鲑鱼降钙素新型注射用温度敏感原位凝胶系统的构建及评价

目的构建鲑鱼降钙素新型注射用温度敏感原位凝胶系统并对其胶凝特性和降血钙效应进行评价。
　　方法以泊洛沙姆 F127为主要基质材料，复合使用泊洛沙姆 F68，制备鲑鱼降钙素注射用温度敏感原位凝胶给药系统，以胶凝温度、胶凝时间、流变学、质构特性为考察指标，对该凝胶系统性质进行评价；采用大鼠眼眶取血，钙显色法监测体内血清钙离子浓度，对该凝胶系统降血钙效应进行研究。
　　结果所制备的鲑鱼降钙素注射用温度敏感原位凝胶的胶凝温度为（35.3±1.3）℃，胶凝时间为（108.3±5.5）s，在25℃条件下为流动的液体，原位凝胶的黏度和黏滞力极低，方便注射给药，当温度增至37℃时能够迅速发生相转变，黏度和黏滞力等质构特性数据显著增加，成为具有一定胶凝强度的半固体；大鼠降血钙效应结果显示，该给药系统具有明显的缓释作用，其24 h 时血钙浓度明显低于普通注射剂组，相对于普通注射剂的药理活性为138.6%。
　　结论温度敏感原位凝胶用于鲑鱼降钙素的注射给药，是一种很有潜力的递送系统。

hDll1ext-Fc融合蛋白的表达纯化与初步鉴定

目的获得高效表达 hDll1ext-Fc 融合蛋白的细胞系以及具有生物学活性的目的蛋白。
　　方法根据已知序列设计引物，并将 hDll1ext 基因片段经PCR 扩增，酶切后连接至 pIRES2-EGFP-Fc 中，挑选阳性克隆测序，将正确的重组质粒转染至 CHO-S 细胞，筛选高表达细胞系，利用 rProtein A 亲和柱纯化目的蛋白，并通过检测 Notch 下游信号分子 Hes1的表达及双荧光素酶报告基因实验检测蛋白活性。
　　结果构建了 pIRES2-EGFP-hDll1ext-Fc 真核表达载体，并筛选了高效表达 hDll1ext-Fc 的 CHO-S 细胞系，纯化得到较高纯度的融合蛋白，配合生物活性检测实验显示，可溶性的 hDll1ext-Fc 能够激活 Hes1报告基因，并且能上调Notch 下游分子 Hes1的表达，证明其能够激活 Notch 信号通路。
　　结论在 CHO-S 细胞中成功表达了 hDll1ext-Fc 融合蛋白，为进一步研究 Delta-like-1的生物学功能奠定重要基础。

三氧化二砷联合顺铂抑制C6胶质瘤细胞增殖的实验研究

目的探讨三氧化二砷（As2O3）联合顺铂（CDDP）抑制 C6神经胶质瘤细胞增殖情况及其分子机制。
　　方法体外实验采用 MTT 法检测对 C6神经胶质瘤细胞的抑制率，流式细胞法检测 C6胶质瘤细胞的凋亡及周期， Western blot 检测 caspase-3、PTEN、PI3K、Akt 蛋白表达水平；体内实验采用免疫组化法检测 caspase-3、IκB-α调控因子的表达，并观察大鼠的生存情况。
　　结果 As2O3、CDDP 及联合应用分别作用于 C6神经胶质瘤细胞24 h 后的细胞增殖大抑制率分别为34.37%、31.73%和76.40%，其相应药物浓度分别为12.5、10.0、（12.5+10.0）μmol/L；两者联用后对 C6胶质瘤细胞作用24 h 后的凋亡率分别为从单独用药时的（4.60±1.12）%、（14.59±0.79）%提高到（36.13±1.55）%；采用 PI 单染检测的细胞周期也进一步证明了联合用药增加了 C6细胞的周期抑制作用。Caspase-3、PTEN 蛋白在联合组 C6胶质瘤细胞中表达显著上调，而 PI3K、Akt 蛋白在联合组C6胶质瘤细胞中表达下调；免疫组化法检测结果显示， caspase-3调控因子在联合组用药的 C6胶质瘤细胞中的表达上调，而 IκB-α调控因子表达下调；但体内实验表明，在18 d 观察期内各组大鼠的生存期无明显差异（ P =0.2531）。
　　结论 As2O3联合 CDDP 通过上调 caspase-3和 PTEN，下调 PI3K、Akt 及 IκB-α抑制胶质瘤细胞体内外的生长。

