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14型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物中游离多糖的测定方法
目的:建立一种简单有效的测定肺炎球菌英膜多糖-破伤风类毒素结合物中游离多糖的方法.方法:根据脱氧胆酸(DOC)在酸性条件下可快速将蛋白质沉淀的原理,采用不同pH值的1％ DOC溶液分别对14型肺炎球菌荚膜多糖(Ps14)、破伤风类毒素(TT)及Ps14-TT结合物进行处理,观察不同pH值1％DOC溶液对它们的影响,来确定佳反应pH值.随后采用精密度试验和准确度试验对该方法进行验证.结果:Ps14-TT结合物经1％ DOC处理后,在酸性条件下(1 mol·L-1 HC1),结合物及蛋白质被完全沉淀,而未结合的Ps14存在于上清液中,采用蒽酮法测定结合物当中的游离多糖含量.结论:该方法重复性,稳定性,精密度,准确度均达到检测要求,适用于检测Ps14-TT结合物中游离多糖的测定.
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6B型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物中游离多糖测定方法的建立
目的:建立6B型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物(PS6 B-TT)中游离多糖的测定方法,并对方法进行验证.方法:采用脱氧胆酸钠-盐酸沉淀法(NaDC/HCl),取不同浓度的载体蛋白破伤风类毒素(TT),加入1％ NaDC溶液混匀,离心后用Lowrry法检测上清中蛋白含量,以确定载体蛋白沉淀范围;用不同离子强度的氯化钠溶液稀释游离多糖对照品与TT的混合物,NaDC沉淀并离心后以蒽酮-硫酸法测定上清中多糖含量、计算回收率,确定游离多糖的佳分离条件;以NaDC/HCl沉淀6B型多糖测定标准品并绘制标准曲线,与未经NaDC/HCl沉淀的标准品相比较,确定NaDC对蒽酮硫酸法测定结果的影响;由此建立NaDC/HCl沉淀法结合蒽酮硫酸法测定6B型结合物中游离多糖含量的方法,并对方法的专属性、准确度及精密度进行验证.结果:此方法沉淀载体蛋白浓度应控制在500μg· mL-以下;选择终浓度0.3 mol·L-1氯化钠溶液作为6B型肺炎球菌结合物中游离多糖测定的稀释液;NaDC/HCl沉淀法对蒽酮硫酸法测定多糖含量基本无影响;游离多糖对照品与载体蛋白TT混合物经建立的NaDC/HCl法沉淀后多糖及蛋白回收率分别为98.25％及0;游离糖添加试验回收率均在90％ ～100％;3批结合物游离糖含量测定值其试验内及试验间CV值均在10％以下.结论:本试验建立的NaDC/HCl沉淀法结合蒽酮硫酸法可有效分离6B型游离多糖与多糖蛋白结合物,并能够准确、稳定地测定结合物中的游离多糖含量.
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肺炎链球菌血清型7F荚膜多糖结合物中游离多糖含量的测定
目的:建立一种肺炎链球菌血清型7F荚膜多糖结合物(Pn7F-CRM197)中游离多糖含量的检测方法.方法:在不同的酸性pH下分别对Pn7F纯化多糖和多糖蛋白结合液进行脱氧胆酸钠酸沉处理,筛选出可以完全沉淀结合物但不沉淀多糖的pH范围;对含有不同蛋白浓度的结合液进行脱氧胆酸钠酸沉处理,筛选出结合物酸沉的适蛋白浓度范围;验证该方法的准确度和重复性并考察蒽酮法分析多糖浓度的专属性.结果:当pH在2.5 ～4.0之间且蛋白浓度为100 ～ 300 mg·L-1时,脱氧胆酸钠对结合物的沉淀效果好,对纯化多糖无沉淀作用.结论:脱氧胆酸钠在所选定的pH条件下能专一沉淀结合物,而对游离多糖无沉淀作用,该方法的准确度和重复性均可达到检测要求,多糖浓度的分析方法专属性好,可用于Pn7F-CRM197结合物中游离多糖含量的检测.
