中国医药生物技术杂志
Chinese Medicinal Biotechnology 중국의약생물기술
- 主管单位: 中华人民共和国卫生部
- 主办单位: 中国医药生物技术协会
- 影响因子: 0.36
- 审稿时间: 1-3个月
- 国际刊号: 1673-713X
- 国内刊号: 11-5512/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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《第六届中国生物样本库标准化建设与应用研讨会暨首届中国生物样本库院长高峰论坛》会议纪要
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生物诊断技术分会血液筛查技术专业学组成立
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干细胞技术研究与发展论坛召开
关键词: 细胞技术 -
第七届全国生物治疗大会筹备会在上海召开
关键词: 生物治疗 -
Corning? hybrigro SF?培养基对提高杂交瘤细胞培养密度和抗体产量的研究
近几年,抗体作为生物类治疗药物的需求显著增长。因此,提高抗体生产效率并且降低生产成本愈发必要。而康宁hybrigro SF?培养基的开发,正是致力于在不使用昂贵血清的情况下仍能够高效培养杂交瘤细胞,提高抗体产量。我们使用两种不同的杂交瘤细胞株,并通过与两种商业化生产的无血清培养基以及一种被广泛使用的含血清培养基对比,验证 hybrigro SF?培养基在高密度杂交瘤细胞培养及蛋白产量方面的优越性。
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国家药典委员会对《中国药典》2015年版三部增修订内容征求意见
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科技部、国家卫生计生委和总后勤部卫生部联合印发《国家临床医学研究中心管理办法(试行)》
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国家卫生计生委发布《临床实验室生物安全指南》等两项推荐性卫生行业标准
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浅析TNF-α抗体及其代表产品Humira的专利布局
近年,知识产权,特别是专利在促进我国医药生物技术研发和产业发展中的作用越来越大。随着我国国家知识产权战略的逐步推进,医药企业实现由仿制向自主创新的模式转变将成为大势所趋。为了能及时有效地保护科研人员的智力成果,申请专利是佳选择。为了帮助广大医药工作者进一步了解医药及生物领域知识产权保护的政策和法律法规,提高发明专利申请文件的质量,了解专利局的审查实践,更好地做好专利申请工作。我刊特邀了国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心相关专家撰写了系列讲座,希望能够对医药企业,科研院所的相关工作人员提供一定的帮助。
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抗肿瘤抗体药物的研究趋势
抗体药物是发展快的生物药物之一,为创新药物市场带来了巨大的利益,其中抗肿瘤抗体药物占主导地位[1]。自1979年第一个治疗癌症的抗体药物利妥昔单抗被美国FDA 批准上市以来,已有17个抗体药物被批准用于癌症治疗,但是其中的吉妥单抗撤出了市场[2-3]。2013年的统计显示,目前处于临床研究的抗体药物大约有350个,其中大部分都处在早期评估阶段[4]。处在 III 期临床研究的治疗性抗体包括28个单抗药物和1个单抗混合物,主要用于癌症、炎症或免疫疾病、高胆固醇、骨质疏松症、阿尔茨海默病和传染病,其中肿瘤治疗抗体10个,非肿瘤治疗抗体19个。还有许多抗体药物处在临床前研究,其研究趋势主要集中在以下几个方面,包括:抗体新靶点的发现与确认,降低抗体免疫原性的新策略,抗体与药物的偶联物,双特异性抗体以及其他新型抗体药物的研究[5-9]。
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抗体药物偶联物研究进展
近年来抗肿瘤抗体药物在基础研发、临床应用等方面都得到了快速发展。但现有抗体药物单独使用抗肿瘤疗效有限,临床上多与化疗药物联合应用,且多数初始接受抗体治疗有效的患者易产生耐药。抗体药物偶联物(antibody drug conjugates,ADCs)在提高抗体药物的治疗效果、克服耐药和充分利用抗体靶向性方面具有独特优势。目前,ADCs 俨然已成为新型抗肿瘤抗体药物研发的重点。本文拟对现有ADCs 研究现状作一简要概述。
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天然免疫分子抗菌肽的作用机制和临床应用