丰肉结海绵相关真菌产黄青霉HLS111菌株活性代谢产物研究

目的对我国南海水域丰肉结海绵相关真菌产黄青霉菌HLS111的活性代谢产物进行研究。
　　方法采用 HPLC-DAD 技术与活性筛选相结合的方法，通过硅胶柱、凝胶柱及 HPLC 等色谱方法对 HLS111发酵产物进行分离纯化；通过核磁共振、质谱等波谱分析手段对分离得到的化合物进行结构鉴定；并对单体化合物进行抗肿瘤、抗 HIV、抗炎活性测定。
　　结果分离得到12个化合物。其中2个黑麦酮酸类化合物：黑麦酮酸 F（1）和D（2）；4个生物碱类化合物：环（L-色氨酸-L-苯丙氨酸）（3）、citreoindole（4）、meleagrin （5）、脑苷脂B（6）；4个甾体类化合物：麦角甾醇（7）、(22E,24R)-5α,8α-过氧化麦角甾-6,22-烯-3β-醇（8）、globosterol（9）、β-谷甾醇（10）；1个三萜类化合物：24-亚甲基环木菠萝烷醇-反式阿魏酸（11）；1个蒽醌类化合物：大黄素（12）。对化合物4的氢谱、碳谱数据进行了归属。初步的药理研究表明，黑麦酮酸类化合物表现出较强的抗肿瘤活性，化合物 citreoindole 表现出一定的抗 HIV及抗炎活性。
　　结论海绵相关真菌产黄青霉 HLS111菌株体现了次生代谢产物化学结构的多样性；黑麦酮酸类化合物为产黄青霉HLS111的主要抗肿瘤活性成分。

同一组织来源的肝癌干细胞分化能力异质性的体外研究

目的通过比较肝癌干细胞的不同单细胞克隆的体外分化能力，分析同一组织来源的肿瘤干细胞分化能力是否具有异质性，以进一步明确肿瘤干细胞的分化特性，为靶向肿瘤干细胞的治疗提供实验依据。
　　方法通过有限稀释法对肝癌干细胞进行单细胞克隆培养，获得的单细胞克隆通过 MTT 测定比较其增殖能力。然后分别挑选增殖速度较快和较慢的3个克隆，采用 RT-PCR 方法比较其干细胞标志物表达水平。对干细胞标志表达水平高的3个克隆（A2、A3和 B2）进行向成骨、软骨和脂肪方向的诱导分化。采用实时荧光定量 PCR 方法检测诱导前后成骨、软骨和脂肪标志分子的表达。
　　结果获得的20个单细胞克隆增殖能力不同，并且增殖能力快的克隆表达干细胞标志物 CD133、Oct4、c-kit、SCF、nestin 比增殖能力慢的克隆强。向成骨方向诱导后，A2、A3和 B2克隆 I 型胶原 mRNA 表达水平分别升高了（4.71±0.11）、（2.13±0.15）和（3.82±0.3）倍；骨钙素mRNA 的表达水平分别升高（8.55±0.18）、（7.02±0.03）和（7.91±0.09）倍，说明 A2克隆向成骨细胞分化能力强。向软骨方向诱导后，B2分化能力强，软骨标志分子蛋白聚糖和 II 型胶原的表达分别上调（25.01±0.19）倍和（17.49±0.19）倍，而在 A2未发生明显变化，A3只轻微上调。向脂肪方向诱导后， A2、A3和 B2克隆脂联素mRNA 表达水平分别升高了（6.12±0.15）、（11.45±0.36）和（12.41±1.03）倍，过氧化物酶体增殖物激活受体γmRNA 的表达水平分别升高（4.92±0.02）、（9.54±0.18）和（8.96±0.11）倍。
　　结论来源于同一组织的肝癌干细胞在分化能力上具有异质性，这可能是导致肿瘤组织异质性的原因之一，也提示靶向肿瘤干细胞的治疗需要联合用药。

