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脱细胞神经基质材料在周围神经修复中的研究进展
脱细胞神经基质是天然的神经支架结构，即采用适当方法去除同种异体(或异种)神经中的细胞及髓鞘成分，保留各层神经膜性结构支架。脱细胞基质构建的人工神经具有以下特性：可接纳神经轴突长入，对轴突再生起机械引导作用，残留部分生物活性因子。各种物理方法尽管取得一定的效果，但均无法清除细胞和髓鞘崩解产物，也即无法根本上降低移植物的抗原性，从而制约了这些方法的应用。应用三硝基甲苯X -100和脱氧胆酸钠溶液脱细胞较为彻底。既往研究表明，脱细胞神经进行宿主再细胞化后进行异体神经移植修复大鼠周围神经较短缺损，效果与不进行宿主再细胞化的脱细胞神经无显著性差异。在修复较短缺损(<3 cm)时，可能再细胞化意义不大，修复较长缺损(>3 cm)时，再细胞化可能会弥补宿主细胞迁移能力的不足。建立标准化、可普遍接受的动物实验研究模式非常必要。选择大动物为实验对象，力求尽可能接近人体生理功能；建立对损伤和修复效果的评估标准，获得大量有效、可靠的实验数据，将使实验研究成果更具实际意义和临床应用价值。
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6B型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物中游离多糖测定方法的建立
目的:建立6B型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物(PS6 B-TT)中游离多糖的测定方法,并对方法进行验证.方法:采用脱氧胆酸钠-盐酸沉淀法(NaDC/HCl),取不同浓度的载体蛋白破伤风类毒素(TT),加入1％ NaDC溶液混匀,离心后用Lowrry法检测上清中蛋白含量,以确定载体蛋白沉淀范围;用不同离子强度的氯化钠溶液稀释游离多糖对照品与TT的混合物,NaDC沉淀并离心后以蒽酮-硫酸法测定上清中多糖含量、计算回收率,确定游离多糖的佳分离条件;以NaDC/HCl沉淀6B型多糖测定标准品并绘制标准曲线,与未经NaDC/HCl沉淀的标准品相比较,确定NaDC对蒽酮硫酸法测定结果的影响;由此建立NaDC/HCl沉淀法结合蒽酮硫酸法测定6B型结合物中游离多糖含量的方法,并对方法的专属性、准确度及精密度进行验证.结果:此方法沉淀载体蛋白浓度应控制在500μg· mL-以下;选择终浓度0.3 mol·L-1氯化钠溶液作为6B型肺炎球菌结合物中游离多糖测定的稀释液;NaDC/HCl沉淀法对蒽酮硫酸法测定多糖含量基本无影响;游离多糖对照品与载体蛋白TT混合物经建立的NaDC/HCl法沉淀后多糖及蛋白回收率分别为98.25％及0;游离糖添加试验回收率均在90％ ～100％;3批结合物游离糖含量测定值其试验内及试验间CV值均在10％以下.结论:本试验建立的NaDC/HCl沉淀法结合蒽酮硫酸法可有效分离6B型游离多糖与多糖蛋白结合物,并能够准确、稳定地测定结合物中的游离多糖含量.
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肺炎链球菌血清型7F荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定
目的:建立一种肺炎链球菌血清型7F荚膜多糖结合物(Pn7F-CRM197)中游离多糖含量的检测方法.方法:在不同的酸性pH下分别对Pn7F纯化多糖和多糖蛋白结合液进行脱氧胆酸钠酸沉处理,筛选出可以完全沉淀结合物但不沉淀多糖的pH范围;对含有不同蛋白浓度的结合液进行脱氧胆酸钠酸沉处理,筛选出结合物酸沉的适蛋白浓度范围;验证该方法的准确度和重复性并考察蒽酮法分析多糖浓度的专属性.结果:当pH在2.5 ～4.0之间且蛋白浓度为100 ～ 300 mg·L-1时,脱氧胆酸钠对结合物的沉淀效果好,对纯化多糖无沉淀作用.结论:脱氧胆酸钠在所选定的pH条件下能专一沉淀结合物,而对游离多糖无沉淀作用,该方法的准确度和重复性均可达到检测要求,多糖浓度的分析方法专属性好,可用于Pn7F-CRM197结合物中游离多糖含量的检测.
