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内含肽介导的重组人干扰素α2a的原核表达及其生物学活性
目的 原核表达内含肽介导的重组人干扰素α2a(rhIFNα2a)融合蛋白,并检测其生物学活性.方法 以质粒pBV220-IFN-α2a为模板PCR扩增rhIFNα2a基因,将其插入原核表达载体pTWIN1的内含肽Ssp DnaB基因下游的多克隆位点,构建重组表达质粒pTWIN1-rhIFNα2a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行SDSPAGE及Western blot分析,并对裂菌上清的生物学活性进行测定.结果 双酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入表达载体中；rhIFNα2a蛋白的相对分子质量约44 300,表达量占全菌总蛋白的30％,在裂菌上清中的表达量占目的蛋白的25％,可与小鼠抗hIFNα单克隆抗体特异性结合；裂菌上清中rhIFNα2a蛋白的活性为5.57×107 IU/ml,表明该重组蛋白具有良好的IFN抗病毒活性.结论 已成功在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达了具有生物学活性的可溶性重组rhIFNd2a与内含肽Ssp DnaB融合蛋白,为大量生产IFNα2a提供了新的思路.
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干扰素α2a与白细胞介素-2联合作用对体外HepG2.2.15细胞增殖及乙型肝炎病毒复制的影响
目的 探讨干扰素α2a(interferonα 2a,IFNα2a)与白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)联合作用对体外肝癌细胞HepG2.2.15增殖及乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的影响.方法 用不同浓度的IFNα2a(5 000、10 000、15 000 IU/ml)和IL-2(2 500、5 000、10 000 IU/ml)单独及联合作用HepG2.2.15细胞96 h后,采用WST-1法检测细胞增殖情况,倒置相差显微镜观察联合作用组细胞形态学变化,ELISA法检测联合作用组细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达,斑点杂交法检测联合作用组细胞HBV-DNA的复制情况.结果 与不同浓度的IFNα2a和IL-2单独作用相比,二者联合作用对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用明显增强(P＜0.05);IFNα2a与IL-2联合作用组HepG2.2.15细胞显微镜下可见细胞逐渐变圆,胞浆中颗粒增多,增殖变慢,细胞间接触不紧密,细胞周围碎片增多；联合作用组细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达明显受到抑制(P＜0.05)；5 000 IU/ml IFNα2a+10 000 IU/ml IL-2、10 000 IU/ml IFNα2a+10 000 IU/ml IL-2和15 000 IU/ml IFNα2a+10 000 IU/ml IL-2对HepG2.2.15细胞HBV-DNA的复制有抑制作用.结论 IFNα2a与IL-2联合作用对HepG 2.2.15细胞增殖及HBV-DNA复制均有抑制作用.本实验为后续体内动物实验及筛选合适的疫苗佐剂奠定了基础,也为新型乙型肝炎疫苗及治疗性乙型肝炎疫苗的研究提供了参考.
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单磷酸阿糖腺苷联合白细胞介素-2、乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗治疗慢性乙型肝炎疗效观察
目的研究单磷酸阿糖腺苷联合白细胞介素-2、乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗治疗慢性乙型肝炎的临床疗效.方法选择68例慢性乙型肝炎患者分为两组,治疗组用单磷酸阿糖腺苷联合应用白细胞介素-2、乙肝免疫球蛋白、乙肝疫苗,对照组用干扰素α2a,评估两组肝功能及乙型肝炎病毒复制的近、远期疗效.结果两组ALT复常率、HBeAg及HBV DNA阴转率均无明显差异(P>0.05).结论初步结果显示单磷酸阿糖腺苷联合白细胞介素-2、乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗治疗慢性乙型肝炎有一定的效果.
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干扰素联合激光治疗女性尖锐湿疣54例临床观察
目的:探讨治疗女性生殖器尖锐湿疣,减少复发率的方法.方法:对照组45例,单纯用激光治疗,治疗组54例,用激光配合肌内注射干扰素α 2a300万U,qod,10d为1个疗程.结果:两组临床治愈率均为100.0%,而复发率对照组33.33%,治疗组7.41%,差异有极显著性(χ2=55.58,P<0.01).结论:激光加干扰素α2a全身治疗女性生殖器尖锐湿疣是一种复发率低的好方法.
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卡介苗穿梭质粒pMSIFN-α2a的构建与鉴定
目的 构建分泌性表达IFN-α2a的卡介苗重组质粒.方法 分别以卡介苗(BCG)和IFN-α2a cDNA为模板,通过PCR扩增得到约117bp的BCG-Ag85B信号肽序列和495bp的IFN-α2a基因序列.将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌-卡介苗穿梭表达载体pMV261重组,得到重组质粒pMS.再将IFN-α2a基因序列克隆至pMS中,得到重组质粒pMSIFN-α2a.结果 质粒pMSIFN-α2a用双酶切和PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因BCG-Ag85B和IFN-α2a正确插入载体pMV261.结论 重组质粒pMSIFN-α2a可望在BCG中分泌性表达细胞因子IFN-α2a,从而促进IFN-γ的释放,该质粒的构建成功为改造卡介苗、发展新型抗膀胱肿瘤疫苗奠定了基础.
