抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

目的 构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行瞬时表达.方法 采用RT-PCR技术,设计针对信号肽的简并引物,钓取抗CD25杂交瘤细胞的重、轻链可变区基因,以质粒PAG4622为模板,钓取人抗体IgG1重、轻链恒定区基因,分别将重、轻链可变区基因与相应的恒定区基因进行拼接,将完整的重、轻链嵌合基因分别与真核表达载体pOptiVEC和PcDNA3.3连接,构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,将其通过脂质体法共转染至293T细胞中进行表达.通过RT-PCR法检测嵌合抗体基因的转录水平,ELISA法检测嵌合抗体的表达,流式细胞术(FCM)分析嵌合抗体的结合活性.结果 抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒构建正确;RT-PCR显示嵌合抗体基因在293T细胞中成功转录;转染后48、72、96和120 h,细胞培养上清中嵌合抗体的含量分别为7.47、11.72、8.02和18.28 ng/ml;FCM检测其能特异性与IL-2Rα链结合.结论 已成功构建了抗CD25人鼠嵌合抗体基因的真核表达质粒,并能在293T细胞中瞬时表达.

人Makorin环指蛋白1基因沉默对HEK293细胞的影响

目的 探讨特异件抑制人Makofin环指蛋白1(MKRN1)基冈的表达对HEK293细胞的影响.方法 用脂质体将前期筛选出的含有效干扰序列的人MKRN1基因shRNA真核表达质粒,转染至HEK293细胞中,观察其对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因mRNA转录水平、蛋白表达水平及细胞增殖的影响.结果 人MKRN1基因shRNA真核表达质粒转染HEK293细胞后,在mRNA和蛋白水平均能明显上调细胞hTERT基因的表达,且细胞明显增殖.结论 抑制HEK293细胞中人MKRN1基因的表达,可导致hTERT基因mRNA转录水平和蛋白表达水平上调,并促进细胞增殖.

骨髓间充质干细胞在脊髓损伤模型大鼠体内的转化

目的 观察静脉移植骨髓间充质干细胞(MSCs)在脊髓损伤模型大鼠体内向神经样细胞转化的情况.方法 体外扩增培养MSCs,流式细胞仪检测表面标志CD34和CD44的表达;采用击打法制备大鼠脊髓损伤模型;Brdu标记的MSCs经尾静脉移植入脊髓损伤模型大鼠体内,输注后21 d,取脊髓组织进行免疫组化染色,检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达.结果 体外扩增的MSCs经流式细胞仪检测不表达CD34,表达CD44;激光共聚焦显微镜下观察可见,移植Brdu标记的MSCs组在大鼠损伤的脊髓组织中可同时表达Brdu和NSE.结论 移植的MSCs可迁移到损伤的脊髓组织,并可转化为神经样细胞.

日本血吸虫双表膜抗原融合基因原核表达质粒的构建及表达

目的 构建编码日本血吸虫表膜蛋白SjTsp2与Sj29融合基因的原核表达质粒,并表达重组蛋白.方法 利用基因SOEing PCR技术得到SjTsp2与Sj29融合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a中,转化E. Coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果 序列分析显示,融合基因与两个目的基因的同源性达100%;SDS-PAGE显示表达的重组蛋白相对分子质量为43 000,表达量占菌体总蛋白的20%以上;Western blot显示其分别能与SjTsp2和Sj29蛋白的单克隆抗体结合.结论 已成功构建了SjTsp2与Sj29融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为研制血吸虫病疫苗提供了材料.

南蛇藤提取物诱导SGC-7901胃癌细胞凋亡及其机制

目的 观察南蛇藤乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在体外诱导SGC-7901胃癌细胞凋亡的作用,并初步探讨其分子机制.方法 制备南蛇藤乙酸乙酯和正丁醇提取物,采用MTT法检测二者对SGC-7901胃癌细胞增殖的影响;应用FTTC-Annexin V及碘化丙锭(PI)双标法,通过流式细胞仪(FCM)观察SGC-7901细胞的凋亡率及P53蛋白的表达.结果 不同浓度的南蛇藤乙酸乙酯和正丁醇提取物(15、30、60、120μg/m1)对SGC-7901细胞的增殖均有一定的抑制作用,且呈剂量依赖性.两种南蛇藤提取物(60、120、240、480μg/ml)可剂量依赖性地诱导肿瘤细胞凋亡,且随着浓度的升高,SGC-7901细胞P53蛋白的表达也增加,浓度为240和480μg/ml的提取物组与对照组相比,差异有统计学意义.结论 南蛇藤乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在体外可诱导SGC-7901细胞凋亡,上调细胞中P53基因的表达可能是其抗肿瘤作用的分子机制之一.