注射用布氏菌活疫苗免疫学评价

目的以小鼠为动物模型，通过检测布氏菌活疫苗免疫小鼠产生的体液免疫、细胞免疫应答及保护力，对其进行免疫学评价。
　　方法将30只小鼠随机分为3组，皮下免疫布氏活疫苗，免疫4周后分离血清及脾脏淋巴细胞。ELISA法检测免疫动物血清中总 IgG 抗体，抗体亚类 IgG1及 IgG2a；ELISPOT 法检测分泌 IFN-γ、IL-4的脾脏淋巴细胞数目，以及用 ELISA 方法检测体外再刺激后小鼠脾细胞分泌IFN-γ、IL-4的细胞因子水平；用羊布氏菌弱毒株 M5攻击免疫动物，通过脾脏细菌计数评价布氏活疫苗的免疫保护作用。
　　结果用 ELISA 法检测到免疫布氏活苗的小鼠体内有特异性抗体产生；ELISPOT 可检测到较高的分泌 IFN-γ脾脏淋巴细胞数目，ELISA 方法可检测到较高的 IFN-γ水平，表明布氏活疫苗主要诱导 Th1型免疫应答；通过布氏活疫苗保护力分析，表明该疫苗具有较好的免疫保护效果。
　　结论布氏疫苗采用注射免疫途径是可行的，免疫后能获得较好的免疫效果。

具有血管内皮细胞生长因子受体-2酪氨酸激酶抑制作用的链霉菌次生代谢产物2754R的研究

目的分离鉴定链霉菌 I06A-02754发酵液中具血管内皮生长因子受体-2酪氨酸激酶（VEGFR2-CD）抑制活性的强极性次生代谢产物。
　　方法采用大孔吸附树脂、阴离子交换树脂、MPLC、HPLC等分离手段对次生代谢产物进行分离纯化；通过 UV、IR、HR-ESI 质谱、1D-NMR 和2D-NMR 对其结构进行鉴定，以 ELISA 法检测其次生代谢产物对 VEGFR2-CD 的抑制活性；以 MTT 法检测化合物对肿瘤细胞的抑制活性。
　　结果从发酵液的水溶性部分分离得到一个极性较大的胡桃霉素类次生代谢产物--2754R；其化学结构与胡桃霉素D 一致，对 VEGFR2-CD 表现出一定的抑制活性；MTT 实验显示化合物2754R 对 HepG2细胞、MCF-7细胞和BEL-7402细胞没有明显的抑制活性（IC50>10μmol/L）。
　　结论化合物2754R 是具有 VEGFR2-CD 活性的胡桃霉素类次生代谢产物。

软腐病病原菌对金钗石斛致病性的形态学研究

目的旨在研究软腐病病原菌终极腐霉对金钗石斛致病的形态学特征。
　　方法利用终极腐霉孢子悬液喷洒法对金钗石斛组培苗叶片进行致病性实验，对健康的以及感染终极腐霉48 h 后的金钗石斛的叶片应用水压片法在光学显微镜下观察两者的形态差别。对健康的金钗石斛及感染终极腐霉48 h 后的植株的根、茎、叶进行扫描电镜观察并分别比较致病前后微观结构的差异。
　　结果压片法观察叶片部位结果显示，健康的金钗石斛叶片结构完整；致病组可见终极腐霉病原菌在金钗石斛叶片中生长旺盛，大量卵孢子和孢子囊分布于叶肉细胞间。感染病原菌后的叶肉细胞完整性受到严重破坏。扫描显微镜观察结果显示：叶肉细胞、叶鞘组织、幼嫩根尖细胞以及根被为发病的关键部位。在茎部菌丝通过消解细胞壁进入细胞。在根部菌丝除通过消解细胞壁进入细胞外，还通过根被表面的许多孔洞进入细胞。病原菌菌丝体通过叶背面大量分布的气孔结构或叶表面极具破坏性地进入叶片体内，并形成典型的附着胞结构。
　　结论终极腐霉主要通过机械穿透和分泌降解酶破坏寄主细胞的细胞壁及其内部结构。

