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人绒毛膜促性腺激素第三次免疫测定用国家标准品候选品的建立
目的 建立人绒毛膜促性腺激素(HCG)第三次免疫测定用国家标准品候选品.方法 精确量取来源于妊娠妇女尿液的高纯HCG原料、人血白蛋白和海藻糖,加入至磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH =7.4)内,充分混匀后置于2～8℃过夜,次日无菌过滤,0.5mL分装后,冻干制备成HCG国家标准品候选品.以HCG第五次国际标准品(07/364)为对照品,采用9个厂家10种HCG检测试剂盒进行协作标定.同时对候选品的瓶间精密度、稳定性进行分析.结果 HCG候选品免疫活性为14.8±2.5IU/支,瓶间精密度为2.38％,37℃放置16周后,HCG候选品的免疫活性下降在10％范围内.结论 候选品各项指标均符合要求,可作为HCG第三次免疫测定用国家标准品使用.本标准品的建立,将为HCG免疫测定用试剂盒的标准化提供定量基础.
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乙型肝炎病毒表面抗原国家定量标准品的研制
目的 研制乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)国家定量标准品及定量线性参考品.方法 收集各地乙型肝炎患者和健康献血员血样,用不同厂家乙型肝炎、丙型肝炎病毒血清学试剂盒筛选.6个协作单位用7种试剂以世界卫生组织(WHO)HBsAg定量标准品标定1份HBsAg国家定量标准品,稀释后得到HBsAg国家定量线性参考品.结果经7种试剂共21次协作标定,得到HBsAg国家定量标准品的浓度为1226 IU/ml,各次检测结果的变异系数均小于15%.将国家定量标准品系列稀释后得到由8个不同浓度血清组成的HBsAg国家线性参考品,经检测后表明其浓度与理论浓度的差值均<15%,通过加速试验检测该参考品的稳定性效期暂定为5年.将其作为HBsAg国家线性参考品并初步限定检测结果的允许值范围.结论 标定1份HBsAg国家定量标准品并建立了由8份血清组成的HBsAg国家定量线性参考品.
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第1批重组人促卵泡素生物测定用国家标准品的制备与标定
目的:制备并标定第1批重组人促卵泡素(recombinant human follicle-stimulating hormone,Follitropin,rhFSH)国家标准品(生物测定用).方法:以WHO第2批重组人促卵泡素国际标准品08/282作为标准,采用《中华人民共和国药典》2015年版四部1216卵泡刺激素生物测定法,联合4个实验室参加协作标定.蛋白含量及纯度测定采用SE-HPLC法,解离亚基与聚合体测定采用SDS-PAGE电泳法,RP-HPLC法测定氧化α亚基等主要理化指标,参照国家食品药品监督管理总局颁发的生物制品标准YBS00172015进行;采用N端测序、肽图等方法对标准品制备用原液进行了结构确认,并对待标品进行稳定性考察.结果:重组人促卵泡素待标品经协作标定,终定值其生物效价为每瓶174 IU;每瓶重组人促卵泡素含量11.5 μg,纯度96.46％,测定聚合体、解离亚基、氧化α亚基等相关物质理化指标,均符合规定;稳定性考察合格,N端测序和肽图结果均符合理论要求.结论:本批待标品确认为重组人促卵泡素,可作为第1批重组人促卵泡素(rhF-SH)国家标准品,以供重组人促卵泡素及相关制剂的生物效价测定用,本批标准品生物效价为每瓶174 IU.
