人重组谷氨酸脱羧酶65基因的克隆表达及其在1型糖尿病诊断中的初步应用

目的 构建人重组谷氨酸脱羧酶65(GAD65)基因不同区段原核表达载体,诱导表达获得重组蛋白,并初步验证GAD65不同抗原区段在1型糖尿病GAD自身抗体检测中的价值.方法 应用巢式逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术调取目的 基因,构建相应的原核表达质粒,转化大肠杆菌E.coli HB101,诱导表达获得纯化重组蛋白,用重组蛋白作为包被抗原,初步建立检测GAD自身抗体的酶联免疫吸附测定法(ELISA)方法,评价各片段在1型糖尿病诊断中的价值.结果 获得了4种可被1型糖尿病患者血清识别的重组人GAD抗原区段,其中GAD65(180-585)抗原区段具有很好的特异性,检出率为55.3%,是首选的抗原区段.结论 所选重组人GAD65(180-585)抗原区段具有良好的抗原性,可作为1型糖尿病患者辅助诊断试剂的候选抗原.

糖化血红蛋白与糖调节受损血糖水平相关性的研究

目的 探讨研究糖化血红蛋白(HbAlc)与糖调节受损血糖水平的相关性.方法 2009年2-3月在兰州大学附属白银医院在岗职工中开展口服75 g葡萄糖耐量试验(OGTT)和HbAlc普查,测定空腹血糖、服糖后2 h血糖及HbAlc,采用葡萄糖氧化酶法测定静脉血浆血糖,采用高效液相色谱分析法测定HbAlc.研究资料纳入标准:空腹血糖<7.0 mmol/L且服糖后2 h血糖<11.1mmol/L者,无糖尿病、血红蛋白病、肝、肾疾患等.进入结果分析的对象共726例,男197例,女529例,平均年龄(39±10)岁.其中正常糖耐量636例(87.6%),糖调节受损90例(12.4%),糖调节受损诊断采用1999年世界卫生组织糖尿病诊断标准.率间比较采用χ~2检验,双变量分析采用Pearson相关分析.结果 (1)糖调节受损占HbAlc≤5.7%人群的2.3%,占HbAlc≥5.8%的人群中89.3%.HbAlc≥5.8%时预测OGTT诊断的糖调节受损状态的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为83%、99%、0.89和0.98;(2)OGTT诊断的空腹血糖受损、糖耐量减低及糖调节受损状态的患病率,在HbAlc为5.8%组与5.7%组比较差异具有统计学意义(χ~2值分别为10.077、22.219和27.780,P<0.01或P<0.001);(3)HbAlc水平与空腹血糖受损、糖耐量减低、糖调节受损的患病率之间呈显著性正相关(r值分别为0.957、0.928和0.936,均P<0.01).结论 (1)HbAlc预测糖调节受损与OGTT具有一致性,与OGTT诊断的糖调节受损状态相关的HbAlc佳临界值为5.8%;(2)HbAlc与OGTT诊断空腹血糖受损、糖耐量减低、糖调节受损状态的血糖水平呈显著性正相关,且HbAlc为5.8%与其相关性极其密切.建议当HbAlc≥5.8%时均应行OGTY检查,以明确有无糖调节受损.

类泛素样蛋白4基因A/G163单核苷酸多态性与中国儿童1型糖尿病遗传易感性的关系初探

目的 了解类泛素样蛋白4(SUMO4)基因A/G163单核苷酸多态性与中国儿童1型糖尿病遗传易感性的关系.方法 选取2006年4月至2009年4月于北京儿童医院就诊的无血缘关系的165例儿童1型糖尿病患者及160名正常对照者为研究对象,运用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)技术对SUMO4 163位点的等位基因进行分型.结果 SUMO4 G163等位基因在1型糖尿病患儿中的频率(38.2%)明显高于对照组(28.7%),差异具有统计学意义(P<0.05,OR=1.51,95% CI 1.03～2.13);GG基因型在1型糖尿病患儿中的频率也明显高于正常对照组,差异具有统计学意义(17%vs正常对照8%,P<0.05).SUMO4基因G163等位基因的频率分布在患儿发病年龄、性别、病程、胰岛残存功能,酮症发生情况方面的差异无统计学意义(均P>0.05).结论 SUMO4基因A/G163多态性与中国儿童1型糖尿病的遗传易感性存在显著的相关性;SUMO4基因G163与中国儿童1型糖尿病患者不同临床状态之间无显著相关性.

