsAg反应,其抑制率分别为55.9%和81.9%.结论 人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体可在杆状病毒载体表达系统中成功表达.

急性冠状动脉综合征患者血清中基质金属蛋白酶-2的表达

目的 探讨急性冠状动脉综合征与血清基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的相关性.方法 应用酶图(SDS-PAGE enzymograph)和Western blot方法检测50名急性冠脉综合征患者(27名ST段抬高急性心肌梗塞患者和23名不稳定性心绞痛患者)、20名稳定性心绞痛患者及40名正常对照者的血清MMP-2水平.结果 急性心肌梗塞组血清MMP-2水平明显高于不稳定性心绞痛组;急性心肌梗塞组及不稳定性心绞痛组血清MMP-2水平明显高于正常对照组;稳定性心绞痛组与正常对照组差异无显著意义;急性心肌梗塞组及不稳定性心绞痛组血清MMP-2水平高于稳定性心绞痛组.结论 急性冠脉综合征患者血清MMP-2水平明显升高,其水平可能与冠状动脉斑块的稳定性相关.

我国黄热疫苗株病毒结构基因片段遗传特征的分析

目的 分析中国使用的黄热疫苗株病毒结构基因片段的遗传特征.方法 从我国使用的黄热疫苗病毒中提取RNA,对病毒结构基因片段进行扩增及测序,将测序结果与GenBank中黄热病毒Asibi株及黄热病毒疫苗株17D-204和17DD相应的核苷酸序列进行比较.结果 中国黄热疫苗株在基因分子水平上具有17D疫苗株的基本减毒特征,与17DD株不同,与17D-204株更为相近.结论 中国黄热疫苗株源自17D-204株,是安全有效的减毒株,且具有自身特有的遗传特征.

多发性骨髓瘤p16基因甲基化与其预后的相关性

目的 探讨多发性骨髓瘤p16基因甲基化与其预后之间的相关性.方法 采用甲基化敏感的限制性内切酶联合聚合酶链反应方法(REP法),检测52名多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓细胞p16基因第1外显子的甲基化状态,并检测存在p16基因第1外显子甲基化的MM患者p16基因的mRNA转录水平.对这52名患者的临床资料及预后因素进行分析.结果 52名MM患者中,p16基因启动子区第1外显子甲基化率为53.84%(28/52).存在p16基因第1外显子甲基化的MM患者中,p16基因mRNA阴性率为75%.p16基因甲基化患者的预后不良因素明显高于非甲基化患者.结论 多发性骨髓瘤p16基因甲基化与其预后有关.

不同乙型肝炎表面抗原配制的免疫复合物的免疫原性

目的 研究不同乙型肝炎表面抗原配制的免疫复合物(IC)的免疫原性,并进一步优选治疗性乙型肝炎疫苗佳抗原.方法 用不同重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)与不同的乙型肝炎表面抗体(anti-HBs)制备IC,分别免疫BALB/c小鼠,检测体液免疫及细胞免疫应答水平.结果 IC诱生的抗-HBs效价、抗-HBs IgG2a/IgG1的比值及IFN-γ形成细胞数,YHBIC组总体上略高于CHO-IC组,但差异无显著意义.结论 IC的免疫效果优于单独HBsAg;不同乙型肝炎表面抗原配制的IC之间免疫原性差异无显著意义.

甲胎蛋白的生物学作用及其研究进展

甲胎蛋白是一种胚胎性蛋白,长期以来主要用于原发性肝癌的诊断.本文就甲胎蛋白的免疫抑制作用、肿瘤细胞的生长调节作用及其研究进展进行综述.

肉毒毒素及其疫苗研究进展

肉毒毒素是目前已知毒性强的毒素,是引起食物中毒的常见细菌毒素之一,也是重要的生物战剂之一.本文对肉毒毒素的结构、作用机制及其疫苗的研制进行了综述.

乙型肝炎病毒变异

乙型肝炎疫苗和抗病毒药物在全球的广泛应用有效地防止了乙肝病毒的感染.但是在疫苗免疫后人群、抗病毒治疗的患者以及慢性HBV感染的人群中都出现了HBV的变异,对于乙肝的免疫诊断、预防及临床治疗方案的选择都产生了很大的影响.本文对乙肝病毒变异株的流行情况进行了较全面的综述.

疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法的建立

目的 建立疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法.方法 制备Vero细胞蛋白抗原参考品,免疫家兔,提纯抗体作为包被抗体并以酶标记,建立酶联免疫检测系统.用Vero细胞蛋白抗原参考品绘制定量标准曲线,并对各项指标进行验证.结果 提纯后抗体纯度达90%以上,抗体效价为1:64,Western blot分析显示,提纯抗体与Veto细胞蛋白抗原参考品中绝大部分蛋白成分均能特异性结合.确定佳抗体包被浓度为10μg/ml,酶标抗体的工作浓度为1:1000.Vero细胞蛋白抗原参考品定量范围为12.5～800.0 ng/ml时,线性关系良好,γ=0.997,该方法特异性、精密度及准确度良好.将试剂于4、25和37℃分别放置3周,检测同一定量参考品和样品中Vero细胞蛋白抗原含量,差异无显著意义.结论 已建立了用ELISA检测疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量的方法.

检测戊型肝炎病毒核酸的实时荧光聚合酶链反应法的建立

目的 建立一种能快速、敏感地检测戊型肝炎病毒(HEV)核酸的实时荧光聚合酶链反应法(Real-time RT-PCR).方法 基于HEV ORF3保守区序列,设计引物和探针,从22对引物和4条探针中进行筛选,并对选出的引物和探针的浓度、反应体系、反应条件、核酸抽提方法等进行优化.采用常规套式RT-PCR和本研究建立的实时荧光RT-PCR检测不同样品,比较两种方法的特异性和敏感性.结果 优化出1对引物和探针的组合.优化的30μl反应体系中,上、下游引物浓度均为0.10mmol/L,探针浓度为0.20 mmol/L,Taq酶的浓度为3U,AMV逆转录酶浓度为2U.优化的反应条件为:50% 30min;95℃3min;95℃10s,50℃ 30s,72℃60s,5个循环;95℃ 10s,57℃40s,40个循环.初步检测结果显示,该方法与常规套式RT-PCR特异性符合率为100%,两种方法检测HEV1型样品的敏感性均为104,检测人和猪的HEV4型样品时,实时荧光RT-PCR敏感性均为104,明显高于常规套式RT-PCR的103和102.结论 所建立的检测HEV核酸的实时荧光聚合酶链反应法具有简便、快速、敏感性较高以及不易被污染等优点,具有一定的临床应用潜力.

ESA与STAg联合滴鼻免疫小鼠诱导的特异性免疫应答

目的 观察弓形虫排泄分泌抗原(ESA)与可溶性速殖子抗原(STAg)联合或单独滴鼻免疫小鼠的免疫应答效果,筛选弓形虫黏膜疫苗候选抗原.方法 将40只BALB/c小鼠随机分为4组,每组10只.实验组分别用20μg STAg、30 μg ESA及二抗原联合(15μg ESA与10 μg STAg)滴鼻免疫2次,间隔14d,对照组用PBS以20μl/只滴鼻.于末次免疫后第14天,取血清,收集小肠冲洗液,检测特异性抗体,分离肠上皮内淋巴细胞(iIEL)和脾淋巴细胞并计数.结果 整个实验期间,各组小鼠健康状况良好,体重逐渐增加.STAg组、ESA组及联合抗原组小鼠黏膜、血清中特异性抗体水平依次升高,脾淋巴细胞和iIEL增殖反应逐渐增强.联合抗原组和ESA组血清IgG抗体和小肠冲洗液sIgA升高尤为显著.同时,联合抗原组、ESA组脾淋巴细胞和iIEL增生显著高于对照组.结论 ESA单独或联合STAg滴鼻免疫小鼠均能激发弓形虫特异性黏膜及系统免疫应答.两种抗原联合免疫的研究,将有助于制定更加完善的弓形虫疫苗研究策略.

治疗性双质粒HBV DNA疫苗的纯化与检定

目的 研究双质粒HBV DNA疫苗(pS2.S和pFP)的纯化工艺,并建立质控标准.方法 首先对两工程菌(DHSα/pS2.S和DH5α/pFP)的高效发酵菌体采用碱裂解法进行质粒初提;然后通过三步柱层析(依次为分子筛层析、亲和层析、阴离子层析)进行质粒纯化,并检测质粒含量、超螺旋比例、内毒素等,后对终产品质粒溶液进行全面质量检定.结果 质粒初提液通过分子筛层析后,去除了大量的RNA、宿主DNA、内毒素等,再经亲和柱纯化后获得了高比例的超螺旋质粒DNA,达95%,后经阴离子柱层析有效去除内毒素,并浓缩了质粒,质粒得率为0.9～1.1 mg/g菌,质粒总回收率达78%.三批终产品全面质量检定均符合规定.结论 建立了稳定的双质粒HBV DNA疫苗(pS2.S和pFP)的纯化工艺及质量控制标准,为进一步研究奠定基础.