关键词： 肺炎 结合疫苗 Pn7F-CRM197 游离多糖 脱氧胆酸钠 -
离子色谱法检测冻干AC-Hib联合疫苗成品中的游离多糖
目的:采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培(high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detector,HPAEC-PAD)检测法测定冻干AC群脑膜炎球菌(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗成品(以下简称冻干AC-Hib联合疫苗)中游离多糖的含量,并对方法进行验证.方法:合并15支成品用3 kDa超滤离心管浓缩,通过冷酚法分离游离多糖和多糖蛋白结合物,用2 mol·L-1盐酸水解游离多糖,得到对应的单糖;采用HPAEC-PAD法对水解的游离多糖进行分析,根据检测信号峰面积计算对应水解单糖含量,通过化学结构式确定多糖与水解后对应单糖摩尔比,计算出游离多糖的含量.结果:标准曲线R2>0. 99;不同多糖加标回收率均在80％ ～120％;A群多糖、C群多糖和Hib多糖的定量限分别为0. 025,0. 03和0. 05 μg·mL-1;对HPAEC-PAD法检测游离多糖的重复性和中间精密度进行验证,相对标准偏差(RSD)分别小于10％和15％;方法专属性、系统适用性及耐用性良好.结论:冷酚法与HPAEC-PAD法相结合可用于冻干AC-Hib联合疫苗中游离多糖的含量检测,为产品的质量控制和稳定性研究提供参考.
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a型流感嗜血杆菌结合物游离多糖含量测定方法的建立及验证
目的 建立a型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type a,Hia)结合物游离多糖含量测定方法,并对方法进行验证.方法 利用脱氧胆酸钠(NaDC)盐酸法和蒽酮硫酸法测定Hia结合物的游离多糖含量.通过检测NaDC盐酸法沉淀破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)、TT ADH衍生物(ADH derivative of TT,TTTAH)及TT琥珀酰化衍生物(succinic anhydride derivative of TT,TTSA)的大能力以及沉淀多糖降解物(depolymerized polysaccharide,de-PS)或降解多糖ADH衍生物(ADH derivative of de-PS,de-PSAH)与相应载体蛋白质混合物的佳离子强度,并利用佳离子强度检测混合物中多糖与蛋白质质量的小比例,以确定Hia结合物游离多糖含量的测定条件.通过添加回收试验验证方法的准确度,多次测定结合物的游离多糖含量验证方法的精密度.结果 NaDC盐酸法对蒽酮硫酸法测定多糖含量几乎无影响;NaDC盐酸法沉淀TT、TTAH和TTSA的大能力分别为402.8、352.5和691.0 μg/ml;在0.6 mol/L NaCl的离子强度下,NaDC盐酸法沉淀多糖与蛋白质混合物,当de-PS与TT或TTAH的质量比≥1:2、de-PSAH与TT的质量比≥1:4、de-PSAH与TTSA的质量比≥1:5时,多糖回收率均在95％以上.向结合物添加6、12、35和56μg/ml的de-PS或de-PSAH时,多糖回收率均在80％～100％之间;游离多糖含量检测结果的CV值均在10％以内.结论 建立的方法适用于不同结合方法制备的Hia结合物游离多糖含量的测定.
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差异火箭免疫电泳定量检测四价脑膜炎球菌结合疫苗游离多糖方法的建立及验证
目的 建立差异火箭免疫电泳(differential rocket immunoelectrophoresis,DRIEP)定量检测四价脑膜炎球菌结合疫苗游离多糖的方法,并对该方法进行验证.方法 制备非均一性抗体琼脂糖凝胶,建立脑膜炎A群、C群、Y群、W135群游离多糖的DRIEP定量检测法,并对该方法的专属性、分离效果、线性、重复性及稳定性进行验证.分别采用DRIEP法及DOC沉淀化学法对11批各群脑膜炎球菌单价结合物进行检测.结果 各群多糖抗原只与其相应特异性抗体发生结合,无交叉反应;各群结合物或混合物中的TT可完全与多糖分离;A群、W135群游离多糖定量对照品在2.5～ 20 μg/ml范围内,C群、Y群游离多糖定量对照品在2～ 10 μg/ml范围内,与沉淀峰高度呈良好线性关系,R2均＞0.99;各群单价结合物的9次检测结果的CV值均＜15％;多价脑膜炎球菌结合疫苗中各群游离多糖含量均比较接近.DRIEP法检测值较DOC沉淀化学法高约1/2倍,但两种方法检测结果的高低趋势具有相似性.结论 DRIEP法可用于四价脑膜炎球菌结合疫苗中游离多糖的定量检测,提高了该疫苗的质控水平.
关键词： 差异火箭免疫电泳 四价脑膜炎球菌结合疫苗 游离多糖 -
9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液中游离多糖含量检测方法的建立
目的 建立测定9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液中游离多糖含量的检测方法.方法 对9V型肺炎球菌多糖溶液进行不同浓度的脱氧胆酸钠(NaDOC)酸沉处理,选择仅沉淀结合物而不沉淀多糖的佳处理条件,筛选出所能沉淀蛋白的大浓度;对建立的方法进行准确度、精密度、专属性及线性验证.结果 9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液的佳NaDOC酸沉处理条件为2％ NaDOC-0.05 mol/L HCl;蛋白浓度低于200 μg/mL时,NaDOC酸沉处理条件沉淀蛋白的效果佳.准确度试验的回收率在90％～99％之间;实验内及实验间均具有良好的精密度(CV均小于10％);在10～100 μg/mL范围内采用葸酮硫酸法测定糖浓度的曲线,线性良好,r2＞0.998;NaDOC的终浓度在0.25％以下,对蒽酮硫酸法检测无干扰.结论 NaDOC酸沉淀法能很好地分离结合物原液中的结合物与游离多糖,具有良好的重复性和准确性,可用于测定9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液中的游离多糖含量.