早期胰岛素治疗对糖尿病大鼠骨骼肌细胞胆固醇调节元件结合蛋白-1c表达的影响

目的 探讨早期胰岛素治疗对糖尿病大鼠骨骼肌细胞内胆固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)表达的影响及可能的分子机制.方法 将7～8周龄高脂喂养联合小剂量链脲佐菌素诱导的雄性糖尿病SD大鼠24只按随机数字表法分为4组:正常对照组、未治疗糖尿病组、胰岛素组、格列齐特组,每组各6只.通过real-time PCR和Western blot法检测骨骼肌细胞SREBP-1c mRNA和核内成熟型蛋白表达水平、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达、信号转导及转录活化子3磷酸化(Tyr705)(p-STAT3)蛋白表达水平.结果 与对照组(3.7±1.1)比较,糖尿病大鼠骨骼肌细胞SREBP-1c mRNA(7.3±2.6)和核内蛋白(3.3±0.4)、TNF-α(0.44±0.03)及P-STAT3蛋白(0.50 ±0.08)表达水平显著上调,早期胰岛素治疗则下调了SREBP-1c mRNA(4.1±1.8)和核内蛋白(2.7±0.3)表达、TNF-α(0.19±0.22)及P-STAT3蛋白(0.29±0.03)表达,差异有统计学意义(P<0.05).结论 早期胰岛素治疗抑制骨骼肌细胞内脂质合成通路中关键转录分子的表达,可能是骨骼肌内脂质沉积减少的机制之一.

三七总皂苷联合氨基胍治疗对糖尿病大鼠肾脏氧化损伤的影响

目的 研究三七总皂苷联合氨基胍治疗对糖尿病大鼠肾组织氧化损伤的影响及其机制.方法 清洁级健康雄性SD大鼠48只,腹腔注射链脲佐菌素,建立糖尿病大鼠模型,按数字表法随机分为糖尿病模型组(n=12)、三七总皂苷治疗组(n=12)、氨基胍治疗组(n=12)和三七总皂苷+氨基胍联合治疗组(n=12);另设正常对照组(n=12).第4、8周应用比色法测定血清及肾皮质超氧化物歧化酶及丙二醛含量,采用荧光光谱法测定血清和肾皮质晚期糖基化终产物含量,行肾组织PAS染色并测定肾小球平均截面积,计算肾小球平均体积.采用单因素方差分析进行组间比较.结果 三七总皂苷+氨基胍联合治疗组血清及肾皮质晚期糖基化终产物(F=36.017,P<0.01;F=8.213,P<0.01)、丙二醛(F=8.683,P<0.01;F=14.615,P<0.01)、内生肌酐清除率(F=7.233,P<0.01)、肾小球平均截面积(F=24.317,P<0.01)、肾小球平均体积(F=26.145,P<0.01)、尿蛋白量(F=17.108,P<0.05)、肾脏重量(F=5.182,P<0.05)、肾脏肥大指数(F=50.169,P<0.01)低于糖尿病模型组,血清及肾皮质超氧化物歧化酶(F值分别为6.260、7.666,均P<0.01)、体重(F=10.449,P<0.05)高于糖尿病模型组.三七总皂苷+氨基胍联合治疗组血清丙二醛低于氨基胍治疗组(F=8.683,P<0.05),肾皮质丙二醛低于氨基胍治疗组和三七总皂苷治疗组(F=14.615,P<0.05),血清晚期糖基化终产物低于氨基胍治疗组和三七总皂苷治疗组(F=36.017,P<0.01或<0.05),肾皮质晚期糖基化终产物低于氨基胍治疗组和三七总皂苷治疗组(F=8.213,P<0.05).8周末时,三七总皂苷+氨基胍联合治疗组肾小球平均截面积、肾小球平均体积均低于三七总皂苷治疗组(F值分别为24.317、26.145,均P<0.05)和氨基胍治疗组(F值分别为24.317、26.145,均P<0.05).结论 三七总皂苷+氨基胍联合治疗可通过减轻肾组织氧化应激反应、减少肾组织晚期糖基化终产物的生成与蓄积对糖尿病大鼠肾脏起到保护作用,其作用优于单一药物治疗.