人CaMKKβ蛋白的原核表达、纯化及活性测定

目的对原核体系表达的 CaMKKβ蛋白体外活性进行探索，为针对 CaMKKβ、AMPK 药物研发提供科研基础。
　　方法克隆人 CaMKKβ基因，建立原核表达载体pET28a-CaMKKβ，将其转化入 E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞内，在16℃、0.02 mmol/L IPTG 条件下诱导重组表达CaMKKβ蛋白，Ni-NTA 纯化6His-CaMKKβ蛋白，并利用 Glo?Max Assay 方法检测其活性。
　　结果通过基因测序表明 pET28a-CaMKKβ质粒构建成功；重组人 CaMKKβ蛋白可溶性表达量较高，Ni-NTA 纯化6His-CaMKKβ蛋白纯度可达80%以上，活性检测结果表明，大肠杆菌体系内表达的人 CaMKKβ蛋白在 CaM/Ca2+存在与否情况下，酶活基本一致。
　　结论成功构建原核表达载体 pET28a-CaMKKβ，实现重组人 CaMKKβ在原核体系内可溶性表达，活性测定表明原核体系内表达的 CaMKKβ自主酶活性较强，受 CaM/Ca2+影响较小。

PCR技术在城市空气卫生检测中的应用

世界卫生组织（WHO）在1994年提出了健康城市的定义：“健康城市应该是一个不断开发、发展自然和社会环境，并不断扩大社会资源，使人们在享受生命和充分发挥潜能方面能够互相支持的城市”。国外中大型城市正在通过改善城市空气品质来逐步实现该目标。然而，我国城市空气质量相当严峻，城市离健康标准仍有较大差距，广泛存在以颗粒物2.5（particulate matter 2.5，PM 2.5）为核心的灰霾污染。生物气溶胶作为 PM 2.5的重要组成部分，是指悬浮于气态介质中生物来源的颗粒物，包括细菌、真菌、病毒和它们的副产物等，直接影响城市空气卫生质量。生物气溶胶无处不在，通过呼吸暴露会造成诸多负面健康效应，如肺功能障碍、哮喘、传染性和过敏性疾病等。与此同时，伴随城镇化的稳步推进、城市人口的高密度集聚和生产生活方式的改变，城市空气卫生污染作为 PM 2.5危害的核心组成部分，对人群健康构成的潜在暴露风险日益凸显。空气生物卫生质量的检测是表征其暴露风险的关键步骤。本文系统介绍了国内外在空气微生物离线检测的若干经典和先进技术手段，并结合当前空气卫生监管的需要进行评价，为国内相关卫生机构提升检测水平提供参考。

去唾液酸糖蛋白受体的研究现状

去唾液酸糖蛋白受体（ asialoglycoprotein receptor ， ASGPR），也被称为肝细胞半乳糖/N-乙酰基葡糖胺受体，或者 Ashwell-Morell 受体[1]。它主要表达于肝窦状间隙的肝实质细胞表面，是第一个被发现的凝集素。由于它结合配体的钙离子依赖性，因此属于 C 型凝集素。ASGPR 能够介导去唾液酸化的糖蛋白被肝细胞内吞降解[2]。目前已知的ASGPR 的配体非常多，提示其在糖蛋白代谢、脂代谢、凋亡细胞降解、调节凝血、介导病毒进入细胞和自身免疫性炎症反应等多个生理环节均发挥着重要的作用[3]。

2014第二届中国膳食纤维产业高峰论坛在京召开

5月21日，由我会膳食纤维技术分会和《新营养》联合主办的“2014第二届中国膳食纤维产业高峰论坛”在京召开。
　　会议以“膳食纤维产业创新成长力”为主题，与会代表就膳食纤维的技术创新、应用研发以及市场销售展开了热烈的讨论，大家一致认为，要利用膳食纤维技术分会这个平台，积极呼吁政府完善相关法规，使膳食纤维的生产、检测等有据可依；建议从公众营养的角度把膳食纤维纳入营养标签中的基本营养素范围；各企业联合实施“膳食纤维科普工程”，提高大众对膳食纤维的认知度。我会顾问肖梓仁教授出席会议。