小鼠截短型可溶性腺苷酸环化酶基因的克隆表达及活性鉴定

目的 克隆表达小鼠截短型可溶性腺苷酸环化酶(mtsAC)基因,并检测其活性,为后续研究提供技术平台.方法 Trizol法提取小鼠睾丸组织总RNA,RT-PCR法扩增mtsAC基因,经测序正确后,克隆至真核表达载体pcDNA4-V5,转染HEK293T细胞,Western blot及免疫荧光染色法检测目的蛋白的表达,并检测HEK293T细胞中cAMP的水平.结果 所构建的重组表达质粒pcDNA4-V5-mtsAC经酶切和测序证明构建正确,插入的mtsAC基因长度为1 549 bp;表达的重组mtsAC蛋白相对分子质量为48 000,在胞浆及胞核中呈均一性表达;转染质粒pcDNA4-V5-mtsAC的HEK293T细胞中cAMP的水平较未转染的HEK293T细胞升高约17倍,并可被NaHCO_3和CaCl_2激活.结论 已成功克隆了mtsAC基因,并在HEK293T细胞中表达了具有活性的重组mtsAC蛋白,建立了可用于mtsAC特性研究及男性不育药物筛选的技术平台.

小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1功能基因的克隆及原核表达

目的 克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)功能基因,原核表达并纯化OAZ1重组蛋白.方法 采用RT-PCR法从小鼠黑色素瘤细胞总RNA中扩增OAZ1基因,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因,并构建重组表达质粒pET15b/OAZ1-T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经Ni~(2+)-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果 重叠PCR法扩增出692 bp的OAZI功能基因,重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确,重组蛋白可在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达.纯化的重组蛋白纯度可达79.96%,且可与抗His标签抗体特异性结合.结论 已成功克隆了小鼠OAZ1功能基因.原核表达并纯化了重组OAZ1蛋白.

低剂量电离辐射对糖尿病小鼠血清中炎症因子表达的影响

目的 探讨低剂量电离辐射(LDR)对链尿佐菌素(STZ)诱导的Ⅰ型糖尿病(DM)小鼠血清中炎症因子表达的影响.方法 取健康C57BL/6J小鼠,经腹腔注射STZ复制小鼠糖尿病模型,并设空白对照组.将糖尿病模型小鼠分为DM和DM/LDR组,空白对照组分为LDR组及对照组.DM/LDR组和LDR组给予25 mGyLDR,隔日照射1次,共照射4周;DM组和对照组不经LDR照射.分别于照射后2、4、8、12及16周,采用ELISA法检测小鼠血清中不同炎症因子的表达水平.结果 LDR照射前,4组小鼠血清中ICAM-1和IL-18的表达水平较为接近,而糖尿病小鼠血清中TNFα和MCP-1的表达水平显著高于非糖尿病小鼠;给予LDR照射后,在不同时间点DM/LDR组小鼠血清中IL-18、MCP-1及TNFα的表达水平与DM组相比,均显著降低,LDR组小鼠血清中IL-18、MCP-1及TNFα的表达水平较对照组明显增加.ICAM-1表达的变化与其他因子不同,LDR照射4周时,糖尿病小鼠显著高于非糖尿病小鼠,但在任何时间点,DM/LDR与DM组、LDR与对照组之间差异均无统计学意义.结论 在糖尿病状态下,LDR能有效降低血清中IL-18、TNFα和MCP-1的表达水平,缓解糖尿病肾脏中的炎症反应强度;但在正常机体中表现为提高免疫力,促进免疫相关因子的释放.表明LDR针对机体所处的不同状态发挥着不同的生物调节功能.

