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MTB线粒体翻译控制28蛋白在昆虫细胞中的表达和纯化
对MTB线粒体翻译控制(mitochondrial translation control,MTC) 蛋白MTC28基因进行克隆, 构建真核表达质粒并在昆虫细胞中表达MTC28蛋白.采用PCR技术从MTB H37Rv 标准株基因组中扩增MTC28基因片断,MTC28基因片断和质粒pFastbac1经EcoRI和XhoI双酶切,T4 DNH连接酶连接,构建重组质粒pFastbac1-MTC28,转染DH5α感受态细菌,在含有氨苄青霉素溶菌肉汤(lysogeny broth,LB)固体培养基中筛选阳性克隆,挑选生长的菌落进而在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中进行细菌克隆.PCR鉴定目的基因插入质粒后,阳性克隆细菌进行质粒(pFastbac1-MTC28)的提取.pFastbac1-MTC28质粒转染DH10 Bac感受态细菌构建重组杆状质粒(Bacmid-MTC28),用含有庆大霉素、卡那霉素和四环素的液体LB培养基进行细菌克隆,采取蓝白斑技术筛选阳性菌落.PCR鉴定为阳性的细菌进行杆状重组质粒(Bacmid-MTC28)的提取.利用脂质介导的转染技术,将杆状重组质粒(Bacmid-MTC28)转染sf9昆虫细胞中,包装重组杆状病毒,并表达蛋白质.结果成功构建了MTC28真核表达质粒,建立了杆状病毒表达MTC28蛋白的表达体系,并表达MTC28蛋白,通过纯化获得了高纯度且均一化的MTC28蛋白.
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线粒体内膜蛋白Mic60半量缺失与小鼠心脏衰老的相关性
目的 初步探索线粒体内膜蛋白Mic60与小鼠心脏衰老的关系.方法 将野生型及Mic60杂合缺失雄性小鼠分为青年组(4~6个月龄,6对)及老年组(18~20个月龄,9对),取心脏,制作石蜡、冷冻切片,提取组织蛋白.应用苏木精-伊红、Masson染色法鉴定小鼠心脏组织形态学变化;衰老相关β-半乳糖苷酶染色检测小鼠心肌组织中β-半乳糖苷酶活性;应用免疫印迹法检测野生型小鼠心肌组织中Mic60的表达及各组小鼠心肌组织中衰老相关蛋白p21的表达.结果 野生小鼠心肌组织中Mic60蛋白表达呈现年龄依赖性增高.Mic60杂合缺失导致老年小鼠左心室壁肥厚[(1.32±0.09)mm比(1.12±0.09)mm,P<0.05]、心肌细胞肥大[(474.9±27.6)μm2比(358.8±48.7)μm2,P<0.05]及心肌间质纤维化面积增多[(38.24±7.58)×103μm2比(25.81±4.12)×103μm2,P<0.05],但对年轻小鼠无显著影响.同时,Mic60杂合缺失导致老年小鼠心脏衰老相关β-半乳糖苷酶活性上调(2.26±0.24比0.25±0.05,P<0.01),对年轻小鼠无明显影响.另外,Mic60杂合缺失老年小鼠心肌组织中衰老相关蛋白p21表达显著增加(P<0.01).结论 通过对青年及老年组小鼠心脏衰老相关指标的检测,发现Mic60半量缺失可导致老年小鼠心肌肥厚、心肌间质纤维化及衰老相关β-半乳糖苷酶活性上调和衰老相关蛋白p21表达增加,提示线粒体内膜蛋白Mic60可能与小鼠心脏衰老有关.
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解偶联蛋白3在2型糖尿病发生发展中的作用
解偶联蛋白3(UCP3)是解偶联蛋白家族成员之一,系线粒体内膜上阴离子转运蛋白,主要通过质子漏的作用降低线粒体膜内外电化学梯度,影响电子呼吸链,从而使ATP和活性氧的产生减少,使能量以热能的形式释放.UCP3主要在骨骼肌中表达,而骨骼肌是机体外周摄取葡萄糖的主要组织,同时骨骼肌胰岛素抵抗是2型糖尿病患者的主要缺陷,故人们推测,解偶联蛋白3可能在2型糖尿病的发生发展中发挥重要作用.深入探索UCP3在2型糖尿病中的作用有助于为2型糖尿病的治疗提供一个新的治疗靶点.