应用RNA干扰技术研究游离脂肪酸对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术探讨游离脂肪酸(FFA)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的影响.方法 利用体外同源重组技术构建糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)特异的siRNA腺病毒表达载体,在人胚胎肾293A细胞中包装并扩增病毒,应用空斑实验法测定病毒滴度.选用GsK-3β特异的RNAi腺病毒感染HUVEC,采用Western blot方法检测其对GSK-3β和β-catenin 蛋白水平的影响.FFA贮存液按油酸盐:棕榈酸盐2:1配制,RNAi腺病毒和FFA共同干预HUVEC,采用流式细胞术、Hoechst 33258染色检测细胞凋亡.实验分为0.75 mmol/L FFA组、GSK-3β特异性RNAi腺病毒(Ad-640)+FFA组、未重组RNAi腺病毒(Ad-DEST)+FFA组、正常细胞组.采用方差分析进行数据比较.结果 构建的RNAi腺病毒感染HUVEC可以显著抑制GSK-3β蛋白的表达,上调细胞内β-catenin蛋白水平.0.75 mmol/L FFA具有促进细胞凋亡率的作用,荧光染色可见细胞出现典型的凋亡形态学改变;Ad-640+0.75 mmol/L FFA组与0.75 mmol/L FFA组(F=26.42,P<0.01)及Ad-DEST+0.75 mmol/L FFA组(F=23.34,P<0.01)相比细胞凋亡率显著减少,凋亡形态学改变亦明显减少,而Ad-DEST+FFA组与FFA组细胞凋亡率无显著差异(F=5.56,P>0.05),凋亡形态学改变相似.结论 构建的CSK-3β特异性RNAi腺病毒对FFA作用下的HUVEC具有部分保护作用.

门诊2型糖尿病足高危患者的踝肱指数与糖尿病足的相关性研究

目的 对有下肢症状的门诊2型糖尿病患者进行踝肱指数(ankle-brachial index,ABI)监测,了解糖尿病下肢血管病变的患病率并探讨ABI与糖尿病足的关系.方法 在上海市糖尿病临床医学中心门诊就诊的1010例有下肢症状的2型糖尿病患者中测定ABI,同时测定空腹和餐后血糖、糖化血红蛋白(HbA1e)、血压、体重指数(BMI)、双下肢的振动感觉阈值等,按ABI结果将患者分为5组:A组(ABI>1.3,35例)、B组(0.91.3占3.5%(35/1010).合并足病者83例(8.02%),包括溃疡50例(4.95%),坏疽13例(1.29%),感染20例(1.98%).相关分析显示ABI与年龄、病程、收缩压、HbA1c和糖化血清白蛋白呈显著负相关(r值分别为-0.201、-0.171、-0.113、-0.160、-0.137,均P<0.01).Logistic回归分析显示ABI是糖尿病足病的独立危险因素(t=6.805,P=0.00).结论 门诊2犁糖尿病足高危患者中26.4%存在下肢动脉病变,8.02%存在足病.年龄、病程、血糖控制不佳是影响ABI的关键因素.ABI的降低与足病的发生密切关联.