Catesbeiania-1在毕赤酵母中的表达及其体外生物活性

目的 在毕赤酵母中表达抗菌肽Catesbeiania-1,并检测其体外生物活性.方法 将从牛蛙皮肤上新分离的一条抗菌肽基因Catesbeiania-1克隆至真核表达载体pPICZaA,构建重组真核表达质粒pPICZaA-Catesbeiania-1.在毕赤酵母GS115中表达重组Catesbeiania-1蛋白,并进行体外生物活性测定.结果 所构建的重组表达质粒pPICZaA-Catesbeiania-1序列完整.经Tricin-SDS-PAGE分析,表达的重组Catesbeiania-1蛋白相对分子质量约为5 800,分泌性蛋白的表达量为36.3 mg/ml.重组蛋白对几种常见的革兰阳性菌和阴性菌均具有较好的抑菌活性,无胰蛋白酶水解活性和抑制剂活性,具有很强的抗氧化能力.结论 已成功表达了抗菌肽Catesbeiania-1,表达的重组蛋白具有一定的抑菌活性.

A组轮状病毒非结构蛋白NSP2的研究进展

A组轮状病毒非结构蛋白NSP2在病毒复制过程中起重要作用.本文就NSP2蛋白编码基因和基因型、蛋白的表达、结构、功能及其免疫学性质的研究进展作一综述.

丝状真菌异源蛋白高效表达的研究进展

丝状真菌作为细胞工厂在生物技术领域被广泛应用于生产药物、化学试剂和酶类.近年来,丝状真菌基因组学领域取得了快速发展,利用丝状真菌表达异源蛋白也越来越受到重视.本文从基因表达与调控、蛋白质分泌途径及丝状真菌菌株等方面对丝状真菌高效表达异源蛋白的新研究进展作一综述.

疫苗免疫毒理学评价的研究进展

由于疫苗引起的不良反应多与免疫反应相关,因此免疫毒理学评价在疫苗的安全性评价中显得尤为重要.本文就疫苗免疫毒性包括超敏反应、免疫抑制和自身免疫反应的发生机理及其评价方法的研究进展作一综述.

呼吸道合胞病毒空斑检测方法的建立及应用

目的 建立呼吸道合胞病毒(RSV)空斑检测方法,并用于病毒滴度的定量.方法 将不同稀释度的RSV A2株病毒液分别接种于Hep-2细胞单层,加0.6%营养琼脂糖覆盖,培养6 d后用10%甲醛固定.去除覆盖层,0.05%中性红染色,按文献报道的方法进行空斑计数.建立空斑法测定RSV滴度的标准曲线,并验证空斑法的准确性及精密性,应用建立的空斑法检测RSV感染BALB/c小鼠肺组织中的RSV滴度.结果 RSV A2株感染的Hep-2细胞出现典型的空斑,直径约1～3 mm,形态呈圆形或类圆形.空斑法的低检测限为3.4×10~1PFU/ml,线性关系良好,相关系数r=0.999 996,准确性及精密性均良好.RSV感染的BALB/c小鼠肺组织标本均出现数量不等的空斑.结论 所建立的RSV空斑测定方法敏感、准确,能稳定地对病毒滴度进行定量测定,为进一步研究RSV的感染性和免疫原性奠定了基础.

单克隆抗体制品中残余SP2/0细胞蛋白含量ELISA检测试剂盒的验证

目的 对单克隆抗体制品中残余SP2/0细胞蛋白含量ELISA检测试剂盒进行验证.方法 对Cygnus Tech-nologies公司制备的SP2/0 Host Cell Proteins(HCPs)ELISA试剂盒进行灵敏度、精密性验证及基质干扰试验和样品稀释同收试验,并采用该试剂盒对本公司制备的10批单抗制品原液及冻干品进行检测.结果 标准蛋白含量的对数与相应的光吸收值的对数,在2～200 ng/ml范围内呈线性关系;该试剂盒检测限可达0.6 ng/ml,定量限可达2 ng/ml,灵敏度符合要求;检测低、中、高3个浓度的SP2/0 HCPs样品试验内及试验间变异系数分别为15.4%、3.0%、2.1%及12.0%、3.3%、1.5%;样品基质对检测无明显干扰;单抗样品检测不存在Hook效应;检测本公司10批单抗制品原液和冻干品中SP2/0细胞蛋白残留率均小于0.01%.结论 该试剂盒灵敏度高,精密性好,可用于单抗制品中残余SP2/0细胞蛋白含量的测定.