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高脂喂养及罗格列酮干预对老年大鼠骨骼肌线粒体功能的影响
目的 观察高脂饮食和罗格列酮干预对老年大鼠骨骼肌过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)和线粒体融合蛋白2(Mfn2)表达的影响. 方法 21～23月龄Wistar大鼠分为老年对照组、高脂组和高脂+罗格列酮干预组(干预组),并设4～5月龄Wistar大鼠作为青年对照组.应用正常葡萄糖高胰岛素钳夹技术评价胰岛素敏感性,高脂喂养第8周时,检测骨骼肌PGC-1α和Mfn2的mRNA及蛋白表达.结果高脂喂养8周后,青年对照组、老年对照组和高脂组空腹血游离脂肪酸[(0.68±0.18)mmol/L、(0.82±0.23)mmol/L和(1.53±0.40)mmol/L],三酰甘油[(0.53±0.13)mmol/L、(0.63±0.17)mmol/L和(1.08±0.30)mmol/L],骨骼肌三酰甘油[(1.09±0.17)mmol/L、(1.34±0.20)mmol/L和(2.07±0.30)mmol/L]均升高,葡萄糖输注率((30.4±4.2)mg·kg~(-1)·min~(-1)、(20.9±2.2)mg·kg~(-1)·min~(-1)和(12.0±1.9)mg·kg~(-1)·min~(-1)]下降;经过罗格列酮干预后游离脂肪酸[(0.93±0.29)mmol/L]、三酰甘油[(0.62±0.12)mmol/L]及骨骼肌三酰甘油[(1.68±0.28)mmol/L)]均明显下降,葡萄糖输注率[(16.7±1.7)mg·kg~(-1)·min~(-1)]升高.与青年对照组比较,老年对照组骨骼肌PGC-1α和Mfn2的表达下降,经高脂喂养后PGc-1α和Mfn2的表达进一步下降,干预组上述基因的表达均显著高于高脂组(P<0.05),但仍比老年对照组降低(P<0.05). 结论 高脂饮食可诱导老年大鼠产生IR,推测可能与骨骼肌PGC-1α和Mfn2的表达下降有关;罗格列酮可通过改变骨骼肌PGC-1α和Mfn2的表达增加胰岛素敏感性.
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C1QBP基因在绒毛膜癌耐药细胞株中的表达及其与耐药的关系
目的 检测补体成分1Q亚成分结合蛋白(C1QBP)基因在绒毛膜癌(绒癌)耐药细胞株及其亲本细胞株中的表达差异,探讨以C1QBP基因为靶向的RNA干扰能否有效逆转绒癌耐药细胞株对相应化疗药物的耐药性.方法 (1)通过实时荧光定量PCR技术、蛋白印迹法和细胞免疫荧光法检测绒癌耐药细胞株,即氟脲嘧啶脱氧核苷(FUDR)耐药细胞株JeG-3/FUDR、甲氨蝶呤(MTX)耐药细胞株JeG-3/MTX、依托泊苷(VP-16)耐药细胞株JeG-3/VP、放线菌素D(ACTD,又称KSM)耐药细胞株JeG-3/KSM细胞,以及亲本细胞株JeG-3细胞中C1QBP mRNA和蛋白的表达及蛋白定位.(2)靶向构建C1QBP基因的短发夹状RNA(shRNA),包装成C1QBP基因RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,即C 1QBP-RNAi-LV,转染绒癌耐药细胞,实时荧光定量PCR技术及蛋白印迹法检测转染后绒癌耐药细胞株JeG-3/FUDR细胞和亲本细胞株JeG-3细胞中C1QBP mRNA和蛋白的表达,活细胞计数(CCK-8)法检测各绒癌耐药细胞的药物敏感性的变化.结果 (1)转染前绒癌耐药细胞株JeG-3/FUDR、JeG-3/MTX、JeG-3/VP、JeG-3/KSM细胞中C1QBP mRNA表达水平分别为2.520±0.680、1.770±0.230、1.940±0.090、1.740±0.350,均明显高于亲本细胞株JeG-3细胞(为1.000),差异均有统计学意义(P＜0.05).4种绒癌耐药细胞中C1QBP蛋白表达强度均高于亲本细胞株JeG-3细胞;绒癌耐药细胞和亲本细胞中均存在C1QBP蛋白的表达,均定位于细胞内的线粒体.(2)转染后绒癌耐药细胞株JeG-3/FUDR细胞中C1QBP mRNA表达水平下调了93.1％(P＜0.01),C1QBP蛋白表达完全被抑制.(3)转染后绒癌耐药细胞株JeG-3/FUDR、JeG-3/MTX、JeG-3/VP和JeG-3/KSM细胞的耐药指数较其相应RNAi阴性对照分别下降了86.3％、93.9％、92.8％和89.9％,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 C1QBP基因在绒癌耐药细胞株中表达明显增高,沉默C1QBP基因表达可以有效逆转绒癌耐药细胞株对相应化疗药物的耐药性.