关键词： 肺炎 结合疫苗 Pn7F-CRM197 游离多糖 脱氧胆酸钠 -
胆盐脂质体的制备及理化性质研究
目的 以脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,DOC)为模型胆盐,制备胆盐脂质体,并对其理化性质进行研究.方法 采用逆向蒸发法制备胆盐脂质体,以钙黄绿素为模型药,以胆盐脂质体在20 mmol·L-1胆盐中的稳定性为指标,考察总脂量、胆固醇与磷脂比,脱氧胆酸钠与脂相的摩尔比等处方因素.采用优化后的处方,考察胆盐脂质体的外观形态,粒径分布及脱氧胆酸钠在胆盐脂质体中的分布情况.结果 处方优化后,总脂量、胆固醇与磷脂比及脱氧胆酸钠与脂相的摩尔比应分别为225 mg,0.5(w/w)和0.5(mol).外观形态良好,粒径分布均匀.有效胆盐磷脂摩尔比(Re)为0.26,脱氧胆酸钠在脂相的分配系数(K)为0.21 mmol-1.结论 处方优化后制备得到的胆盐脂质体的稳定性较好.
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联合化学刺激法所致大鼠慢性胃炎模型
目的 制作大鼠慢性胃炎模型.方法 本实验选用体重180 g～220 g清洁级Wistar大鼠,雌雄各半,用脱氧胆酸钠水溶液联合乙醇灌胃制作大鼠慢性胃炎模型.结果 经过3个月时间成功造成了大鼠慢性胃炎模型.结论 脱氧胆酸钠联合乙醇灌服所致大鼠慢性胃炎较为适合大鼠慢性胃炎的实验相关研究.
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离体皮肤渗透法测定三七总皂苷传递体经皮吸收特性
目的 确立离体皮肤渗透法测定三七总皂苷(PNS)传递体中药物经皮吸收的主要条件并初步阐明载体中药物的经皮吸收特性.方法 采用薄膜分散法制备PNS传递体和脂质体,并对其进行理化性质表征;筛选离体皮肤渗透试验中PNS传递体的合适药物用量与上样量;考察不同载体(传递体和脂质体)类型、传递体的粒径及处方中脱氧胆酸钠(DOC)的量对PNS经皮渗透的影响.结果 PNS传递体和脂质体均为近似球形的单层囊泡,粒径分别为(121.2±4.5)、(113.9±2.9)nm,无聚集现象.根据药物皮肤累积透过量(Qn)与稳态经皮渗透速率(J)的测定值,将传递体药物用量确定为500 mg,上样体积定为0.5 mL.PNS中各被测成分(人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re和三七皂苷R1)的皮肤Qn传递体均高于脂质体,各被测成分的J前者为后者的2～3倍.粒径120 nm的PNS传递体与粒径250 nm的PNS传递体相比各被测成分在各取样点的皮肤Qn与J均要高.与含DOC量低的传递体相比,含DOC量高的传递体的皮肤Qn与J均明显增大,不同成分增大的倍数有一定差异.结论 离体皮肤渗透法可用于测定PNS传递体中药物的经皮吸收特性,传递体促进药物经皮渗透的作用明显强于脂质体,传递体粒径相对较小,其中DOC用量适当增加均有利于药物经皮渗透.