关键词： 9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物 脱氧胆酸钠 游离多糖 含量测定 -
脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素(CRM197)结合物中游离多糖含量检测方法的建立及验证
目的 建立一种脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素(CRM 197)结合物中游离多糖含量的检测方法,并进行验证.方法 根据脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,NaDC)在酸性条件下可沉淀蛋白的原理,分别对标准蛋白溶液和CRM197蛋白溶液进行酸沉淀处理,考察其蛋白沉淀效果;向脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素结合物中标加多糖衍生物,计算加标回收率,验证方法的准确性;分别采用NaDC沉淀法处理脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素(A、C、Y、W135群)结合物,检测其游离多糖含量,试验重复6次,验证方法的重复性;向标准蛋白溶液中标加不同浓度的NaDC溶液,验证NaDC对蛋白检测的干扰,考察方法的耐用性.结果 不同浓度的标准蛋白溶液经NaDC沉淀法处理后,蛋白浓度在100～ 300 μg/ml范围内,沉淀中蛋白回收率在90％ ～ 110％之间,蛋白浓度大于300 μg/ml的样品回收率显著降低;4种脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物标加多糖衍生物后,再经NaDC沉淀法处理后的游离多糖含量回收率均在80％ ～ 110％之间;4种脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物6次检测结果的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均＜15％;当溶液中NaDC的浓度不高于2％时,对蛋白检测无干扰.结论 NaDC沉淀法准确性、重复性和耐用性良好,可用于脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素结合物中游离多糖含量的测定.
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脱氧胆酸钠酸沉淀法定量测定b型流感嗜血杆菌结合疫苗中游离多糖的含量
目的 建立一种b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)结合疫苗中游离多糖含量新的检测方法.方法 分别对标准蛋白溶液、多糖溶液和标加衍生多糖(A H-PRP)的结合物原液进行脱氧胆酸钠(NaDC)酸沉淀处理,观察该方法 对蛋白和多糖的沉淀效果.分别采用NaDC酸沉淀法和乙醇分步沉淀法测定结合疫苗原液中的游离多糖含量.结果 不同浓度的标准蛋白溶液经NaDC酸沉淀法处理后,沉淀中蛋白的回收率在96％～ 99％之间；不同浓度的多糖溶液经NaDC酸沉淀法处理后,上清中的多糖回收率在99％～106％之间；该方法 对结合物中的游离多糖能起到很好的分离效果；两种方法 测定结合疫苗原液中的游离多糖含量差异有统计学意义(P＜0.01).结论 NaDC酸沉淀法能专一性地沉淀蛋白物质,对游离多糖无沉淀作用,该方法 具有良好的重复性和准确性,可用于测定Hib结合疫苗中的游离多糖含量.
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肺炎链球菌18C型多糖结合物中游离多糖含量检测方法的建立
目的 建立肺炎链球菌18C型多糖结合物中游离多糖含量的测定方法.方法 采用不同条件预处理样品,将结合多糖与游离多糖分离,崩改良蒽酮法测定结合物中总糖与游离多糖的浓度,计算出结合物中游离多糖的含量,并对检测方法进行验证.结果 采用5 mol/L氯化钠溶液、85%乙醇溶液及-20℃冻存72 h预处理样品,结合多糖与游离多糖的分离率及实验的有效性均高.采用本方法测定肺炎链球菌18C型多糖结合物中游离多糖含量,结合多糖与游离多糖分离率的变异系数CV值为1.7%,实验有效性变异系数CV值为5.6%;检测3个浓度供试品的平均回收率分别为98.6%、98.5%和97.0%;检测1批多糖结合疫苗中游离多糖含量的CV值为4.2%.结论 已建立肺炎链球菌18C型多糖结合物中游离多糖含量的检测方法,该方法可靠性强,准确性高,精密性良好.
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A群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合物中游离多糖测定方法的建立
本文建立一种测定A群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素(PS-TT)结合物中游离多糖的方法.用80%乙醇使PS-TT结合物沉淀,再用60%乙醇洗涤沉淀使未结合多糖溶解,使与TT结合的和未结合的多糖分离并分别测定.该方法可有效分离结合的与未结合的多糖并分别测定,结合物中外加多糖可定量回收.本方法适用于测定A群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合物中游离多糖含量.