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高氧暴露胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞线粒体蛋白质组学初步研究以及ND4动态表达
目的 初步分析高氧暴露下肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial cellⅡ,AEC Ⅱ)线粒体蛋白质表达谱的改变并就NADH脱氢酶亚单位4(NADH-dehydrogenase subunit 4,ND4)的动态表达进行研究.方法 原代培养胎鼠AECⅡ并随机分为空气组和高氧组,采用双向电泳检测线粒体蛋白差异性表达,运用RT-PCR和Western blot方法分别检测ND4 mRNA及其蛋白表达.结果 与空气组比较,高氧暴露24 h导致55种AECⅡ线粒体蛋白质出现差异性表达;高氧暴露6、12、24和48 h,原代胎鼠AECⅡ ND4 mRNA(1.20±0.12,1.20±0.12,0.69±0.07和1.54±0.10)表达均较对照组(2.35±0.13,4.61±0.43,2.155=0.14和2.21±0.21)显著降低,差异均有统计学意义(P均<0.01).高氧暴露12和24 h时,原代胎鼠AECⅡ ND4蛋白表达(1.58±0.21和1.33±0.10)较对照组(2.77±0.19和2.23±0.05)下降,差异有统计学意义(P均<0.01).结论 高氧暴露导致AECⅡ线粒体(包括呼吸链)功能状态改变可能是促使肺损伤发生发展的重要因素.
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Smac基因的克隆及其对Burkitt's淋巴瘤细胞的促凋亡作用
目的克隆人促凋亡基因(second mitochondria-derived activator of caspases,Smac),研究Smac基因转染对Burkitt's淋巴瘤Raji细胞的促凋亡作用.方法从人胚肾293细胞中扩增人Smac基因全长的cDNA;构建含Smac基因全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.1/Smac,并转染人Burkitt's淋巴瘤Raji细胞;用Western blot测定外源基因的表达;Hoechest 33 258和碘化丙锭双荧光染色,结合激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡形态;流式细胞仪分析细胞凋亡百分率;比色法测定caspase-3酶活性.结果成功克隆人Smac基因全长cDNA,并构建真核表达载体pcDNA3.1/Smac;转染人Smac基因全长cDNA的真核表达载体24 h,可显著诱导Burkitt's淋巴瘤Raji细胞的凋亡,凋亡百分率达(43.7±2.5)%;转染人Smac基因全长cDNA的真核表达载体24 h,可显著诱导Raji细胞中caspase-3酶活性上调,吸光度为0.936±0.041,与正常对照组(0.138±0.026)及空载体转染对照组(0.136±0.036)相比,P <0.05.结论转染并表达外源性Smac基因,可显著诱导人Burkitt's淋巴瘤Raji细胞凋亡.其机制可能与caspase-3酶活性上调有关.
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Citrin缺陷导致的新生儿肝内胆汁淤积症家系SLC25A13基因突变研究
目的 探讨一个来自中国的Citrin缺陷导致的新生儿肝内胆汁淤积症(NICCD,MIM#605814)家系的基因诊断过程.方法 从先证者及其所在家系其他9名成员的血样中提取DNA,PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳,初步发现2个突变,并用本实验室建立的基因扫描法进一步证实,然后行DNA测序,终确定突变位置和性质.结果 先证者为851-854 del和1638-1660 dup两种突变的复合杂合子,两种突变分别位于SLC25A13基因外显子9和外显子16.母亲及哥哥为851-854 del携带者,父亲、一个姑姑及其子为1638-1660 dup携带者.结论 该家系中SLC25A13基因外显子9和16分别发生了缺失突变851-854 del和插入突变1638-1660 dup.