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慢性胃炎病证结合大鼠模型建立方法研究简况
有效建立动物模型可为疾病发生发展、治疗及后期科研提供研究基础.慢性胃炎大鼠模型造模方法主要有脱氧胆酸钠、感染幽门螺杆菌、乙醇、碘乙酰胺、水杨酸钠等,不同方法造模侧重点和病理方向不同,可根据不同需要,采取不同方法;现临床多采取联合化学刺激法,大大缩短了实验时间,造模效果稳定,且模拟了多因素造成的胃炎,在实验中越来越受青睐.中医动物模型是根据中医理论,对人类疾病和证型的某些特征进行模拟;慢性胃炎临床中脾虚证及脾胃湿热证较为常见,尽量选择符合中医病因造模因子,使造模病因病机设计与临床相符,在现有的基础上,完善和创新方法,使复制出的动物模型更加接近于脾胃湿热和脾胃虚弱证型.分析不同致病因素对大鼠模型的影响,将西医诊疗和中医辨证有机结合起来,对进一步分析中西医的内在联系及中药、方剂的作用机理有着重要意义,建立病证结合模型意义重要可体现在两个方面:①病证结合模型在中医临床与基础理论研究之间起着桥梁作用,且随着病证结合模型的发展和深化,其对于深层次探讨中西医理论的内在联系亦有重要意义;②成功的病证结合模型有助于中药、方剂作用机制的研究并满足新药开发的需要,同时也使临床病理、药理得到了直接明确的阐述.
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构建组织工程瓣膜支架中3种去垢剂的比较
背景:目前,组织工程瓣膜去细胞支架的制备方法和效果各不相同,但总的来说,酶结合去垢剂法显示出一定的优势作用.目的:探讨脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、曲拉通3种去垢剂结合酶消化法对于猪主动脉瓣膜脱细胞的效果以及去细胞后对支架的影响.方法:将新鲜猪主动脉瓣膜用抗生素溶液浸泡12 h后,置于胰蛋白酶和EDTA溶液中12 h,再分别用脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、曲拉通进行处理,后转入核酸酶溶液中浸泡12 h,以达到去除内皮细胞和间质细胞的目的,常规苏木精一伊红染色观察内皮细胞是否除完全,Masson染色观察胶原纤维和弹力纤维损害程度,电子扫描显微镜观察纤维结构以评价效果.结果与结论:3种去垢剂结合酶消化法均能彻底去细胞,但脱氧胆酸钠对支架胶原纤维和弹力纤维的损害较轻微,十二烷基硫酸钠次之,曲拉通对支架的损害作用大.提示脱氧胆酸钠结合酶消化法是一种较合理的组织工程瓣膜支架构建方法.
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脱氧胆酸钠体外对白色念珠菌菌丝相胞外磷脂酶抑制作用研究
.2%、0.1%和0.3%、0.1%和0.4%组间差异有显著性(P<0.05).结论 脱氧胆酸钠体外对白色念珠菌菌丝相胞外磷脂酶具有抑制作用.
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a型流感嗜血杆菌结合物游离多糖含量测定方法的建立及验证
目的 建立a型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type a,Hia)结合物游离多糖含量测定方法,并对方法进行验证.方法 利用脱氧胆酸钠(NaDC)盐酸法和蒽酮硫酸法测定Hia结合物的游离多糖含量.通过检测NaDC盐酸法沉淀破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)、TT ADH衍生物(ADH derivative of TT,TTTAH)及TT琥珀酰化衍生物(succinic anhydride derivative of TT,TTSA)的大能力以及沉淀多糖降解物(depolymerized polysaccharide,de-PS)或降解多糖ADH衍生物(ADH derivative of de-PS,de-PSAH)与相应载体蛋白质混合物的佳离子强度,并利用佳离子强度检测混合物中多糖与蛋白质质量的小比例,以确定Hia结合物游离多糖含量的测定条件.通过添加回收试验验证方法的准确度,多次测定结合物的游离多糖含量验证方法的精密度.结果 NaDC盐酸法对蒽酮硫酸法测定多糖含量几乎无影响;NaDC盐酸法沉淀TT、TTAH和TTSA的大能力分别为402.8、352.5和691.0 μg/ml;在0.6 mol/L NaCl的离子强度下,NaDC盐酸法沉淀多糖与蛋白质混合物,当de-PS与TT或TTAH的质量比≥1:2、de-PSAH与TT的质量比≥1:4、de-PSAH与TTSA的质量比≥1:5时,多糖回收率均在95％以上.向结合物添加6、12、35和56μg/ml的de-PS或de-PSAH时,多糖回收率均在80％～100％之间;游离多糖含量检测结果的CV值均在10％以内.结论 建立的方法适用于不同结合方法制备的Hia结合物游离多糖含量的测定.
