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多重荧光定量PCR检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌
目的 基于SYBR Green Ⅰ染料建立沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR检测方法.方法 针对沙门菌invA基因、志贺菌ipaH基因和virA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和femA基因片段设计引物,根据Tm值的差异分析确定荧光定量PCR扩增的靶基因和特异性引物,通过优化PCR反应体系,建立了用SYBR Green Ⅰ多重荧光定量PCR熔解曲线来检测多种致病菌的方法.结果 该方法检测的菌液灵敏度分别是沙门菌168 CFU/ml,志贺菌136CFU/ml,金黄色葡萄球菌1240CFU/ml,特异性强,整个过程只需要2h.结论 该方法能快速、灵敏、特异检出沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌.
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伯氏疏螺旋体分型多重实时荧光定量PCR检测方法的建立
目的 建立一种检测伯氏疏螺旋体的分型多重实时荧光定量PCR方法,可对3种致病基因型伽氏疏螺旋体B.garinii、阿氏疏螺旋体B.afzelii、狭义伯氏疏螺旋体B.burgdorferi sensu stricto检出并分型.方法 针对3种基因型菌株的外膜蛋白ospC基因,在保守序列设计通用引物并分别设计型特异Taqman探针,3条探针分别标记FAM、Texas Red 和CY5荧光报告基团,建立和优化多重实时荧光定量PCR反应体系,检测其敏感性和特异性.结果 建立的多重荧光定量PCR的低检测值为B.garinii 40copies/μl、B.afzelii 5.17copies/μl和B.burgdorferi sensu stricto 37.8copies/μl,通过检测立克次体、土拉弗朗西斯菌无交叉反应,检测100只游离蜱与常规PCR结合测序结果分型一致,说明本方法有较好的灵敏性和特异性.结论 该方法能快速检测伯氏疏螺旋体并同时分型,为莱姆病的诊断提供新方法.
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多重荧光定量PCR检测鼠感染3种病原体的方法
目的 建立多重荧光定量PCR快速检测以鼠为宿主伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫的方法,对预防3种病原体引发的疫情具有重要意义.方法 通过设计特异性引物和探针,扩增伯氏疏螺旋体23S rRNA基因,弓形虫的B1基因和恶性疟原虫的SSU基因,采用倍比梯度稀释法检测该体系的灵敏度,以另外8种以鼠为宿主的致病菌评价检测体系的特异性；建立了同时感染3种病原体的鼠全血模拟样本检测试验,以验证方法的适用性.结果 建立自鼠血液模拟样本中同时检测伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫的多重荧光定量PCR方法,检测3种病原体的灵敏度分别为5.5、12.8、17.2拷贝/μl,特异性强.结论 建立了多重荧光定量PCR检测伯氏疏螺旋体、弓形虫和恶性疟原虫方法,缩短了检测时间,在疾病防控等方面有很好的应用前景.
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多重荧光定量PCR方法在呼吸道合胞病毒和腺病毒检测中的Meta分析
目的 通过Meta分析评价多重荧光定量PCR (multiplex real time polymerase chain reaction,MRT-PCR)方法在呼吸道病毒中常见呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)和腺病毒(adenovirus,ADV)感染的诊断价值,为临床应用提供参考.方法 检索数据库包括PubMed、EMBASE、Cochrane、万方、CNKI等,检索2010年1月至2018年1月关于MRT-PCR方法检测呼吸道病毒感染的中英文文献,由2位研究者独立筛选文献、提取资料,并采用QUADAS-2工具评价纳入研究的偏倚风险后,采用Meta-disc 1.4对数据进行统计分析.结果 本研究纳入10篇文献共2 528例样本.Meta分析结果显示,MRT-PCR检测RSV的Sen合并=0.87(95％ CI:0.83-0.90)、Spe合并=0.98(95％ CI:0.97-0.98)、AUC=1.00.MRT-PCR检测ADV的Sen合并=0.64(95％ CI:0.56-0.71)、Spe合并=0.99(95％ CI:0.98-0.99)、AUC=0.99、Q=0.96.Deeks漏斗图检验结果提示无明显的发表偏倚.结论 MRT-PCR方法检测RSV和ADV的灵敏度有待提高,但检测综合能力较好,对临床上呼吸道病毒感染的早期诊断具有一定的应用价值.