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夏科-马里-图斯病2A2型一家系的临床病理特点
目的 报道一个早发型夏科-马里-图斯病(CMT)2A2家系,探讨其临床和病理特点.方法 该家系共有5例患者,呈常染色体显性遗传,先证者为36岁女性,6岁开始出现下肢进行性无力,8岁出现双足内翻.家族中另有2例男性和2例女性发病,发病年龄3～7岁,主要表现为缓慢进展的四肢远端肌肉无力、萎缩,伴随四肢远端感觉减退、腱反射减退及关节挛缩.先证者和其儿子的上肢感觉神经、下肢感觉和运动神经诱发电位波幅不能引出.对先证者左侧腓肠神经进行活体组织病理检查.对先证者和其他4例家系患者、3名无症状家系成员行MFN2基因测序.结果 病理检查可见腓肠神经有髓纤维数目重度减少,以大有髓神经纤维减少为主,伴随个别有髓神经纤维再生簇结构以及不典型的洋葱球样结构.电镜下可见轴索中线粒体聚集,未发现线粒体结构异常.5例患者存在MFN2基因R94W突变,无症状家系成员无此突变.结论 我国存在早发型CMT2A2家系,患者周围神经缺乏有髓神经纤维再生改变,提示MFN2基因突变对神经元的损害更大.
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线粒体融合蛋白2基因突变致夏科-马里-图斯病2A2亚型的表型分析
目的 探讨夏科-马里-图斯病2型(CMT2)患者线粒体融合蛋白(MFN2)基因突变特征及临床变异性.方法 收集临床拟诊的8个常染色体显性遗传CMT2家系和24个散发CMT2病例,采用PCR技术和直接测序方法进行MFN2基因突变检测,详细分析阳性病例的临床表型.结果 在32例拟诊CMT2病例中共检测出4种MFN2基因的错义突变,检出率为12.5%.其中c.281G＞A(R94Q)和c.2240 T＞C(M747T)分别见于2个常染色体显性遗传家系,同一家系内部存在表型差异;c.1090 C＞T(R364W)和c.2198 T＞C(L733P)分别见于2例散发病例,后者为首次报道的新突变,除四肢远端萎缩无力外,前者伴视神经萎缩,后者伴皮肤过度角化.结论 MFN2基因突变为中国人群CMT2型常见病因,通过分析CMT2A2患者的临床表型,提示该组疾病具有高度的临床变异性.
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大鼠癫(癎)持续状态后海马内X-连锁凋亡抑制蛋白及其负性调控因子的表达
目的 研究大鼠癫(癎)持续状态(SE)后海马组织中X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)及其负性调控因子Smac、HtrA2、XAF1的表达变化.方法 建立氯化锂-匹罗卡品致(癎)大鼠SE模型,应用免疫组织化学染色和Western blot方法检测大鼠SE后各时点海马CA3区XIAP、Smac、HtrA2、XAF1及半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3蛋白的表达.结果 SE后大鼠海马CA3区XIAP蛋白呈弥散性分布于整个神经元内,SE后2 h(0.5503±0.0172)起逐渐增高(t=115.87),8 h(0.6221±0.0238)达高峰(t=136.69).与对照组(0.1507±0.0165)比较,差异有统计学意义(P<0.01).Same、HtrA2及XAF1蛋白在对照组弱表达,在SE后呈弥散性分布于整个神经元内.2～72 h增高.海马CA3区caspase-3活性蛋白在对照组呈阴性,在SE后4～72 h明显增高.Western blot发现,SE组各时间点XIAP蛋白表达量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),Smac、HtrA2及caspese-3蛋白在对照组很少表达,在SE后2～72 h增高(P<0.01).结论 XIAP及其负性调控因子Smac、HtrA2、XAF1涉及了SE后神经元凋亡的调节,参与了SE后神经元损伤.
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氢对脓毒症小鼠心肌线粒体Drp1表达的影响
目的 评价氢对脓毒症小鼠心肌线粒体Drp1表达的影响.方法 清洁级健康雄性ICR小鼠54只,6周龄,体重20～ 25 g,采用随机数字表法分为3组(n=18):假手术组(S组)、脓毒症组(Sep组)和氢气组(H2组).采用盲肠结扎穿孔法制备小鼠脓毒症模型.H2组术后1和6h时吸人2％氢气1h.术后1 d时处死小鼠取心脏,观察病理学结果并进行评分,观察心肌细胞凋亡情况.分离心肌线粒体,采用Clark氧电极法检测呼吸控制率(RCR),萤光素酶法检测ATP含量,Western blot法检测Drp1表达.结果 与S组比较,Sep组和H2组心肌组织病理学评分和细胞凋亡率升高,线粒体RCR和ATP含量降低,Drp1表达上调(P＜0.05);与Sep组比较,H2组心肌组织病理学评分和细胞凋亡率降低,线粒体RCR和ATP含量升高,Drp1表达下调(P＜0.05).结论 氢减轻脓毒症小鼠心肌损伤的机制与下调Drp1表达,改善线粒体功能有关.