关键词： 重组人促卵泡素(rhFSH) 国家标准品 体内生物测定 生物效价 -
第四批人凝血因子VIII国家标准品制备和标定
目的:建立经两步病毒灭活工艺制备的人凝血因子VIII国家标准品,以替代第三批人凝血因子VIII国家标准品.方法:按<中国药典>2010年版三部对人凝血因子VIII产品的生产工艺要求和质量标准,制备第四批人凝血因子VIII国家标准品(批号20100101),用WHO 第七批人凝血因子VIII国际标准品(批号99/678),采用一期法进行协作标定,采用加速破坏试验进行稳定性考察.结果:批号20100101人凝血因子VIII国家标准品效价为12.1IU/支,稳定性好,其它项目指标均达到国家标准品的要求.结论:建立了符合国家标准品要求、并经病毒灭活的第四批人凝血因子VIII国家标准品.
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第8批细菌内毒素国家标准品的建立
本文冻干制备了3批细菌内毒素国家标准品候选品.以第3批细菌内毒素国际标准品(10/178)为基准,采用凝胶法、动态浊度法和动态显色法3种方法,组织了14家单位进行协作标定.通过比较3批候选品标定结果的精密性及对3种标定方法是否存在显著性差异,终确定其中一批候选品为第8批细菌内毒素国家标准品,效价为9000EU/支,批号150800-201601.
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首批肠道病毒71型人免疫球蛋白国家标准品的研制
目的 制备首批肠道病毒71型免疫球蛋白国家标准品,用于肠道病毒71型特异性免疫球蛋白产品效价测定.方法 选择国内经批签发检验合格的静注人免疫球蛋白产品以及高效价肠道病毒71型人免疫球蛋白作为原料进行合并,分装冻干后并按规定对标准品的水分含量、分装精度、无菌检查和稳定性进行考察.在5家实验室按微量细胞病变法进行协作标定,以肠道病毒71型中和抗体滴度的倒数作为中和效价,单位定义为u.结果 5家实验室共进行了63次协作标定,结果均经LOG转换后进行计算,实验室内几何变异系数GCV范围为1.5％～4.1％,实验室间几何变异系数GCV平均值为3.1％,效价几何平均值为327 U.为以后使用和计算方便,该批次标准品赋值为330 U.该标准品160 d加速破坏实验和22 m长期稳定性考察显示效价稳定无下降趋势,12 m测定不同温度点的单体加二聚体(HPLC-SEC法)含量大于98.0％,有效成分稳定.该标准品的水分含量为0.6％,分装精度为0.56％,无菌检查合格.结论 该批肠道病毒71型人免疫球蛋白标准品各项检测指标符合要求,可以作为国家标准品发放用于肠道病毒71型特异性免疫球蛋白的效价测定.
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中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品的研制
目的 建立中国仓鼠卵巢细胞DNA残留量定量测定用国家标准品.方法 使用QIAGEN Genomic-tip 500/G以及基因组DNA纯化试剂制备了中国仓鼠卵巢细胞基因组DNA作为标准品原料,通过紫外分光光度法和电泳进行纯度和含量测定后分装,采用紫外分光光度法对我国第一批中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品进行协作标定,并评价其稳定性和适用性.结果 中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品经检测,A260/A2so均在1.7 ～1.9之间,电泳图谱只有单一条带,符合规定.该标准品经6家实验室协作标定共90次,几何平均含量为93.63 μg· mL-1,平均含量的95％可信区间为92.86 ～ 94.40 μg·mL-1,单次测定的95％参考值范围为86.51 ～ 100.89 μg·mL-1,平均可信限率为0.81％.加速热稳定实验表明,该标准品在-20、4、25、37℃条件下放置4个月,DNA含量无明显改变,但37℃条件下A260/A280有下降趋势；-20、4、25℃条件下电泳结果为单一条带,37℃条件下DNA有降解条带.-20 ℃贮存1年的长期稳定性结果显示,标准品DNA浓度及A260/A280无显著性差异,电泳条带单一,因此-20℃条件下长期保存标准品稳定性较好.在标准品适用性研究中,利用该标准品进行荧光染色法测定,标准曲线r值为0.999 0以上,在0.781～100ng·mL-1之间线性良好,各稀释度RSD均小于10％；利用该标准品进行定量PCR法测定,标准曲线r值为0.990 0以上,在10-2～103 pg之间线性良好,熔解曲线可见单一峰出现.结论 该批中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品用于荧光染色法和定量PCR检测中国仓鼠卵巢细胞DNA残留量,含量定为93.63 μg·mL-1,批号为270026-201101.