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流感嗜血杆菌、溶血嗜血杆菌和多杀巴斯德杆菌病多重荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用
目的 建立同时检测实验动物中的流感嗜血杆菌、溶血嗜血杆菌和多杀巴斯德杆菌的多重实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法.方法 分别根据三种病原菌的Hpd基因和KMT1基因设计特异性引物和Taqman探针,经特异性、敏感性和重复性验证,建立多重qPCR检测方法,并对822份实验动物呼吸道样本进行检测应用.结果 所建立的多重qPCR方法与其他29种病原菌间无交叉反应,对三种病原菌的检测限可达到10个拷贝/μL.树鼩样品中溶血嗜血杆菌和多杀巴斯德杆菌的阳性率分别为10％(6/60)和21.7％ (13/60),其他实验动物中均未检出上述三种病原菌.结论 本研究所建立的多重qPCR检测方法,可快速检测实验动物中的上述三种呼吸道病原菌.
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多重荧光定量PCR测定登革热Ⅰ～Ⅳ型方法的建立
目的 建立能同时检测登革热4种血清型的一步法多重荧光定量PCR检测方法,用于登革热病毒分型的早期实验室诊断.方法 针对病毒Ⅰ-Ⅳ型使用优化的引物探针,调整反应温度和条件,稀释阳性样本,进行特异性、灵敏度、重复性检测,评估该反应体系的性能.结果 16份样本中,6份经抗体确证的登革热阳性样本使用自建方法检测全为阳性,且1型3份,2、3、4型各1份,均与预期结果一致.流感、乙脑、诺如阳性样本以及健康人血清检测未见特异性扩增曲线,特异性高.登革热病毒2、3、4型低检测限为102 copies/ml.1型低检测限为103 copies/ml.不同型别各浓度梯度检测变异系数小于10％.结论 本实验设计的登革热单管多重荧光定量PCR检测体系特异性、灵敏度、重复性都较好.
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白血病融合基因BCR-ABL和PML-RARα多重实时定量检测方法的建立
目的 建立白血病常见融合基因 BCR-ABL和 PML-RARα多重实时定量检测方法. 方法 针对 BCR-ABL和PML-RARα融合基因序列分别设计引物及不同荧光信号的Taqman 探针,同时以肿瘤细胞K562、NB4总RNA所逆转录的cDNA为模板,通过 PCR扩增出BCR-ABL599 bp和PML-RARα496 bp的基因片段,定向插入pMD18-T载体,制备成标准品并绘制标准曲线,运用实时荧光定量 PCR扩增曲线判定是否具有融合基因,同时定量融合基因拷贝数. 结果 成功构建BCR-ABL和PML-RARα质粒标准品. 应用RQ-PCR法,以Actin为内参,对临床血液样本进行检测,分析样本是否具有这两类融合基因及融合基因拷贝数. 结论 本研究以探针荧光信号及其信号类型来判断是否具有融合基因及融合基因类型,同时通过BCR-ABL 和PML-RARα质粒标准品所绘制的标准曲线来定量融合基因初始拷贝数. 在同一体系中同时检测两种常见的融合基因有利于防止漏检、节约成本,对临床检验具有普遍意义.
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淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体多重荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用
目的 建立淋病奈瑟菌(Neisseria agonorrhoeae,NG)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)、细小脲原体(Ureaplasma parvum,UP)多重荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)检测方法.方法 选择NG保守基因porA、解脲支原体(Ureaplasma urealytieum,UU)保守基因ure及CT保守基因trp作为目标检测基因,设计引物及TaqMan探针,制备重组质粒标准品,绘制标准曲线,建立多重FQ-PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性.用建立的方法对203份泌尿生殖道感染NG、CT、UP的临床样本进行同步检测,并与单重FQ-PCR法、常规PCR法及基因测序结果进行比较.结果 重组质粒标准品经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;建立的标准曲线起始DNA拷贝数与Ct值之间的线性关系良好,相关系数为0.998 ～ 1.000;该方法检测NG、CT和UP的灵敏度均可达102 copies/ml,检测范围可达109 ～ 102 copies/ml,相关系数分别为1.000、0.999和0.995;不与生殖道其他菌群如阴道霉菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、人型支原体、单纯疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型及人乳头瘤病毒(16/18型)发生交叉反应;检测的203份样本中,多重FQ-PCR检测NG、CT、UP的阳性检出率分别为34.48％、30.54％、18.71％,与单重FQ-PCR法、基因测序法比较,差异无统计学意义(P＞0.05),3种方法阳性检出率均高于常规PCR法;与基因测序法相比,多重FQ-PCR法灵敏度为100％,3种病原体检测特异性均高于98.50％.结论 已成功建立NG、CT、UP多重FQ-PCR检测方法,该法检测时间短,特异性强,灵敏性高,适合于临床快速诊断.