G蛋白偶联受体40在游离脂肪酸影响小鼠胰岛NIT-1细胞增殖中的作用

目的 探讨G蛋白偶联受体40在游离脂肪酸影响小鼠胰岛NIT-1细胞增殖中的作用.方法 细胞分为空白对照组、棕榈酸组、硬脂酸组、油酸组、亚油酸组、棕榈酸+油酸组,各组采用游离脂肪酸孵育12、48 h,比较各组干预对NIT-1细胞增殖的影响,细胞增殖采用CCK-8法、5'-溴-2脱氧尿苷(Brdu)-ELISA法检测.转染G蛋白偶联受体40 siRNA以抑制G蛋白偶联受体40在NIT-1细胞表达,细胞分为空转组、对照siRNA转染组、G蛋白偶联受体40 siRNA转染组,分别观察不同游离脂肪酸干预12、48 h后细胞增殖情况.应用Western blot观察游离脂肪酸孵育及抑制G蛋白偶联受体40表达对Egr-1表达的影响.采用方差分析进行统计学分析.结果 各组游离脂肪酸孵育12 h均可促进NIT-1细胞生长.棕榈酸及硬脂酸孵育48 h后细胞增殖较对照组明显下降,油酸及亚油酸孵育48 h后仍促进细胞增殖.棕榈酸和油酸共孵育48 h后,细胞增殖较棕榈酸、硬脂酸单独孵育明显增加.抑制G蛋白偶联受体40表达后,分别予棕榈酸、硬脂酸孵育NIT-1细胞12、48 h,G蛋白偶联受体40 siRNA转染组细胞吸光度值较空转组无明显差异;予油酸、亚油酸孵育NIT-1细胞12、48 h,G蛋白偶联受体40 siRNA转染组细胞吸光度值与空转组相比明显减少.G蛋白偶联受体40 siRNA转染组细胞子棕榈酸/油酸共孵育12、48 h后,吸光度值较空转组下降(CCK-8法:q值分别为7.834、8.236,均P<0.05;Brdu-ELISA法:q值分别为7.981、5.376,均P<0.05).Western blot显示棕榈酸孵育对Egr-1蛋白表达水平无明显影响,油酸孵育后可见Egr-1表达明显上调,抑制G蛋白偶联受体40表达后,油酸刺激Egr-1水平较空转组明显降低.结论 饱和脂肪酸对胰岛β细胞的双向调节作用不依赖G蛋白偶联受体40;而不饱和脂肪酸对胰岛B细胞的增殖促进作用及对饱和脂肪酸长期负性作用的抑制至少部分通过G蛋白偶联受体40介导,这一作用伴有Egr-1表达上调.上述结果提示G蛋白偶联受体40可能参与调节胰岛B细胞代偿.

微小核糖核酸miR-541在1型糖尿病中的遗传变异研究

目的 对1型糖尿病(T1DM)儿童微小RNA miR-541基因进行筛查,以了解T1DM儿童该基因变异情况.方法 选择2006年1月至2009年8月在南京医科大学附属南京儿童医院内分泌科确诊的T1DM患儿69例和46名健康对照儿,用PCR扩增结合直接测序方法,对miR-541基因-1084～+167区域的遗传变异进行筛选;用限制性片段长度多态性(RFLP)方法对筛选出的特定变异位点检测,并用RNA二级结构分析软件RNAfold分析.结果 发现1个单核苷酸多态性(SNP)数据库报道的SNP(rs12893725),以及新发现3个未报道的基因变异,其中-284杂合C→T、-569杂合G→A为SNP在健康对照和糖尿病儿童均存在,其发生率、发病年龄和发病时糖化血红蛋白在患者和对照组中无显著差异.因-404杂合G→T基因变异仅在3例糖尿病患者发现,随后采用RFLP对该位点变异在另外105名健康对照者进行筛查,发现健康对照者和T1DM儿童的-404杂合D→T基因变异发生率分别为1/(46+105)和3/69,是一种少见SNP,RNAfold分析发现-404G→T基因变异显著影响miR-541前体二级结构,可能导致其处理和表达差异.结论 发现miR-541基因在T1DM存在遗传变异,其中-404杂合G→T是可能的糖尿病相关变异.

内源性小核糖核酸在糖尿病领域的研究进展

2型糖尿病是一种复杂的慢性代谢性疾病,其发生发展涉及多种基因和蛋白质,而内源性小RNA(MicroRNA,简称miRNA)的发现则为糖尿病的研究开辟了新视角.miRNA是牛物体内生成的具备基因功能调节的非编码短序列RNA,长度为20～23个核苷酸;它在进化中的高度保守性及在表达时间和空间上的特异性蕴示着它对生物的生长发育、组织功能具有苇要的调控作用.