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首批逆转录酶活性测定国家标准品的研制
目的 研制首批逆转录酶活性测定国家标准品.方法 按《中国药典》2015年版三部相关要求,进行逆转录酶活性测定标准品的制备、检验,并使用热加速试验进行稳定性考察,以SYBR Green Ⅰ实时定量聚合酶链式反应法分别在4个实验室进行协作标定.结果 制备的逆转录酶活性测定标准品外观、无菌检查合格,水分含量为1.3％,分装精度为0.75％.在-20、4、25和37℃放置3个月和6个月的标准品与-70℃保存的标准品相比酶活性均没有下降.经4个实验室协作标定共22次,标准品酶活性的几何平均值为每支26 U,95％置信区间为每支22.95 ～30.45 U.结论 该批逆转录酶活性测定标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品使用,酶活性定为每支26 U.
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免疫测定用甲胎蛋白国家标准品的制备与定值
目的 制备并标定免疫测定用甲胎蛋白(AFP)国家标准品.方法 制备AFP国家标准品冻干品,以酶联免疫法(ELISA)、化学发光法(CLIA)及时间分辨荧光法(TRFIA)对AFP国家标准品进行联合定值,并以AFP国际标准物质做校准,以实现国际单位的溯源.对国家标准品的赋值不确定度进行评定,对均匀性和稳定性进行检验.结果 AFP国家标准品赋值为645 IU/支,不确定度为±43 IU,瓶间精度为1.75％;2～8℃储存16周,与-20℃常规储存比较,相对偏差不大于5.0％,长期稳定性考察18个月,测定值偏差不大于5.0％.结论 本研究制备的免疫测定用AFP标准品符合国家标准物质的要求.
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关于重组人泌乳素制剂作为推荐的WHO参考试剂的评估
本文报告了在国际协作研究中,以泌乳素第3次国际标准品为对照品,用放射免疫分析和免疫放射量度分析试剂盒测定rhPRL 97/714、G-PRL 98/580和NG-PRL 98/582以及泌乳素国家标准品的免疫效价.放射免疫分析法结果:rhPRL 97/714、G-PRL 98/580和NG-PRL 98/582效价的几何均数分别为1275、239和597 mIU/安瓿,相当于WHO初步报告中提供的几何均数的100.7%,103%和97.5%;泌乳素国家标准品与第3次国际标准品的相对效价为0.90.免疫放射量度分析法结果:rhPRL 97/714、G-PRL 98/580和NG-PRL 98/582效价的几何均数分别为956、194和439 mIU/安瓿,相当于WHO初步报告中提供的几何均数的75.5%,83.6%和71.7%;泌乳素国家标准品与第3次国际标准品的相对效价为0.92.表明:即使同一个实验室内,不同的免疫分析方法之间也存在一定差异.双份样品精密性测定:泌乳素第3次国际标准品双份样品之间的相对效价为0.95～0.99,rhPRL 97/714双份样品之间的相对效价为1.01～1.04.+45℃热加速降解样品测定结果符合WHO报告中所述的免疫活性变化趋势.
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第一次低分子量肝素效价测定用国家标准品协作标定
通过理化指标及活性等测定,筛选出适合的标准品原料,溶解、分装、冻干后制备成低分子量肝素(low molecular weight heparin, LMWH)国家标准物质待标品(140647-200801).应用第二次国际标准品(01/608),采用生色底物法(chromogenic substrate method),组织国内8个实验室对其效价进行协作标定.效价标化结果经统计学分析,实验室内及实验室间的几何变异系数(geometric coefficient of variation, gcv)均小于10%.经药品标准物质专家委员会审定后批准,待标品(140647-200801)用作LMWH效价测定用国家标准品,其抗Xa因子效价为1151 IU/安瓿,抗IIa因子效价为424 IU/安瓿.