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IFN-α对SNI神经源性疼痛模型小鼠中的镇痛作用
目的:研究IFN-α 2a在小鼠SNI神经痛模型中的镇痛作用.方法:采用SNI疼痛模型小鼠,以Von Frey Filaments刺激法和冷盘法测定腹腔给予IFN-α 2a的镇痛作用,并测定阿片肽受体拮抗剂纳洛酮对其镇痛作用的阻断.结果:① IFN-α 2a的给药剂量为1 000 U/g体重时,基本无镇痛作用;剂量为5 000 U/g体重时,给药后30 min有明显的镇痛作用,持续5-20 min;剂量为10 000 U/g时,镇痛作用可维持50-60 min.②纳洛酮可以完全阻断IFN-α 2a的镇痛作用.结论:① IFN-α 2a 在小鼠SNI模型中具有镇痛作用,且呈剂量效应.② IFN-α的镇痛作用可能通过阿片受体传导.
关键词： 干扰素α2a 坐骨神经分支选择损伤模型 神经源性疼痛 镇痛 -
阿德福韦酯联合干扰素α2a治疗乙型肝炎病毒临床观察
目的 了解阿德福韦酯联合干扰素α2a抗乙型肝炎病毒的治疗效果.方法 选择52例慢性乙型肝炎患者(联合治疗组),口服阿德福韦酯10mg/d,疗程12个月,同时肌注干扰素α2a500万u/d,连用20天后改为隔日肌注1次,疗程6个月.25例乙型肝炎患者单服阿德福韦酯;26例乙型肝炎患者单用干扰素α2a,疗程、用法、用量同联合治疗组.乙型肝炎病毒标志采用酶联免疫吸附法检测,HBV DNA采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测.结果 联合治疗组HBVDNA、HBeAg、HBsAg、ALT阴转率均高于单用阿德福韦酯或干扰素α2a(P<0.05或0.01).结论 阿德福韦酯联合干扰素α2a抗乙型肝炎病毒优于单一用药.
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苦参素治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的疗效观察
目的 观察苦参素治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的疗效.方法 将57例入选患者随机分两组,治疗组30例,肌注干扰素α2a 300万U/日,连用20天后改隔日一次,疗程6个月,同时加用苦参素注射液0.6/日,连续静滴2个月,后改为口服苦参素软胶囊0.2 g,每天3次,连续4个月.对照组27例,只肌注干扰素α2a 300万U/日,连用20天后改隔日一次,疗程6个月.结果 两组治疗后血清肝纤维化指标均下降,但治疗组疗效明显优于对照组(P＜0.05或0.01).结论 苦参素治疗慢性乙型肝炎肝纤维化有明显疗效.
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聚乙二醇对LL-37与干扰素-α2a融合蛋白的修饰条件优化
聚乙二醇(PEG)修饰是延长蛋白药物体内半衰期和降低免疫原性的有效途径.经过单因素实验,探索了PEG对LL-37与干扰素(IFN)-α2a融合蛋白修饰的佳工艺条件,分别为:PEG分子量为5 000、融合蛋白浓度为0.6 mg/mL、蛋白与PEG5000的物质的量之比为1:10、反应温度为4℃、反应时间为4h、pH为9.0.经正交实验表明,3个主要因素对蛋白修饰率的影响顺序为融合蛋白浓度＞蛋白mPEG5000-SS的物质量之比＞pH,佳工艺条件为融合蛋白浓度为0.6 mg/mL、蛋白与mPEG5000-SS的物质的量之比为1:10、pH为8.8.在佳修饰条件下,三次平行实验的平均蛋白修饰率为86.98％.在佳修饰条件下,蛋白的修饰率可稳定达到85％以上,LL-37与IFN-α2a融合蛋白的干扰素活性保持率为58％以上,抗菌活性的保持率可达到97％以上.
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重组人干扰素α2a和GFE-1多肽融合基因的克隆、表达及活性测定
目的:构建IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因表达载体,获得高质量生物产品.方法:应用聚合酶链式反应技术(PCR)对干扰素(IFN)α2a3'端酶切位点进行改造,人工合成编码能特异性高效结合肺组织的GFE-1寡核苷酸片段,二者连接后克隆入pGEM3Zf质粒,进行序列分析,将融合蛋白基因克隆入pBV220表达载体,在大肠杆菌中表达,对IFN-α2a-GFE-1表达产物纯化、鉴定及体外活性检测.结果:利用PCR的方法成功地改造了IFN-α2a 3'端酶切位点,成功的将GFE-1多肽与IFN-α2a 3'端连接,构建了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白的基因克隆载体pGEM3Zf-GFE-1,DNA测序完全正确.构建了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因原核表达载体pBV220-IFN-α2a-GFE-1,经温度诱导在大肠杆菌中有效表达.纯化了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯度大95%,比活性达5.8×109U/mg.结论:IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因的成功克隆、表达、纯化和活性测定,为研制一种具有导向性治疗肺癌、肺纤维化等疾病的有效药品奠定基础.