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多重荧光定量PCR和液态芯片技术对下呼吸道病毒检测的应用比较
目的 比较荷兰PathoFinder公司多重荧光定量PCR技术(RespiFinder 2SMART试剂盒,简称RespiFinder检测)和加拿大Luminex公司液态芯片技术(呼吸道病毒检测试剂盒,简称xTAG RVP)对下呼吸道标本病毒检测的结果.方法 收集2015年1至12月于北京协和医院疑似病毒性肺炎住院患者100例下呼吸道标本,分别利用RespiFinder和xTAG RVP检测试剂进行常见呼吸道病毒核酸检测,并全部进行PCR及测序分析,比较两种方法的敏感性和特异性.结果 100份下呼吸道标本经RespiFinder和xTAG RVP方法检测,阳性率分别为60.0％和51.0％,混合感染率均为8.0％.两种方法结果一致率为80.0％.以PCR及测序结果为准,经RespiFinder和xTAG RVP方法检测的敏感性分别为97.9％和94.3％,特异性分别为74.5％和97.9％,阳性预测值分别为78.3％和98.0％,阴性预测值分别为95.0％和93.9％,两法检测特异性及阳性预测值差异有统计学意义(P＜0.05).结论 与RespiFinder方法相比,xTAG RVP对常见呼吸道病毒检测的特异性较好,敏感性相当,对呼吸道病毒的检测性能优于RespiFinder检测.
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利用多重荧光定量PCR检测阿胶原料驴、马、驴骡和马骡皮张的源性
目的 建立快速检测阿胶原料皮张源性的方法.方法 根据马、驴、驴骡和马骡的核基因肌酸激酶CKM和线粒体基因组DNA(mtDNA)的16S rRNA基因序列设计特异,并引入18S rDNA作为内参质控,建立能检测4种动物源性的5重多色荧光定量PCR检测体系.结果 本研究开发的引物和分子信标探针的特异性强,能同时区分同源性相近的驴、马、驴骡和马骡源性;灵敏度高,检测限为0.01 ng·μL-1.通过对某阿胶制品公司收购的驴皮源性检测,检测结果与DNA测序一致率达100％.结论 本方法在一管PCR反应中能同时检测4种动物源性,更简单、准确和高效,为驴皮、马皮及骡子皮张的源性鉴定探索了新的途径.
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多重荧光定量PCR同时检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法研究
目的:利用多重荧光定量PCR技术检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌.方法:以溶藻弧菌等17种相关试验菌株做特异性检测;并将标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.结果:与传统的检测方法相比,该方法有很好的特异性且灵敏度高,检测时间短并可节省人力,具有快速方便等优点.结论:适用于样品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的快速检测.检测限分别为:霍乱弧菌为280 cfu/ml;副溶血性弧菌为:100 cfu/ml;创伤弧菌为:450 cfu/ml.
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腺病毒、EB病毒和巨细胞病毒多重荧光定量PCR检测试剂的开发及验证
目的 开发一次试验即可明确是否属于腺病毒、EB病毒和巨细胞病毒中的某一种感染的多重检测试剂.方法 设计特异性的腺病毒、EB病毒和巨细胞病毒的引物探针,探索优的PCR反应体系.结果 通过产品灵敏度、精密度、准确度及稳定性的研究结果证明,该试剂组分对痰液样本内腺病毒、EB病毒及巨细胞病毒的检测灵敏度和特异性均达到95％以上、准确度达到100％,该试剂置于4℃存放4d、反复冻融6次,检测结果显示无明显差异.结论 该试剂相关性能达到了国内诊断试剂所要求的主要性能指标.
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荧光定量PCR同步检测人类疱疹病毒6,7,8型方法的建立
目的:建立同步检测人类疱疹病毒6,7,8型(HHV-6,-7,-8)的多重荧光定量PCR方法.方法:分别针对HHV-6,-7,-8的U67、U36、ORF65基因设计3对引物和3种Taq Man-LNA探针,构建三重荧光定量PCR反应体系,用于同步扩增HHV-6,-7,-8.分别应用HHV-6,-7,-8质粒建立对应标准曲线,并对多重荧光定量PCR方法进行线性范围、灵敏度、特异性、重复性和扩增效率等方法学评价.以DNA测序法为参考方法,检测45例疑似HHV感染者外周血单个有核细胞(PBMC)中的HHV-6,-7,-8,对多重荧光定量PCR方法进行临床特异性和敏感性评估.结果:多重荧光定量PCR方法检测HHV-6,-7,-8的线性范围均在106-1011 Copies/L,相关系数均＞0.99,灵敏度为8×105 Copies/L,低检测限为5×105 Copies/L,无非特异性扩增,线性范围内HHV-6,-7,-8的批间、批内变异系数(CV)均＜5.5％；与单重荧光定量PCR相比,检测HHV-6,-7,-8质粒含量的相关性分别为0.980,0.987,0.965.以DNA测序方法为金标准,多重荧光定量PCR检测HHV-6,-7,-8的特异性均为100％,灵敏度分别是93.1％、80％、100％.结论:多重荧光定量PCR能够对HHV-6,-7,-8进行同步、快速和准确的定量检测,将在输血安全筛查方面有着广泛的应用前景.