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免疫测定用人垂体促甲状腺激素第三次国际参考制剂国际协作标定
本文报告了在国际协作研究中,以TSH第2次国际参考制剂为对照品,用化学发光免疫分析、酶联免疫分析、放射免疫分析和免疫放射量度分析试剂盒测定TSH 81/565(候选的TSH第3次国际参考制剂)、TSH 81/615和TSH 81/502以及TSH国家标准品的免疫效价.所有免疫分析法结果:TSH 81/565、TSH 81/615和TSH 81/502效价的几何均数分别为11.5、11.4和7.38 mIU/安瓿,相当于WHO报告中提供的几何均数的99.1%,101.8%和100.4%;TSH国家标准品与第2次国际参考制剂的相对效价为0.942.然而,在不同的免疫分析方法之间存在一定差异.对TSH 81/565而言,酶联免疫分析法测定的效价的几何均数小,为8.07/安瓿;而化学发光免疫分析法测定值大,为12.8/安瓿.双份样品精密性测定:TSH第2次国际参考制剂双份样品之间的相对效价为0.84～1.08,TSH 81/565双份样品之间的相对效价为0.82～1.18.+4℃热加速降解样品测定结果符合WHO报告中所述的免疫活性变化趋势.
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抗生素国家标准品的协作标定
抗生素生物标准品是用于抗生素药品效价(含量)测定的标准物质.在效价测定中,需将供试品和已知效价的标准品在相同的实验条件下作比较,进而确定供试品的效价,可见抗生素标准品的重要性.标准品的效价(含量)标定,由中国药品生物制品检定所负责,首先组织3个以上实验室进行协作标定,然后将各实验室的数据进行合并计算,确定终定值,作为国家标准品.该项工作技术性强,试验方法影响因素较多,但若实验方法设计严谨,操作规范,就会取得精密度高、准确度较好的结果.
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肝素的标准化
肝素于19世纪30年代作为抗血栓药用于临床[1].因为它的不均一性和化学结构的不确定性,自1942年建立供效价测定用第1次肝素国际标准品[2],至今已更替了4次.为建立第5次国际肝素标准品,1998年,WHO生物标准化中心英国国家检定所(NIBSC)组织了对近50年来肝素样品(其中包括历次国际肝素标准品和主要国家的现行标准品及广泛来源的商业产品)的协作研究[3].参与研究的实验室采用本国药典中肝素的生物测定法,有些实验室还采用了欧洲药典中肝素通则项下推荐的低分子肝素特异活性测定法[4]测定样品的生物效价,用凝胶渗透层析和高分辨核磁共振图谱分析法, 测定样品的组成和分子量及分子量分布.通过实验研究,从中选出2个样品作为第5次肝素国际标准品的候选品;还发现我国提供的肝素国家标准品(批号:509-9010)的特异活性仅相当于70年代初期的第3次国际肝素标准品;与目前市场上肝素原料和近建立的国际及欧洲肝素标准品的高分辨核磁共振(NMR)图谱有一定的差距;多分散性指数PD值(PD＝Mn/Mw即分子数平均分子量/重量平均分子量)也高.
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人重组胰岛素样生长因子-Ⅰ (IGF-Ⅰ)第1次免疫测定用国家标准品的建立
目的:研制并建立了人重组胰岛素样生长因子-Ⅰ (IGF-Ⅰ)第1次免疫测定用国家标准品.方法:取人重组IGF-Ⅰ原料,用舍赋形剂的0.01 M PBS缓冲液配制成7000 ng· mL-1溶液,经无菌过滤处理后,分装、冻干制成候选品.以IGF-Ⅰ国际标准品(02/254)为对照品,选择3家实验室进行协作标定.并对IGF-Ⅰ候选品进行瓶间精密度和稳定性分析.结果:候选品IGF-Ⅰ效价为7446 ng·支-1,瓶间精密度为1.9％,37℃放置3个月稳定.结论:候选品瓶间精密度和稳定性符合要求,每安瓿效价定为7400 ng.本标准品的建立将为IGF-Ⅰ免疫测定的标准化提供定量依据.