2014兰州国际细胞治疗与再生医学转化论坛举办

5月21-23日，由我会生物技术临床应用专业委员会、国家干细胞与再生医学产业技术创新战略联盟、兰州大学第一医院主办的“2014兰州国际细胞治疗与再生医学转化论坛”在兰州举办。

CRP、qPCR、组织病理学冰冻和石蜡切片评价在诊断假体关节感染中的应用

假体周围关节感染（periprosthetic joint infection，PJI）是髋关节和膝关节手术严重的并发症，一旦发生，常常给患者造成灾难性后果，而且长期抗感染及多次手术将极大地增加患者经济负担并影响关节功能[1]。PJI 在诊断方面仍然非常困难[2]，常规细菌培养在很长一段时间被视为诊断 PJI的“金标准”。然而，近的研究表明，这种方法的准确性有限，尤其在低度感染时，常引起假阴性结果[3]。所以迫切需要一个更准确的诊断方法。唐浩和周一新[4]报道，如果符合以下标准，可以认为 PJI 明确存在：①存在与假体相通的窦道；②受累人工关节的2处假体周围组织或关节液标本中分离出同一病原体；③满足以下6条中的4条：红细胞沉降率（ESR）或 C 反应蛋白（CRP）水平升高、滑膜白细胞计数升高、滑膜中性粒细胞（PMN）百分比升高、受累关节出现化脓表现、假体周围组织或关节液标本中1次培养分离出细菌、400倍放大率下，假体周围组织的病理学分析在每高倍显微视野下发现大于5个 PMN。

焦磷酸测序法与Sanger测序法检测CYP2C19*17基因多态性方法学对比研究

随着个体化诊断与个性化用药相关研究的进展，由CYP2C19引起的药物氧化代谢个体差异和种族差异越来越引起临床重视，大量内源性底物和临床应用的大约2%的药物均由 CYP2C19催化代谢[1]，如对抗癫痫药物[2]（丙戊酸和苯妥英钠等）、质子泵抑制剂[3]（奥美拉唑、兰索拉唑等）、抗抑郁药[4]（西酞普兰等）的代谢影响，其基因多态性是引起同一药物在不同个体和种族间表现出不同代谢能力的主要原因之一[5]。其中，CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17在人群中所占比例较高，前两者相对于酶的活性是下调作用，目前临床检测较为广泛。而 CYP2C19*17对酶的活性是上调作用，等位基因突变占亚洲人群比例为5%。

国家卫生计生委要求做好2014年抗菌药物临床应用管理工作

为做好2014年抗菌药物临床应用管理工作，根据2014年全国卫生计生工作会议精神和《抗菌药物临床应用管理办法》，国家卫生计生委提出如下工作要求：
　　一、持续巩固加强抗菌药物临床应用管理工作。继续落实2013年抗菌药物管理各项要求；加大门诊、急诊抗菌药物静脉使用管理力度；不断提高抗菌药物临床应用管理水平。

国家卫生计生委修订艾滋病患者免费抗病毒治疗标准

世界卫生组织发布《使用抗逆转录病毒药物治疗和预防艾滋病毒感染指南》，公布了新的艾滋病抗病毒治疗标准。中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心组织国家卫生计生委艾滋病临床专家组对《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册（2012年版）》（卫办医政发〔2012〕69号）（简称《手册（2012年版）》）中的免费抗病毒治疗标准进行修订。其他内容仍参照《手册（2012年版）》执行。

科技部修订《国家重点实验室评估规则》

为深入实施创新驱动发展战略，落实科技体制改革要求，更好发挥国家重点实验室评估导向作用，不断增强国家重点实验室科技创新能力，根据《国家重点实验室建设与运行管理办法》，科技部对2008年制定的《国家重点实验室评估规则》进行了修订。修订后的《国家重点实验室评估规则》自发布之日起施行。原《国家重点实验室评估规则》（国科发基〔2008〕731号）同时废止。