6C型肺炎链球菌抗血清的制备及鉴定

目的 制备6C型肺炎链球菌抗血清,并进行鉴定.方法 将经美国单克隆抗体方法鉴定为6C型的肺炎链球菌制成菌体抗原免疫家兔,制备抗血清;将抗血清与6A、6B和6C型肺炎链球菌进行荚膜肿胀和凝集试验;用6A、6B及6A和6B型肺炎链球菌吸附血清后,再次检测其与各型肺炎链球菌的凝集效价.结果 免疫前的兔血清与6A、6B和6C型肺炎链球菌均未出现荚膜肿胀及凝集反应.免疫后的血清与6A、6B和6C型的凝集效价分别为1:64、1:32和1:64;经6A或6A和6B型吸附后,与6A、6B和6c型的凝集效价分别为(-)、(-)和1:8;经6B型吸附后,与6A、6B和6C型的凝集效价分别为1:16、(-)和1:16.结论 6C型为新的肺炎链球菌血清型,已成功制备出6C型抗血清,可用于血清分型研究.

D2蛋白酶间接ELISA检测方法的建立

目的 建立D2蛋白酶间接ELISA检测方法,为D2蛋白酶的进一步研究及应用奠定基础.方法 以纯化的D2蛋白酶为抗原,免疫新西兰白兔,制备D2蛋白酶多克隆抗体,建立D2蛋白酶间接ELISA检测方法,并进行验证及初步应用.结果 D2蛋白酶间接ELISA检测方法的佳反应条件为:一抗稀释度为1:64 000,二抗稀释度为1:80 000,抗原稀释度为1:100,饱和包被浓度为1 160 ng/ml,封闭剂为10%胎牛血清.标准曲线的线性检测范围为18～1 160 ng/ml.该方法准确性、重复性良好,特异性强、敏感性高,与琼脂扩散试验检测结果的符合率为95.5%.结论 已建立了D2蛋白酶间接ELISA检测方法,可用于D2蛋白酶含量的检测.

人偏肺病毒检测方法的比较

目的 比较几种人偏肺病毒(hMPV)的检测方法,为临床选择适当的检测方法提供依据.方法 不同稀释度的hMPV分别感染Vero-E6细胞,出现细胞病变(CPE)后,分别用RT-PCR、Real-time PCR和IFA进行检测,比较3种方法的灵敏度;10倍系列稀释滴度为10~(5.2) TCID_(50)/ml的hMPV,分别用RT-PCR及Real-time PCR进行检测,定量比较两种方法的灵敏度;分别用Real-time PER和IFA检测523份急性呼吸道感染患儿的鼻咽分泌物.结果 IFA、RT-PCR和Real-time PCR分别可检出10~(-4)、10~(-5)、10~(-7)稀释度孔中的病毒;RT-PCR和Real-time PER检测的灵敏度分别为1.0×h10~3和1 TCID50/ml;在523份鼻咽分泌物标本中,IFA检测阳性率为9.18%,Real-time PCR检测阳性率为31.55%.结论 Real-time PCR检测鼻咽分泌物标本中hMPV为儿科临床早期诊断的佳方法;IFA可作为基层医院及hMPV相关严重呼吸道感染的检测方法.

口蹄疫病毒VP1、VP4基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性

目的 构建口蹄疫病毒(FMDV)VP1、VP4基因核酸疫苗质粒,并研究其免疫原性.方法 通过RT-PCR获得FMDV VP1、VP4基因,以真核表达载体pIRESneo为基础,构建VP1单表达以及VP1、VP4融合表达和共表达质粒.转染BHK-21细胞后,Westem blot检测目的蛋白的表达.将上述3种基因核酸疫苗、VP1单表达与VP4单表达联合疫苗、灭活疫苗和空载体对照免疫豚鼠,检测血清特异性抗体及中和抗体水平,并进行保护力试验.结果 VP1单表达,VP1、VP4融合表达及共表达质粒经PCR及酶切鉴定,证明构建正确.各组核酸疫苗质粒均能诱导产生中和抗体,且具有一定的保护效力.VP1单表达组和联合组保护率均为28.6%;共表达组和融合表达组保护率均为42.9%;灭活疫苗组保护率为100%;空载体组保护率为0.结论 口蹄疫病毒VP1与VP4共存时能发挥更好的免疫原性.

抗乙型脑炎病毒阳性血清抗体效价参考品的制备

目的 制备抗乙型脑炎病毒阳性血清抗体效价参考品.方法 评估乙脑病毒IgG酶联免疫试剂盒定量检测不同浓度阳性血清抗体的线性范围、准确性、精密性及特异性,并以正常血清及其他免疫球蛋白产品为对照,对该参考品抗体效价定位进行适用性比较.结果 不同浓度阳性血清的线性范围为0.625～10 IU/ml,抗体效价回收率为91.2%～112.8%,试验内变异系数≤7.8%,正常血清与阳性血清的乙脑抗体效价相差15倍.试验用的阳性血清乙脑病毒抗体效价设为10 U/ml时,在特定的疫苗免疫程序下,效价峰值期能够实现合格血浆≥50%的收获率.结论 兼顾原料血浆的可获取性与产品临床效果的难以替代性,特定阳性血清定位为10 U/ml.