关键词： 胰岛素样生长因子-Ⅰ 国家标准品 定量标记免疫分析 -
重组链激酶(rSK)国家标准品的研制
目的 建立效价测定用重组链激酶国家标准品。方法 以NIBSC的国际标准品为标准，采用体外溶圈法，按WHO要求组织了3家实验室，对该批rSK国家标准品(批号960701)的效价进行协作标定。结果 经统计学分析，均数为495IU／支，95％可信区间为457～535IU／支，单次测定的95％标准值范围为301～706IU／支。该批国家标准品效价确定为500IU／支。4种不同温度存放29个月的样品，效价稳定。结论 该批rSK效价稳定，可作为国家标准品。
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人破伤风免疫球蛋白国家标准品的研制
目的研制人破伤风免疫球蛋白国家标准品.方法按WHO有关要求制备并检测标准品,以人破伤风免疫球蛋白国际标准品为标准进行协作标定.结果冻干人破伤风免疫球蛋白国家标准品经外观、水分、无菌、分装误差、效力检测,均符合要求,在4℃保持60个月效力稳定.协作标定平均值为10.55 IU/支,CV值为4.7%.结论该批人破伤风免疫球蛋白标准品可以作为国家标准品,效价定为10IU/支,批号为001.
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重组人表皮生长因子生物活性国家标准品的研制
目的建立测定重组人表皮生长因子(rhEGF)活性用国家标准品.方法按WHO有关要求,制备并检测标准品,以EGF国际标准品为标准进行协作标定.结果冻干EGF标准品经外观、无菌、水分检测均符合规定,在-20、4、25和37℃保持33个月生物活性稳定,协作标定几何平均效价为6823IU/支.实验均数的95%可信区间为5958～7812IU/支,单次实验的95%参考值范围为2241～12056IU/支,平均可信限率为14.64%.结论该批EGF标准品可作为国家标准品,效价定为6800IU/支,批号为97/01.
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第一批重组人红细胞生成素国家标准品的研制
目的建立符合国家标准品要求,用于重组人红细胞生成素(rHuEPO)质量控制的rHuEPO国家标准品.方法用英国MBSC提供的WHO rHuEPO(87/684),采用经典的多血症小鼠-59Fe体内生物学活性测定法,对我国第一批重组人红细胞生成素国家标准品(980528)进行了标定.用阿根廷INSTITUTO SIDUS S.A.进行了复核标定.结果该批国家标准品效价为82IU/瓶,生物学活性稳定.结论 980528批rHuEPO可作为国家标准品,用于重组红细胞生成素制品体内生物学活性测定.
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重组人粒细胞集落刺激因子活性测定标准品的研制
目的建立效价检测用的重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)国家标准品.方法标准品按WHO有关要求进行制备、分装、冻干、检测,用G-CSF国际标准品为标准进行协作标定.结果冻干重组人GCSF标准品经检测,外观、无菌实验合格,水分为0.90%,加速热稳定实验表明其生物学活性在-20、4和25℃条件下20个月保持稳定.该标准品经4家实验室协作标定共32次测定,加权平均效价为5.15×106IU/支;几何平均效价为4.91×106IU/支.实验均数的95%可信区间为4.64×106～5.20×106IU/支,单次实验的95%参考值范围为3.45×106～6.106×106IU/支,平均可信限率为5.46%.结论该批重组人G-CSF国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品使用,效价定为5.0×106IU/支,编号为98/01.