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PKCα/HO-1信号通路在内毒素诱发大鼠肺泡巨噬细胞损伤中的作用:与Mfn1的关系
目的 评价蛋白激酶Cd(PKCα)/血红素加氧酶-1(HO-1)信号通路在内毒素诱发大鼠肺泡巨噬细胞损伤中的作用及其与线粒体融合蛋白-1(Mfn1)的关系.方法 将体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞以1×104个/ml密度接种于96孔板中.采用随机数字表法分为5组(n=15):对照组(C组)、内毒素攻击模型组(E组)、PKCα抑制剂Go6976组(G组)、PKCα激动剂PMA组(P组)和二甲基亚砜组(D组).采用给予10 μg/ml LPS刺激NR8383细胞的方法制备肺泡巨噬细胞内毒素攻击模型.G组、P组和D组于LPS刺激前30 min分别给予5μmol/L Go6976、100nmol/L PMA、0.1％二甲基亚砜预处理30 min,冉给予10 μg/ml LPS,各组均孵育24 h后收集细胞,检测丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用Western blot法及q-PCR法检测PKCα、HO-1和Mfn1的表达.结果 与C组比较,E组、G组、P组和D组MDA和ROS含量升高,SOD活性降低,PKCα、HO-1及其mRNA表达上调,Mfn1及其mRNA表达下调(P＜0.05);与E组比较,G组MDA和ROS含量升高,SOD活性降低,PKC α、HO-1、Mfn1及其mRNA表达下调,P组MDA和ROS含量降低,SOD活性升高,PKCα、HO-1、Mfn1及其mRNA表达上调(P＜0.05),D组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05).结论 PKCα/HO-1信号通路激活后促进Mfn1表达是内毒素诱发大鼠肺泡巨噬细胞损伤时的内源性保护机制.
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线粒体融合-分裂在大鼠内毒素性急性肺损伤中的作用
目的：评价线粒体融合?分裂在大鼠内毒素性急性肺损伤中的作用。方法健康雄性SD大鼠20只，体重160～180 g，2月龄，采用随机数字表法，将其分为2组（ n＝10）：正常对照组（ C组）及内毒素性急性肺损伤组（L组）。 L组静脉注射LPS 5 mg∕kg，C组给予等容量生理盐水0．5 ml，给予LPS后6 h时处死大鼠，取肺组织，测定湿重∕干重（ W∕D）比值、超氧化物歧化酶（ SOD）活性和丙二醛（ MDA）含量；测定线粒体融合相关蛋白[线粒体融合蛋白1（ Mfn1）、线粒体融合蛋白2（ Mfn2）和视神经萎缩蛋白1（OPA1）]及其 mRNA 的表达，并测定线粒体分裂相关蛋白[动力相关蛋白1（ Drp1）和分裂蛋白1（ Fis1）]及其mRNA的表达。结果与C组比较，L组肺组织W∕D比值和MDA含量升高，肺组织SOD活性降低；肺组织Mfn1、Mfn2和OPA1及其mRNA的表达下调，肺组织Drp1和Fis1及其mRNA的表达上调（ P＜0．05）。 L组肺组织病理学损伤明显重于C组。结论大鼠内毒素性急性肺损伤的机制与线粒体融合减少、分裂增多导致氧化应激反应增强有关。
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PI3K/Akt信号通路在内毒素攻击大鼠肺泡上皮细胞时一氧化碳上调线粒体融合蛋白中的作用
目的 评价1-磷酯酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)信号通路在内毒素攻击大鼠肺泡上皮细胞时一氧化碳(CO)上调线粒体融合蛋白表达中的作用.方法 将肺泡上皮细胞用含10％胎牛血清的1％青链双抗F12K完全培养基于37℃、5％CO2的培养箱中培养,采用随机数字表法分为10组(n=5):对照组(C组);内毒素组(L组)向培养基中加入10 μg/ml脂多糖(LPS);LPS+外源性CO释放剂CORM-2组(L+CO组)向培养基中加入CORM-2 100 μmol/L,1h后向培养基中加入10 μg/ml LPS;LPS+PI3K抑制剂LY294002组(L+ LY组)向培养基中加入25 μmol/LLY294002,1h后向培养基中加入10 μg/ml LPS;LPS+外源性CO释放剂CORM-2+ PI3K抑制剂LY294002组(L+CO+LY组)向培养基中加入25 