抗生素的发现被认为是医学史上伟大的成就之一,在感染性疾病临床治疗中曾经给患者带来福音。但近年来,随着抗生素在各领域的滥用,细菌耐药已成为全球公共健康领域面临的严峻问题,因此人们一直试图通过新的手段或者可替代的药物来解决抗生素耐药性问题。“天然抗生素”抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)被认为是先天免疫系统中非常重要的一类物质,它的发现与应用将为未来解决此问题提供潜在的可能。到目前为止,多达5000种抗菌肽已经被发现或合成[1]。天然的抗菌肽广泛分布在原核生物(如细菌)和真核生物(如原生动物、真菌、植物、昆虫和其他动物)中。对于动物来说,抗菌肽主要分布在暴露于接触病原体的组织和器官表面上,并且被认为是抵抗细菌、病毒和真菌的先天免疫反应的第一道防线[2-3]。基于以上特性,抗菌肽在医药和农业方面有着广阔的应用前景。本文结合国内外抗菌肽的新研究进展,从抗菌肽的理化性质、抑菌和免疫机制以及临床研究等方面进行论述,为抗菌肽的研发和应用提供理论依据。
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人OX40胞外区基因的克隆、原核表达及单克隆抗体的制备
目的:制备抗人 OX40单克隆抗体,为进一步研究OX40/OX40L 通路以及针对该通路进行疾病干预、疾病治疗和药物筛选奠定基础。方法 PCR扩增人 OX40胞外区的基因序列,将其构建到原核表达载体 pET-32a(+)中,利用大肠杆菌表达系统表达OX40胞外区蛋白,经 Ni 柱纯化后获得目的蛋白。以纯化的 OX40胞外区蛋白为免疫原免疫小鼠,采用常规方法进行细胞融合,通过 ELISA 和多次克隆化培养,筛选出分泌特异性鼠抗人 OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过ELISA、Western blot 和免疫荧光检测抗体的效价及特异性。结果成功构建人 OX40原核表达质粒 pET-32a(+)-OX40,并在 BL21(DE3)中诱导表达,经 SDS-PAGE 和 Western blot 鉴定、Ni 柱纯化、透析后获得 OX40胞外区蛋白;以此纯化蛋白为免疫原,成功制备具有较强亲和力的单克隆抗体。结论克隆表达并纯化了人 OX40蛋白,成功制备针对该蛋白的高亲和力单克隆抗体,为进一步研究 OX40/OX40L的生物学功能奠定了实验基础。
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基于TNF功能表位设计新型人源单链抗体
目的:开发基于 TNF 功能表位的新型人源单链抗体。方法利用自主研制的鼠抗 TNF-α中和单抗 Z12能特异性识别 TNF-α的141~146位功能表位特性,通过理论模拟构建 TNF/抗体 Z12相互作用的复合物模型设计获得功能性拮抗肽(PT2、PT3、PT4、PT7)以及单域抗体 PTVH5(以人抗体可变区重链框架 VH5为支架合理展示 PT2、PT3、PT4),利用计算机辅助分子设计以及同源模建、分子对接方法,进一步合理选择人抗体可变区轻链框架(Vκ1)作为展示支架,通过构象判别、作用能比较以及识别区域确认并选择合适的连接肽设计新型单链分子 ScFv_AB1。结果理论分析发现,ScFv_AB1稳定性较好,识别 TNF-α的141~146功能位点(即 Z12识别的位点)。生物学实验证明, ScFv_AB1能与 TNF-α结合、抑制 TNF-α与TNFR 的结合、抑制 TNF-α介导的细胞毒作用。结论初步验证了“借助计算机模建,基于人抗体可变区的框架结构和拮抗肽设计单链抗体分子”的策略是可行的,从而为人源小分子抗体的制备提供了一条可供选择的途径。
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基于SM 蛋白的CHO细胞分泌工程化改造和抗体表达的研究
目的:通过构建基于 SM 基因的分泌工程化改造的CHO-AV-SM 细胞株,探讨在悬浮培养条件下,过表达转运蛋白 SM 基因对分泌蛋白表达的影响。方法首先从人 HEK293FT 细胞中克隆出 sly1和munc18c 基因,然后构建含有 SM 基因的真核表达载体 pBSM;随后将 pBSM 质粒稳定转染入 CHO-AV 细胞并鉴定,获得了基于 SM 基因的分泌工程化改造的CHO-AV-SM 细胞株;在此基础上对 CHO-AV-SM 细胞株进行悬浮培养适应,并测定了 CHO-AV 和 CHO-AV-SM细胞株的生长和蛋白表达参数。结果过表达转运蛋白 SM 基因,CHO-AV-SM 细胞株的抗体表达量较 CHO-AV 抗体表达量提高约75%,且测得第6天细胞数达到大值,此时 CHO-AV 的表达量约为45.4μg/ml,CHO-AV-SM 的表达量为79.5μg/ml。结论通过构建全抗稳定表达细胞,在细胞中过表达 SM基因,并悬浮培养适应,建立了悬浮培养条件下基于转运蛋白过表达的分泌工程改造方法,为转运蛋白改造 CHO 细胞,提升全抗表达能力提供了有力支持。