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9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液中游离多糖含量检测方法的建立
目的 建立测定9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液中游离多糖含量的检测方法.方法 对9V型肺炎球菌多糖溶液进行不同浓度的脱氧胆酸钠(NaDOC)酸沉处理,选择仅沉淀结合物而不沉淀多糖的佳处理条件,筛选出所能沉淀蛋白的大浓度;对建立的方法进行准确度、精密度、专属性及线性验证.结果 9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液的佳NaDOC酸沉处理条件为2％ NaDOC-0.05 mol/L HCl;蛋白浓度低于200 μg/mL时,NaDOC酸沉处理条件沉淀蛋白的效果佳.准确度试验的回收率在90％～99％之间;实验内及实验间均具有良好的精密度(CV均小于10％);在10～100 μg/mL范围内采用葸酮硫酸法测定糖浓度的曲线,线性良好,r2＞0.998;NaDOC的终浓度在0.25％以下,对蒽酮硫酸法检测无干扰.结论 NaDOC酸沉淀法能很好地分离结合物原液中的结合物与游离多糖,具有良好的重复性和准确性,可用于测定9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液中的游离多糖含量.
关键词： 9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物 脱氧胆酸钠 游离多糖 含量测定 -
脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素(CRM197)结合物中游离多糖含量检测方法的建立及验证
目的 建立一种脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素(CRM 197)结合物中游离多糖含量的检测方法,并进行验证.方法 根据脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,NaDC)在酸性条件下可沉淀蛋白的原理,分别对标准蛋白溶液和CRM197蛋白溶液进行酸沉淀处理,考察其蛋白沉淀效果;向脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素结合物中标加多糖衍生物,计算加标回收率,验证方法的准确性;分别采用NaDC沉淀法处理脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素(A、C、Y、W135群)结合物,检测其游离多糖含量,试验重复6次,验证方法的重复性;向标准蛋白溶液中标加不同浓度的NaDC溶液,验证NaDC对蛋白检测的干扰,考察方法的耐用性.结果 不同浓度的标准蛋白溶液经NaDC沉淀法处理后,蛋白浓度在100～ 300 μg/ml范围内,沉淀中蛋白回收率在90％ ～ 110％之间,蛋白浓度大于300 μg/ml的样品回收率显著降低;4种脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物标加多糖衍生物后,再经NaDC沉淀法处理后的游离多糖含量回收率均在80％ ～ 110％之间;4种脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物6次检测结果的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均＜15％;当溶液中NaDC的浓度不高于2％时,对蛋白检测无干扰.结论 NaDC沉淀法准确性、重复性和耐用性良好,可用于脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素结合物中游离多糖含量的测定.
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脱氧胆酸钠酸沉淀法定量测定b型流感嗜血杆菌结合疫苗中游离多糖的含量
目的 建立一种b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)结合疫苗中游离多糖含量新的检测方法.方法 分别对标准蛋白溶液、多糖溶液和标加衍生多糖(A H-PRP)的结合物原液进行脱氧胆酸钠(NaDC)酸沉淀处理,观察该方法 对蛋白和多糖的沉淀效果.分别采用NaDC酸沉淀法和乙醇分步沉淀法测定结合疫苗原液中的游离多糖含量.结果 不同浓度的标准蛋白溶液经NaDC酸沉淀法处理后,沉淀中蛋白的回收率在96％～ 99％之间；不同浓度的多糖溶液经NaDC酸沉淀法处理后,上清中的多糖回收率在99％～106％之间；该方法 对结合物中的游离多糖能起到很好的分离效果；两种方法 测定结合疫苗原液中的游离多糖含量差异有统计学意义(P＜0.01).结论 NaDC酸沉淀法能专一性地沉淀蛋白物质,对游离多糖无沉淀作用,该方法 具有良好的重复性和准确性,可用于测定Hib结合疫苗中的游离多糖含量.