蚓激酶在牛乳腺中的稳定表达

目的 构建蚓激酶重组逆转录病毒载体,并在牛乳腺中稳定表达蚓激酶.方法 将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中,获得蚓激酶重组逆转录病毒载体,利用脂质体转染PA317包装细胞,G418筛选阳性细胞克隆,克隆扩大培养后,病毒上清转染妊娠7个月奶牛乳腺小叶组织.产犊后采奶样,FAPA法检测蚓激酶活性,并进行凝胶薄层扫描分析.结果 蚓激酶重组逆转录病毒高滴度约为1×104 CFU/ml.奶牛产后奶样中蚓激酶基因在牛乳腺中可连续表达112 d,活性相当于30 000英国单位/L牛奶,在牛奶中表达量可达180mg/L牛奶.结论 已成功构建蚓激酶重组逆转录病毒载体,蚓激酶可在牛乳腺中相对稳定地表达.

动物源性生物制品病毒灭活/去除工艺的验证

目的 对动物源性生物制品病毒灭活/去除工艺进行验证.方法 针对不同动物源性制品,选择相关的指示病毒,对4个厂家不同的病毒灭活/去除工艺进行效果验证.结果 各工艺均可灭活/去除指示病毒4 Logs以上,均为有效的灭活/去除病毒工艺.结论 4个厂家的灭活/去除病毒工艺均可保证制品的安全性.

精制抗狂犬病血清的接种反应

目的 观察国产精制抗狂犬病血清接种后的反应.方法 按照抗狂犬病血清使用说明,对符合三级暴露者850人进行抗狂犬病血清接种,并观察接种反应.结果 抗狂犬病血清注射者850人,反应阳性率为12.47%,其中24h内反应率为3.41%,迟发过敏反应率为9.06%.无过敏性休克病例.4～8d出现局部反应率为4.94%,比其他时间组均高,差异有显著意义.皮试阳性组与阴性组迟发过敏反应率比较,差异无显著意义.男性反应率为10.83%,女性反应率为13.91%,两组差异无显著意义.不超过加岁组反应率为8.12%,20岁以上年龄组反应率为15.62%,两组差异有显著意义.结论 使用国产精制抗狂犬病血清安全可行.

α1-酸性糖蛋白单克隆抗体的制备及检测方法的建立

目的 制备α1-酸性糖蛋白(α1-Acid glycoprotein,α1-AGP)单克隆抗体(McAb),建立α1-AGP的ELISA检测方法,用于检测人体血液、尿液及各种组织液中α1-AGP的水平.方法 用高氯酸沉淀人血清中α1-AGP,经离子交换层析和高压液相层析纯化后,免疫BALB/c小鼠,建立特异性抗α1-AGP单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备并鉴定McAbs,分析各株分泌抗体的效价、特异性、位阻群、类及亚类.制备针对α1-AGP的双抗体夹心ELLSA检测试剂盒,分析其稳定性、灵敏度和特异性,并进行临床评价.结果 建立了9株特异性抗α1-AGP单克隆抗体杂交瘤细胞株,均分泌IgG抗体,所有抗体的轻链均为κ链.根据位阻分析结果,将9个细胞株分泌的抗体分为5个位阻群,腹水效价在1×10-4～×10-7之间,且均有较好特异性.制备的α1-AGP双抗体夹心ELISA试剂盒灵敏度达2 ng/ml,且检测结果与α1-AGP含量呈现良好的线性关系(γ=0.9916),并与其他血清蛋白无交叉反应,试剂盒置37℃放置3d及4℃放置2个月,稳定性良好.用该试剂盒检测96份正常人血样,其α1-AGP平均值为0.43～1.32mg/ml;105份Ⅱ型糖尿病患者血样,其平均值为0.88～2.35mg/ml,经统计学分析,两者差异有显著意义.结论 已成功制备出α1-AGP McAb,并建立了针对α1-AGP的双抗体夹心ELISA,制备的试剂盒可用于临床检测.

中华预防医学会(生物制品分会第五届委员会)会议在京召开