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阻断白介素12 p40功能的新型治疗性单克隆抗体的开发
目的:设计并利用抗体工程方法构建并制备全新序列的阻断白介素12(IL-12)p40功能的单克隆抗体 MAB1,并对其生物学活性进行鉴定,以制备可应用于治疗多种自身免疫病的 IL-12通路的阻断剂。方法根据已有的 IL-12 p40蛋白序列,设计、构建并制备了全新的单克隆抗体 MAB1,利用间接 ELISA 测定其与抗原结合的亲和力,并用细胞学方法鉴定它的生物学活性。结果抗体 MAB1与 p40抗原的结合亲和力为0.0399 nmol/L,并能明显抑制 IL-12诱导的人皮肤淋巴细胞相关抗原(CLA)水平上调。其抗原结合能力以及抑制IL-12生物学活性能力与美国强生公司抗体药 Stelara (ustekinumab)相当或更优。结论全新构建的单克隆抗体 MAB1可作为 IL-12通路的高亲和力阻断剂,从而成为自身免疫疾病(例如斑块型银屑病)治疗用新药的临床候选药物。
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双功能抗体药物研究进展
抗体类药物近20年来蓬勃发展,目前全球上市的抗体药物已经有40多个品种,其治疗领域也从传统的癌症、自身免疫性疾病逐步扩展到抗感染和代谢性疾病等。2013年全球10大畅销药物中有6个是抗体类药物,包括3个自身免疫病治疗性药物和3个抗肿瘤抗体。单克隆抗体发展的同时也开启了对新结构、新功能抗体药物的探索,以期进一步优化抗体药物功能活性。抗体糖基化改造(afucosylation)、抗体-药物偶联(antibody drug conjugate, ADC)、双功能抗体(bispecific antibodies,BsAb)等都是当前抗体药物研发的热点领域。单克隆抗体能够特异性结合靶抗原上特定的表位,其优势在于亲和力高、专一性强。但传统抗体仅结合单一靶点的单一表位,因此其疗效受到一定限制。药理学研究揭示,多数复杂疾病都涉及多种与疾病相关的信号通路,例如肿瘤坏死因子 TNF、白介素6等多种促炎症细胞因子同时介导免疫炎性疾病,而肿瘤细胞的增殖往往是由多个生长因子受体的异常上调造成的。单一信号通路的阻断通常疗效有限,而且容易形成耐药性。因此,开发能够同时结合两个不同靶点的双功能抗体及其类似物,长期以来成为新结构抗体研发的重要领域。早期在免疫原性、结构稳定性以及抗体质量控制等方面的不足,限制了双功能抗体的进一步的发展。近年来,上游基因工程抗体和下游生产工艺技术的改进,克服了传统双功能抗体的缺陷,从而推动了多类新型双功能抗体进入临床开发阶段。目前主要在研的双功能抗体从作用机制上可分为双重信号阻断型和抗CD3+T 细胞介导的双功能抗体;从结构上可分为由单链抗体或 Fab 区组成的小型抗体和全抗体;从生产工艺上可分为原核或真核表达、单细胞内表达和双细胞系表达结合体外装配等方式。本文就双功能抗体的新进展进行简要综述。
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抗明胶酶单链抗体与力达霉素融合蛋白抗肿瘤作用机制及疗效研究
目的:探讨抗明胶酶单链抗体 Fv 与力达霉素(LDM)融合蛋白的抗肿瘤作用机制及疗效。方法采用三联径向加压 C4柱制备 LDM 发色团 AE,体外分子重建将其装入融合蛋白 Fv-LDP 中,Superdex 75层析获得 Fv-LDP-AE。反相 HPLC 测定纯度或相对含量。流式细胞术测定 DNA 含量;采用 SA-β-gal 染色、Western blot 和细胞伤口愈合实验分别检测药物对细胞衰老、蛋白表达和迁移的影响;通过动物模型评价药物疗效。结果 Fv-LDP-AE 承袭了 LDM 诱导肿瘤细胞周期阻滞、凋亡和裂亡的作用特点,并显示出更强的诱导衰老和抗迁移作用。Fv-LDP-AE 诱导凋亡和抑制迁移依次与 caspases 通路激活和 MMP-2降调节有关。Fv-LDP-AE 可抑制小鼠和裸鼠移植瘤生长,抑制率分别可达到86.6%和82.5%。结论 Fv-LDP-AE 对小鼠和裸鼠移植瘤有效,可能与其对细胞周期阻滞、凋亡、裂亡和衰老的诱导以及迁移的抑制有关。
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抗CD30抗体药物研究进展
CD30是肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily,TNFRSF)成员之一,属于 I 型跨膜糖蛋白,过表达于霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, HL)和间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphomas, ALCL),低表达于非病理状态下活化的 T 细胞、B 细胞表面,而正常细胞不表达[1]。早期研究表明,CD30参与细胞活化和分化,NF-κB 等信号的传导以及 T 细胞免疫激活等[2]。目前的研究证实 CD30与细胞的增殖和死亡密切相关[3],其胞内部分可与 TNFR 相关因子(TNFR associated factor,TRAF)家族多个成员相互作用,既能通过 JNK 和p38途径介导细胞的凋亡,又能通过 NF-κB 途径介导细胞的活化[4-5]。CD30激活后其胞外部分很快被蛋白酶降解,形成可溶性的 sCD30。正常情况下人体血清中的 sCD30含量很低,但在许多病理状态下,sCD30水平会明显升高,可作为疾病诊断的指标。由于 sCD30在 HL 和 ALCL 患者血清中的含量升高,因此可作为肿瘤标志物[6]。