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基于ISO27001体系的生物样本库信息风险评价

ISO27001标准前身为英国的 BS7799标准，该标准由英国标准协会（BSI）于1995年2月提出，并于1995年5月修订而成。2005年国际标准化组织（简称：ISO）将BS7799转化为 ISO27001：2005发布，后由国际标准化组织及国际电工委员会（IEC）修订认可。我国2008年将ISO27001：2005转化为国家标准 GB/T 22080：2008。该标准指出“像其他重要业务资产一样，信息也是一种资产。它对一个组织具有价值，因此需要加以合适地保护”[1]。信息安全防止信息受到各种威胁，以确保业务连续性，使业务受到损害的风险降至低，使投资回报和业务机会大。该标准包括对于信息安全管理的建议、信息安全管理系统领域中的风险及相关管控。本文将基于 ISO27001标准中的信息安全风险评价方法，通过研究医院生物样本库的共性，开展信息风险评价工作。

乳腺癌中乙醛脱氢酶1与上皮性钙黏蛋白、神经性钙黏蛋白关系的研究

乳腺癌干细胞是一类具有自我更新及多向分化潜能的原始细胞，在一定条件下可以分化成多种不同功能的细胞，从而影响乳腺癌的发生、发展、转移、耐药及复发等生物学行为[1]。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）在乳腺癌浸润转移过程中起着重要作用。本实验应用免疫组织化学方法研究乳腺癌干细胞标志物乙醛脱氢酶1（ALDH1）蛋白与 EMT 标志蛋白上皮性钙黏蛋白（E-cadherin）、神经性钙黏蛋白（N-cadherin）在正常乳腺组织、乳腺癌、转移性淋巴组织中的表达情况，探讨乳腺癌干细胞与乳腺癌浸润转移的关系。

谈生物医药领域技术秘密与专利保护模式的选择

近年，知识产权，特别是专利在促进我国医药生物技术研发和产业发展中的作用越来越大。随着我国国家知识产权战略的逐步推进，医药企业实现由仿制向自主创新的模式转变将成为大势所趋。为了能及时有效地保护科研人员的智力成果，申请专利是佳选择。为了帮助广大医药工作者进一步了解医药及生物领域知识产权保护的政策和法律法规，提高发明专利申请文件的质量，了解专利局的审查实践，更好地做好专利申请工作。我刊特邀了国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心相关专家撰写了系列讲座，希望能够对医药企业，科研院所的相关工作人员提供一定的帮助。

2013年生命科学、生物技术研究动态

2013年生命科学和生物技术领域基础研究、应用研究不断深入，由于篇幅有限，笔者仅就世界各国对热门的脑科学研究、干细胞研究、基因组测序、基因研究和其他一些方面的研究进行简单的介绍，供读者参考。
　　1“脑科学研究”火热兴起
　　欧盟委员会表示，欧洲很多人患上与脑有关的疾病，为此一定要加强脑科学研究。另外，脑科学研究不但可以揭开大脑高智能、高效率、低耗能之谜，对人工智能、基因组学、细胞生物学、生理学、生物信息学、解剖学、行为科学、信息技术、纳米技术和营养学都有重要的拉动作用。此外，脑科学研究还会催生一系列新产品、新服务，推动经济和社会发展。至此，欧盟委员会在2013年1月份宣布人脑工程入选欧盟“未来新兴旗舰技术项目”并设立专项研发计划，该项计划将在未来10年内分别拨10亿欧元经费。揭示大脑奥秘，了解神经疾病及药物作用，用超级计算机建立详细的人类大脑模型。美国于2013年4月份也公布了一项可同“人类基因组计划”相提并论的“脑计划”。探索人类大脑工作机制、绘制脑活动全图，试图对无法治愈的大脑疾病开发出新的疗法。日本也制定了“脑科学时代”计划。发达国家出现了脑科学研究热，各国都在抢占制高点。