μmol/L LY294002,1h后向培养基中加入CORM-2 100μmol/L,1h后向培养基中加入10 μg/ml LPS;LPS+无活性的CO释放剂iCORM-2组(L+iCO组)向培养基中加入iCORM 100 μmol/L,1h后向培养基中加入10 μg/ml LPS;LPS+二甲基亚砜(DM-SO)组(L+D组)向培养基中加入等浓度DMSO,1h后加入1μg/ml LPS;外源性CO释放剂CORM-2组(CO组)向培养基中加入CORM-2 100 μmol/L;PI3K抑制剂LY294002组(LY组)向培养基中加入25 μmol/L LY294002;外源性CO释放剂CORM-2+PI3K抑制剂LY294002组(CO+LY组)向培养基中加入25 μmol/L LY294002,1 h后向培养基中加入CORM-2 100 μmol/L.孵化24h后收集细胞,检测MDA含量和SOD活性,采用Western blot法检测血红素氧合酶-1(HO-1)、磷酸化Akt(p-Akt)、线粒体融合蛋白1(Mfn1)、Mfn2和视神经萎缩蛋白1(OPA1)的表达.结果 与C组比较,L组、L+CO组、L+LY组、L+CO+LY组、L+iCO组、L+D组MDA含量升高,SOD活性降低,L组HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1、p-Akt表达上调(P＜0.05);与L组比较,L+CO组MDA含量降低,SOD活性升高,L+LY组MDA含量升高,SOD活性降低,L+CO组HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1、p-Akt表达上调,L+LY组HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1、p-Akt表达下调(P＜0.05);与L+CO组比较,L+CO+LY组MDA含量升高,SOD活性降低,HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1、p-Akt表达下调(P＜0.05).结论 内毒素攻击大鼠肺泡上皮细胞时CO上调线粒体融合蛋白表达的机制与激活PI3K/Akt信号通路有关.
关键词： 1-磷酯酰肌醇3-激酶 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 内毒素类 一氧化碳 肺泡 上皮细胞 线粒体蛋白质类 -
葡萄糖调节蛋白78调控乙型肝炎相关性肝细胞癌患者线粒体生成蛋白的表达及临床分析
目的 研究葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在乙型肝炎相关性肝细胞癌组织中的表达及其与患者临床病理特征的关系,探索GRP78对肝癌细胞中线粒体生成相关蛋白分子的调控,为建立肝癌防治的新策略提供基础.方法 收集乙型肝炎相关性肝细胞癌54例患者组织标本,用免疫组化和Western Blot检测肝癌及癌旁组织中GRP78、Lon、TFAM、COXⅣ的表达;用siRNA干涉肝癌细胞中GRP78的表达,检测细胞中GRP78、Lon、TFAM、COxⅣ的表达;用实时定量PCR(qRT-PCR)检测临床标本和干涉GRP78表达后肝癌细胞中线粒体DNA (mtDNA)的水平;对临床资料和实验数据进行统计分析.计量资料2组间比较比较采用t检验,计数资料2组间比较采用Fisher精确检验,患者生存分析采用Kaplan-Meier法.结果 GRP78及Lon在乙型肝炎相关性肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织(t值分别为9.135、5.523,P值均＜0.001),而线粒体生成相关蛋白TFAM、COXⅣ的表达及mtDNA水平显著低于癌旁组织(t值分别为2.765、4.260、12.280,P值分别为0.011、＜0.001、＜0.001).干涉肝癌细胞中GRP78的表达,可显著提高线粒体生成相关蛋白TFAM、COXⅣ的表达及mtDNA水平(P值均＜0.05).GRP78在不同肿瘤数量、门静脉癌栓以及肿瘤分期的病例中,表达水平存在显著差异(P值分别为0.016、0.003、0.045);GRP78低表达患者术后总生存期及无复发生存期优于GRP78高表达的患者(x2值分别为5.006、4.995,P值分别为0.025、0.026).结论 GRP78对线粒体维持与生成具有潜在的调控作用,对建立潜在的肝癌防治新策略具有重要的临床指导意义.