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脱氧胆酸钠对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响
目的:探讨脱氧胆酸钠(SD)对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的影响.方法:(1)以不同终浓度(0、0.015mg/mL、0.05 mg/mL、0.15 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)的脱氧胆酸钠分别作用于人脐静脉血管内皮细胞,使用CCK-8检测细胞活力、TUNEL荧光染色检测细胞凋亡;(2)以终浓度为0.15 mg/mL的SD作用于HUVEC4、8、12h后用Western blot检测Caspase-3、7、9蛋白及PARP活化情况;(3)观察Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK对0.15 mg/mL脱氧胆酸钠组的影响.结果:CCK8结果显示随SD浓度(0～ 1.0 mg/mL)及作用时间(0～12 h)增加,HUVEC活力降低,0.15 mg/mL时活力为80％,1.0 mg/mL时细胞活力仅不到10％;Tunel检测示随着SD浓度的增加HUVEC凋亡明显增多;Western Blot结果示SD作用于HUVEC后Caspase-3、7、9蛋白及PARP活化明显增加;Z-DEVD-FMK明显抑制了0.15 mg/mLSD引起的PARP活化.结论:脱氧胆酸钠(SD)通过启动Caspase级联反应介导了人脐静脉内皮细胞的凋亡.
关键词： 脱氧胆酸钠 人脐静脉内皮细胞 凋亡 Caspase蛋白酶 -
甘草酸与脱氧胆酸钠分子自组装胶束的形成及稳定性研究
目的 研究甘草酸与脱氧胆酸钠分子自组装胶束的形成及其影响因素.方法 以粒径、PDI和Zeta电位为指标,考察了甘草酸与脱氧胆酸钠分子自组装胶束形成的佳摩尔比,考察了不同温度、不同pH等条件下胶束的稳定性;运用扫描电镜法、差示扫描量热法等分析方法对胶束的物相进行表征,并应用HPLC法测定胶束溶液中甘草酸的量.结果 当甘草酸与脱氧胆酸钠分子的摩尔比为1∶2时,所形成的胶束的载药量质量分数为49.30％,平均粒径为(103.6±2.9) nm,PDI为(0.059±0.002),Zeta电位为-(45.5±0.4) mV.该胶束在4～37℃温度范围内及pH2.0 ～5.5时稳定.结论 本研究发现甘草酸与脱氧胆酸钠能够自组装形成胶束.
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B群脑膜炎球菌外膜囊和脱毒的脂寡糖预防同源和异源脑膜炎球菌感染及脓毒性休克的效力
脑膜炎球菌是一种严重的细菌性病原体,可引起威胁生命的侵袭性细菌感染.为研究B群脑膜炎球菌外膜囊(OMV)和脱毒的脂寡糖(dLOS)的保护效力,研究者采用脱氧胆酸钠处理B群脑膜炎球菌N44/89和N603/95株获得OMV和dLOS,并将OMV和dLOS与参考疫苗(VA-MENGOC-BC(R),古巴)进行比较.
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两种不同去污剂制备肺去细胞支架的对比
目的:比较离子型洗涤剂十二烷基磺酸钠(SDS)与脱氧胆酸钠针对肺去细胞支架制备的性能,寻找一种合适的肺去细胞方法以得到模拟可以促进细胞附着和分化天然细胞外基质的肺功能架构.方法:SD大鼠随机分成正常对照组、去细胞SDS组、去细胞脱氧胆酸钠组,分别取心、肺联合体,两组去细胞组均经右心室置入留置针至肺主动脉.去细胞SDS组使用肝素、Triton X-100、SDS溶液和去离子水依次灌注;去细胞脱氧胆酸钠组使用肝素、Triton X-100、脱氧胆酸钠溶液和去离子水依次灌注.各组分别采用扫描电镜观察支架结构;H-E染色、Masson三色染色观察残留细胞、细胞核成分;免疫荧光染色观察肺组织层黏连蛋白、纤维连接蛋白保留情况,并进行DNA含量测定.结果:扫描电镜显示去细胞SDS组支架肺泡结构较去细胞脱氧胆酸钠组完整;H-E染色显示去细胞SDS组肺支架未见明显细胞及细胞核成分残留,去细胞脱氧胆酸钠组可见少量细胞核成分残留;Masson染色显示去细胞SDS组弹性纤维保留优于去细胞脱氧胆酸钠组;免疫荧光显示去细胞SDS组层黏连蛋白和纤维连接蛋白结构较去细胞脱氧胆酸钠组完整,保留度较高;去细胞SDS组DNA含量为(35.28±8.20) ng/mg,明显低于去细胞脱氧胆酸钠组(52.33±7.67) ng/mg,差异有统计学意义.结论:两种去污剂均可有效清除肺内细胞成分,较好地保留细胞外基质,其中SDS溶液灌注法优于脱氧胆酸钠溶液灌注法.