由全球1型糖尿病发病率调查结果带来的思考

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)是儿科内分泌常见的慢性疾病之一.每年全世界15岁以下的儿童中,大约有70 000人被发现患有T1DM[1].纵观几十年来T1DM的发病情况,世界不同地区、不同种族的发病率明显上升.我们如何看待这种变化趋势?我们应该怎么办?

1型糖尿病治疗研究进展

1 型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)是一种T淋巴细胞(T细胞)介导的器官特异性自身免疫性疾病,主要是由于体内胰岛细胞免疫性破坏,导致胰岛素绝对缺乏从而引起血糖持续升高[1].T1DM患者人数目前占糖尿病患者总数的5%～10%,是儿童及青少年常见的内分泌疾病.

自身免疫糖尿病分子免疫学机制研究进展

[编者按] 对于较少接触免疫学的人来说,2009年美国糖尿病学会Banting高科学成就奖获得者George Eisenbarth对自身免疫糖尿病的研究内容有些艰涩难懂,而当今免疫学研究及其新词汇进展迅速,对复杂的免疫细胞途径理解不够透彻将成为我们了解1型糖尿病(以下均指1A型糖尿病,即自身免疫糖尿病)发病机制及其治疗进展的一大障碍.本文旨在通过解读Banting科学成就奖中自身免疫糖尿病分子免疫学研究进展的同时,介绍一些与1型糖尿病相关的免疫学新概念.

糖尿病免疫学研究:机遇、挑战与希望

糖尿病免疫学研究的根本目的在于从免疫学角度揭示糖尿病的病因及其发病机制,从而洞察糖尿病临床表型的本质,为糖尿病分型诊断和免疫干预提供理论基础和实践策略,终实现对其有效的预防与治疗.自发现胰岛自身抗体以来,在科学技术发展日新月异的大背景下,糖尿病免疫学研究历经三十余载尤其是近年取得重要进展,呈现一派欣欣向荣的景象,进入了一个新的发展阶段.对国内同行而言,机遇与挑战并存,我们应审时度势地解决问题,弘扬特色,勇于创新,做出贡献.

阻塞性睡眠呼吸暂停与糖尿病

阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)在2型糖尿病患者中很常见[1],同样OSA患者对2型糖尿病的易感性约为正常人群的3倍[2].近期研究结果显示,即使除外肥胖这一因素这两种疾病也可能具有显著相关性.有效地治疗OSA有助于糖尿病的预防和控制,包括减少并发症.

地特胰岛素的临床实践:PREDICTIVE研究结果分析

对于使用胰岛素治疗糖尿病的患者,选择作用平稳、变异性小、安全性好的基础胰岛素治疗十分重要.目前可提供基础胰岛素的宅要有胰岛素泵持续皮下输注短效胰岛素或胰岛素类似物、皮下注射中效或长效胰岛素或长效胰岛素类似物.传统的长效人胰岛素,由于存在较大的吸收变异性已退出医疗市场.胰岛素泵由于费用较高,对使用者有一定的能力要求,影响日常生活等原因,其广泛和长期使用受到了限制.目前可注射使用提供基础所需胰岛素的剂型主要包括中性鱼精蛋白锌胰岛素(NPH)、甘精胰岛素和地特胰岛素.

非酒精性脂肪性肝病诊疗指南

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种与胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤,其病理学改变与酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)相似,但患者无过量饮酒史,疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)及其相关肝硬化和肝细胞癌[1-2].

《中华糖尿病杂志》第一届编辑委员会第一次全体会议隆重召开

时间的巡礼

钟表嘀嗒、嘀嗒,日历悄然翻过,能让无形的时间成为看得见的流逝的,除了钟表和日历外,还有杂志.随着本期杂志封面的数字由2009变为2010,<中华糖尿病杂志>自创刊至今已经跨越了整整一年的时光.

希望

那是在2007年一个大雪纷飞的冬日,我领着一个叫小雨的患儿去请主任会诊.小雨穿着深蓝色羽绒服,羽绒服上大大的帽子严严地遮住脑袋,他低着头不说话,一旁衣着简朴的母亲正向主任讲述着.原来,小雨3岁时被发现患有糖尿病,血糖忽高忽低,基本上波动在20～30 mmol/L.