重组弓形虫热休克蛋白70联合弗氏佐剂免疫小鼠的抗弓形虫感染作用

目的 评价重组弓形虫热休克蛋白70(rTgHSPT0)联合弗氏佐剂皮下免疫小鼠的抗弓形虫感染作用.方法 BALB/c小鼠70只,随机分为7组,分别为PBS组、A组(佐剂+PBS)、20PA组(20μg rTgHSP70+佐剂)、40P组(40μg rTgH-SP70)、40PA组(40μg rTgHSP70+佐剂)、60PA组(60 μg rTgHSP70+佐剂)及80PA组(80μg rTgHSPT0+佐剂),皮下免疫,间隔2周,加强免疫2次,共免疫3次.末次免疫后14 d,用2×10~4个RH株弓形虫速殖子/只灌胃攻击各组小鼠,攻击后30 d处死,ELISA检测血清IgG和肠液sIgA;分离脑组织内弓形虫速殖子,并计数.结果 在添加佐剂组中,血清IgG水平随rTgHSP70剂量的增加而升高,与PBS组和A组比较,差异有统计学意义;肠液sIgA水平60PA组高,与20PA和40PA组比较,差异有统计学意义;与PBS组相比,A、20PA、40P、40PA、60PA和80PA组的脑组织内速殖子数分别减少了56.87%、56.46%、61.90%、48.74%、62.87%和70.44%.结论 rTgHSP70联合弗氏佐剂皮下免疫小鼠可诱导一定的抗弓形虫感染作用,80μg rTgHSP70为较佳剂量.

红色诺卡菌细胞壁骨架胶囊的制备及其生物学活性

目的 制备红色诺卡菌细胞壁骨架(N-CWS)胶囊,并检测其生物学活性.方法 采用超声波法和冷冻干燥法制备N-CWS胶囊,并通过影响因素试验、加速试验及长期试验考察其稳定性,通过小鼠抑瘤试验检测其生物学活性.结果 所制备的N-CWS胶囊各项质量指标均符合相关要求,稳定性良好;口服给药对小鼠移植性肿瘤有明显的抑制作用.结论 本实验制备的N-CWS胶囊质量稳定,抗肿瘤活性强,适于工业化生产.

Rh血型系统在安全输血中的意义

目的 研究配血不合患者血样中不规则抗体的分布特征,确定Rh血型系统在安全输血中的意义及输血策略.方法 采用盐水介质法、聚凝胺试验、抗人球蛋白试验和木瓜酶试验对2007年1月～2008年12月来河北省血液中心申请疑难配血的153例患者血样进行血型鉴定、抗体筛查和特异性鉴定及交叉配血试验.结果 153例受血者血液中,有134例存在不规则抗体,其中Rh系统免疫抗体68例(占50.75%),12例由多次妊娠免疫产生,55例由反复输血引起,1例为自身特异性;ABO和Rh以外其他血型系统抗体10例(占7.46%),单纯自身抗体阳性者56例(占41.79%).结论 在引起配血不合或溶血性输血反应的原因中,Rh系统的免疫居第1位,为受血者提供Rh因子同型血液输注是减少长期输血治疗患者发生Rh免疫的重要策略.

高特异性长双歧杆菌多克隆抗体的制备

目的 制备高特异性长双歧杆菌多克隆抗体,为长双歧杆菌的免疫学检测提供参考.方法 以破碎的长双歧杆菌细胞碎片为抗原免疫小鼠,制备抗血清;利用偶联相同抗原的磁珠,分离纯化长双歧杆菌多抗,分别采用间接ELISA、SDS-PAGE和点杂交法检测纯化多抗的效价、纯度和交叉反应性.结果 所制备的纯化多抗效价约为1:1 500,回收率约为80%,纯度可达83%.纯化的多抗有效消除了与金黄葡萄球菌的非特异性交叉反应.结论 已制备出高特异性的长双歧杆菌多克隆抗体,可用于长双歧杆菌制剂的菌体检测.

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