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ATX-101的Ⅲ期临床试验获阳性结果
ATX-101(脱氧胆酸钠的一种专利处方)为KYTHERA生物制药公司与拜耳公司合作开发的用于减少局部脂肪的第1代注射用药.KYTHERA公司近日在美国美学整形外科学会(ASAPS)第45届年会上公布了关于该产品的两项Ⅲ期临床试验中的ATX-101-10-16研究的阳性结果.
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黄芪总苷对实验性急性胰腺炎的保护作用
目的 探索黄芪总苷(AST)对实验性急性胰腺炎的保护作用及其作用机理.方法 用扭体法和热板法研究其镇痛作用;用脱氧胆酸钠逆行胆胰管注射诱导急性胰腺炎模型,测定血清淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)的活性.结果 AST(20～80 mg·kg-1)均可不同程度地减轻拟痛反应,降低模型动物的血清AMS和LPS水平.结论 AST有镇痛作用和对急性胰腺炎的保护作用.
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用垂直转头密度梯度离心法研究硒对鼠肝核糖体合成的影响
目的:测定多聚核糖体含量及多聚程度的分布对研究生物组织的生理生化现象和代谢过程有重要意义.方法:我们把断奶一周的SD系大鼠(体重60～70 g)随机分为低硒组,加硒Ⅰ组和Ⅱ组,喂养8周,禁食12 h,断头取出肝脏,离心得去线粒体上清液,再加入DOC(脱氧胆酸钠),用差速和不连续梯度离心法分离得总核糖体和多聚核糖体.将制备的多聚核糖体铺放在15%～55%的S形蔗糖密度梯度液顶部,采用RPV50T垂直转头,10 ℃,40 000 r/min离心9 min(日立SCP-85H超速离心机).DGF-U型密度梯度仪上取法收集,同时检测260 nm处紫外吸收.结果:1.总核糖体,多聚核糖体含量(单位mgRNA/g肝组织):缺硒组总核糖体6.74±0.16,多聚核糖体3.61±0.18;多聚核糖体与总核糖体比值0.52±0.03;加硒Ⅰ组,总核糖体7.78±0.17,多聚核糖体4.72±0.09,比值0.61±0.02;加硒Ⅱ组,总核糖体7.93±0.18,多聚核糖体4.79±0.11,比值0.61±0.02;2.多聚核糖体沉降图谱表明(图略)缺硒组和加硒组均出现多个核糖体峰(n＞4),并且加硒组明显高于缺硒组.结论:本实验表明,加硒组多聚核糖体、总核糖及比值均高于缺硒组,图谱表明加硒组多聚核糖体聚集程度高.说明加硒组在蛋白质合成方面不仅合成能力增强,其活性也显著提高,提示硒有促进蛋白质合成和增强细胞修复的作用.本实验采用垂直转头密度梯度离心法,梯度在离心过程中的重定向作用使得离心路径大大缩短,离心管插放在转头靠边缘处,使大半径和小半径处的样品均受到较强离心场作用,因而分离时间大大缩短,核糖体降解随之减少;另外,该转头离心管容量大,加之重定向使梯度横断面进一步增大,梯度容量大大增加.该法为快速、大量制备及分析多聚核糖体提供一良好途径.