关键词： 人类疱疹病毒 多重荧光定量PCR TaqMan-LNA探针 输血筛查 -
沙眼衣原体、单纯疱疹病毒2型、人乳头瘤病毒16型多重荧光定量PCR检测方法的建立及其应用
目的 建立一种可准确、快速检测沙眼衣原体、单纯疱疹病毒2型、人乳头瘤病毒16型3种病原体DNA的多重荧光定量PCR检测方法.方法 本研究针对沙眼衣原体、单纯疱疹病毒2型、人乳头瘤病毒16型分别设计了一对特异性探针引物,构建了可同时检测沙眼衣原体、单纯疱疹病毒2型、人乳头瘤病毒16型的多重荧光PCR反应体系,并与商业试剂同时检测300例临床标本,评估其一致性.结果 性能评价结果显示,所建立的多重荧光PCR检测方法具有较好的特异性和敏感性,与对照商业试剂检查结果符合率达到100％.结论 所建立的多重荧光PCR检测方法能实现3种病原体的快速、正确定量检测.
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多重荧光定量PCR快速检测缺失型α地中海贫血
目的 采用多重荧光定量PCR技术快速检测缺失型α地中海贫血(以下简称α地贫),初步评价其诊断性能,并探讨该体系应用于临床基因诊断的可行性.方法 采用多重荧光定量PCR体系检测300份,采用gap-PCR和β地中海贫血(以下简称β地贫)点突变反向点杂交法确定基因型的正常及地中海贫血标本,其中150例为α地贫标本,100例基因型为αα/αα的正常样本,50例为β地贫标本.结果 多重荧光定量PCR在150例α地贫样本及100例正常样本的检测结果与gap-PCR符合率均达到100%,50例β地贫标本,有49例检测结果与gap-PCR一致,有1例gap-PCR报告为αα/αα的标本,多重荧光定量PCR报告为α1以及α2各仅有一个拷贝,经多重连接探针扩增技术证实为--THAI/αα.结论 多重荧光定量PCR是一种快速、简便和可靠的缺失型α地中海贫血检测技术.
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2017.7-2018.8黔南州中医医院诺如病毒 核酸检测结果分析
目的:了解腹泻病人的病原及流行特点,为疾病的诊断及治疗提供依据.方法:2017年7月至2018年8月采集黔南州中医院门诊及住院的腹泻病人腹泻期间的粪便送检,采用多重荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测诺如病毒核酸,并对检测结果进行分析.结果:135例腹泻病人其中有11例感染了Ⅱ型诺如病毒,感染率为8.1％;其中1例感染了诺如病毒Ⅱ型,感染率为0.7％.结论:腹泻病人中感染诺如病毒主要是以Ⅱ型为主,流行季节为冬春季节.诺如病毒核酸检测快速,且准确度高,可快速辅助医生诊断腹泻病人是否感染了诺如病毒,及时治疗.
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多重荧光定量PCR技术在唐氏综合征筛查中的应用
目的 探讨多重荧光定量PCR技术在唐氏综合征筛查中的应用.方法 针对21号染色体上的D21S1409、GATA 163 G03、D21S1422、D21S1435基因座设计荧光引物,通过复合扩增,利用ABI3130遗传分析仪检测212个正常个体样本、6个唐氏综合征患儿家庭样本,并比较患儿家庭样本的外周血染色体核型结果,评价该技术的准确性.结果 选取的4个STR基因座的杂合度(H＞0.64)、识别能力(DP＞0.802)和信息量(PIC ＞0.58)均较高.检测的6个疑似唐氏综合征患儿家庭样本结果与染色体核型提示结果一致.结论 多重荧光定量PCR技术具有较高的敏感性和特异性,可用于唐氏综合征的高通量快速筛查.