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基于抗体和配体的肿瘤靶向肽药物研究进展
过去的二十年,肿瘤治疗已经从非特异性的化疗向具有选择性的基于发病机制的疗法转变[1]。分子靶向治疗作为肿瘤治疗的新手段,正以其疗效高、不良反应少且轻等特点而备受瞩目,现已成为肿瘤治疗领域的研究热点。它以肿瘤微环境、肿瘤细胞细胞膜或细胞内特异性表达或高表达的分子为作用靶点,能够更加特异地作用于肿瘤细胞,阻断其恶性增殖、转移或诱导其凋亡,同时降低了对正常细胞的杀伤作用,因此是十分有前途的肿瘤治疗方法之一[2]。
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大容量人源Fab噬菌体展示抗体库的构建及抗CD276抗体筛选
目的:构建大容量人源 Fab 噬菌体库,筛选并鉴定抗CD276的特异性抗体。方法通过采集10位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用 RT-PCR 扩增人 Fab 抗体基因片段,插入噬菌体载体 pCANTAB5H 中,构建人源 Fab 噬菌体抗体库。通过固相化的抗原对抗体库进行3轮筛选后,随机挑取96个单克隆进行 phage-ELISA 鉴定,筛选出与抗原具有较强结合性的噬菌体克隆。结果成功构建库容为5×1010的噬菌体抗体库,从中筛选到11株阳性克隆,对其进行测序鉴定,表明该11株克隆的序列均一致,ELISA 证实其对抗原 CD276具有较强的结合性。结论构建了大容量人源 Fab 抗体库,从中获得具有抗CD276的人源 Fab 抗体片段,为进一步的研究和应用提供实验基础。
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抗体在靶向基因治疗中的应用
基因治疗是将人的正常基因或有疾病治疗作用的基因导入人体靶细胞,从而达到治疗目的的生物医学技术。基因治疗正处于持续发展的阶段,已成为重要的医药产业。综合来说,抗体在基因治疗中主要应用于两方面:①直接将抗体基因导入体内,表达出的蛋白产物作为治疗分子发挥治疗作用[1-2];②作为基因转移系统的靶向成分在基因治疗中发挥作用。本文将重点介绍第二方面的研究进展。
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抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测技术的建立
目的:制备、筛选多株具有商用价值的可配对的高特异性、高亲和力的抗人甲胎蛋白(hAFP)单克隆抗体,初步建立双抗体夹心 ELISA 检测方法。方法通过经典的淋巴细胞杂交瘤技术筛选分泌抗 hAFP单抗的杂交瘤细胞株;对筛选所得单抗的特性进行鉴定分析;双抗体夹心 ELISA 法筛选佳配对抗体;初步建立DAS-ELISA 检测方法并检测血样,绘制其标准检测曲线并与进口试剂盒比较。结果共获得12株稳定分泌抗 hAFP 单抗的杂交瘤细胞株,其中 Ab 1~Ab 55株单抗的腹水效价均高于600万, Ab 5的效价高达3000万;特异性鉴定结果表明 Ab 1~Ab 5均能够特异识别天然 hAFP 分子,但 Ab 5与人血清白蛋白(HSA)存在较强交叉反应;抗体配对实验共筛选出5对(Ab 1/HRP-Ab 2、Ab 1/HRP-Ab 4、Ab 3/HRP-Ab 2、Ab 3/HRP-Ab 4和 Ab 4/HRP-Ab 1)能够满足 hAFP 检测要求且无交叉反应的配对抗体,终确定 Ab 1+ Ab 3/HRP-Ab 2和 Ab 1+Ab 3/HRP-Ab 4为佳配对组合;利用佳配对抗体组合建立标准检测曲线,其线性检测范围为5~250 ng/ml,低检测限2 ng/ml,检测上限400 ng/ml,优于进口试剂盒的线性范围5~200 ng/ml 和低检测限5 ng/ml;样检结果显示自制试剂盒的阳性血清检测准确率99.2%(119/120例),阴性血清准确率100%(40/40例)。结论筛选获得的4株高亲和力、高特异性抗 hAFP 单抗均可应用于 DAS-ELISA 试剂盒的研制,Ab 1和 Ab 3适合作为捕获抗体,Ab 2和 Ab 4适合作检测抗体;自制试剂盒的线性检测范围和低检测限均优于进口试剂盒,表明具有商用价值。
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