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体外培养乳腺癌细胞线粒体差异蛋白的筛选
目的 比较体外培养的乳腺癌细胞与正常乳腺细胞线粒体蛋白指纹图谱,筛选差异蛋白,为乳腺癌亚细胞蛋白标志物的研究奠定基础.方法 提取乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7及正常乳腺细胞株HBL-100线粒体蛋白,表面增强激光解析蛋白飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)检测蛋白表达,Biomarker Wizard Software分析软件统计结果,筛选差异蛋白,并探讨溶剂及长期冻存对结果分析的影响.结果 在相对分子质量2 000～100 000范围内检测到近200个蛋白峰,HBL-100与MDA-MB-231和MCF-7细胞相比,差异蛋白峰分别为45个和36个(P＜0.05),其中相对分子质量9 200、13 800、14 000和22 500的蛋白在2株癌细胞中表达均下降,相对分子质量10 000和11 600的蛋白在2株癌细胞中表达均升高.4‰的TritonX-114及冻存3～6个月对结果分析无影响.结论 SELDI-TOF-MS能够快速、灵敏地检测分析乳腺癌线粒体差异表达蛋白,为亚细胞水平乳腺癌标志物的研究提供了新的思路.
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蜂毒素对人肝癌细胞线粒体膜蛋白7A6和凋亡相关基因产物Fas及其配体FasL表达的影响
目的:观察蜂毒素对BEL-7402人肝癌细胞线粒体膜蛋白7A6和凋亡相关基因产物Fas及其配体FasL(Fas ligand)表达的影响,探讨其诱导肝癌细胞凋亡的作用机制.方法:BEL-7402肝癌细胞体外培养,经蜂毒素处理后,采用流式细胞仪测定线粒体膜蛋白7A6和凋亡相关基因产物Fas及其配体FasL表达,反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)方法半定量检测Fas和FasL mRNA表达.结果:经8、16、32μg/ml蜂毒素处理后,BEL-7402细胞线粒体膜蛋白7A6表达率由对照组的1.02%,分别上升到4.89%、17.74%和11.45%;细胞表面Fas蛋白表达明显增加,FasL表达没有变化;RT-PCR扩增结果显示,32μg/ml蜂毒素处理细胞后,Fas灰度比值高于对照组,没有扩增出FasL表达条带.结论:蜂毒素诱导肝癌细胞凋亡可能与影响线粒体膜蛋白7A6表达及凋亡相关基因产物Fas及其配体FasL信号传导途径有关.
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右旋柠檬烯诱导人白血病细胞凋亡作用机制的初步研究
目的:探讨右旋柠檬烯(d-limonene)诱导人白血病细胞凋亡的作用机制.方法:以人白血病细胞株K562和HL-60为研究对象,采用MTT法及锥虫蓝染色法检测d-limonene对细胞增殖的影响,Annexin V/PI双重染色法检测其对细胞凋亡的影响,Western印迹法检测线粒体凋亡途径相关蛋白的表达.结果:d-Limonene作用后K562、HL-60细胞凋亡率呈时间及剂量相关性增加;且处理组Bcl-2/Bax比值下降,细胞质中细胞色素c表达增高,caspase-9表达以及caspase-3分裂明显增高.结论:d-limonene能够诱导人白血病细胞凋亡,线粒体凋亡途径的激活可能是其凋亡诱导的主要机制.
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线粒体促凋亡蛋白Smac/DIABLO及其与肿瘤的关系
Smac/DIABLO即第2个线粒体衍生的半胱天冬蛋白酶激活剂/低pI的IAP直接结合蛋白,是近年发现的一种线粒体促凋亡蛋白,存在于线粒体并通过拮抗凋亡抑制蛋白(IAPs)的作用激活caspase-9和caspase-3而诱导细胞凋亡,并可促进肿瘤坏死因子相关的凋亡促使配体(TRAIL)诱导的凋亡.Smac/DIABLO还可以通过其N-或C-末端促进肿瘤细胞凋亡、增强肿瘤免疫及影响肿瘤细胞周期等机制抗肿瘤,并且增加肿瘤对放化疗的敏感性.本文主要就Smac/DIABLO的结构功能、作用机制及与肿瘤发生和治疗的关系作一综述.
关键词： 肿瘤 Smac/DIABLO 线粒体蛋白质类 促凋亡蛋白质类 凋亡抑制蛋白类
