人工耳蜗植入者线粒体12S rRNA基因突变的分析

目的 研究接受人工耳蜗植入的耳聋患者中,线粒体12SrRNA基因突变的类型和发生概率.方法 选取100例接受人工耳蜗植入的非综合征性耳聋患者(语前聋96例,语后聋4例;氨基糖苷类药物使用史者16例),取外周血提取基因组DNA,以PCR方法扩增线粒体12S rRNA基因,扩增产物纯化后直接测序分析突变.结果 100例患者中有2例检测到线粒体12S rRNA基因1555AG纯合突变,1例检测到delT961Cn杂合突变,致病基因突变总检出率为3%.结论 在所研究的人工耳蜗植入群体中,线粒体12S rRNA基因突变不是主要的致聋病因.

人细胞色素P450 2D6 4个单核苷酸突变株活性及其与药物相互作用的体外研究

目的 探讨单核苷酸替换对人细胞色素P450 CYP2D6酶活性及其与药物相互作用的影响.方法 体外构建CYP 2D6野生株(WT)和G169R、P34S、E410K、V7M等4个单核苷酸突变株的表达载体并在酿酒酵母中诱导表达,裂解并提取各酶的蛋白微粒体,用蛋白质印迹法验证其表达,再分别测定各酶代谢底物丁夫洛尔和3-[2-(N,N二乙基-N-甲铵)乙基]-7-甲氧基-4-甲基香豆素(AMMC)的米氏常数(Km)和大酶促反应速度(Vmax). 以AMMC为底物对CYP 2D6 WT和V7M、G169R进行高通量药物抑制实验,所选药物包括已知的2D6抑制剂(奎尼丁、舍曲林)、底物(氯丙嗪、氟西汀、阿米替林)和既非抑制剂又非底物的化合物(酮康唑、曲格列酮),求得不同药物对不同酶的半数抑制浓度(IC50).结果 蛋白质印迹法检测显示各酶均表达良好.CYP2D6WT代谢丁呋洛尔和AMMC的Km值分别为19.22、2.06 μmol-L-1,Vmax值分别为154.53、21.60 pmol·min-1·mg-1,Vmax/Km值分别为8.04、11.49山.min-1·mg-1.与CYP2D6WT比较,V7M代谢2种底物的Vmax值均要高得多(P<0.05),G169R和E410K均稍低,而P34S都要低很多(P<0.05);各突变株的Km值也发生了或多或少的改变.药物对CYP2D6 WT和V7M和G169R的抑制程度排序均为奎尼丁>氯丙嗪>氟西汀>阿米替林>舍曲林>酮康唑/曲格列酮;药物对V7M和G169R的IC50值与CYP2D6 WT的IC50值比值,奎尼丁分别为0.88和0.80,氯丙嗪0.54和0.80, 氟西汀0.65和1.02,阿米替林0.85和0.71,舍曲林0.43和0.74.结论 CYP2D6部分单核苷酸突变株的酶动力学特征与野生株有明显差异,单核苷酸替换可导致酶对药物抑制的敏感性发生变化.

IL-12双亚基共表达载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建人IL-12(hIL-12)p40和p35双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞(hMSC).方法 根据hIL-12 p40和p35亚基全长cDNA序列分别设计合成引物行PCR扩增,将扩增所得p40和p35片段采用overlap PCR法拼接,获得的rhIL-12融合基因与pGEM-T Easy质粒连接,将鉴定正确的pGEM-T/rhIL-12重组质粒克隆至pcDNA3.1(+)真核表达质粒中,构建pcDNA3.1(+)/rhIL-12真核表达载体,并进行测序鉴定.将鉴定正确的pcDNA3.1(+)/rhIL-12经脂质体介导转染hMSC,同时以转染pcDNA3.1(+)空质粒作为对照组,在倒置显微镜下观察细胞生长形态;在转染后第4天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达:另分别在转染后第2、4、6、8、10、12、14天,采用ELISA方法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达水平.结果 PCR扩增结果显示特异性扩增出p40(1000 bp)、D35(600 bp)、rhIL-12(1600 bp)片段,均与预期DNA表达片段大小一致.pcDNA3.1(+)/rhIL-12测序显示克隆的rhIL-12基因序列与报告序列完全相同.倒置显微镜下观察,可见转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC生长形态和生长速度与对照组hMSC相比均无明显差异.蛋白质印迹和ELISA检测显示,转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC培养上清液中可见rhIL.12融合蛋白的持续表达:而对照组中均未检测到rhIL-12融合蛋白表达.结论 成功构建了hIL-12 p40和p35双亚基真核共表达载体pcDNA3.1(+)/rhIL-12,为利用hIL-12进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础.

雌激素对孕妇外周血内皮祖细胞动员作用的体外研究

目的 探讨雌激素对孕妇外周血内皮祖细胞(EPC)的动员作用.方法 取孕期为10、20、30周的健康、单胎孕妇外周静脉血,采用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞并进行体外培养.采用免疫荧光细胞化学染色方法进行EPC鉴定,取培养4 d的细胞,加入DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)和FITC标记的荆豆凝集素(UEA-Ⅰ),用激光共聚焦扫描显微镜观察和记录图像.取培养7 d的细胞,在相差显微镜下计数不同孕期孕妇外周血EPC集落(≥50个细胞)形成数(CFU).分别通过跨膜迁移和增殖实验观察雌激素对EPC的动员和促增殖作用,随机选取培养7 d的细胞,分别加入浓度为1×10-10m、1×109、1×10-8mol/L,的雌二醇(雌二醇作用组),在相差显微镜下分别计数培养24 h后EPC的跨膜迁移数和培养48 h后EPC的增殖数,以加入PBS作为对照组,实验均重复3次.结果 免疫荧光细胞化学染色显示,平均85%以上的细胞摄取Dil-acLDL,并结合FITC-UEA-Ⅰ,可以鉴定为EPC.孕期为10、20、30周孕妇外周血EPC的CFU分别为1.67±0.33、4.83±0.60、7.50±0.67,组间差异均有统计学意义(P<0.05).浓度为1×10-10、1×10-9、1×10-8mol/L雌二醇作用组EPC跨膜迁移数(×103个,膜)分别为1.50±0.09、1.61±0.06、1.90±0.07,均明显高于对照组(1.03±0.06,P<0.01);EPC增殖数(×105个)分别为1.07±0.05、1.33±0.05、1.19±0.03,均明显高于对照组(1.00±0.03,P<0.01).结论 孕妇外周血EPC的功能状态可能与雌激素水平有关,雌激素对EPC的动员具有重要作用.

GM-CSF与IL-21基因共转染卵巢癌细胞及其对NK细胞活性的影响

目的 探讨粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与IL-21基因共转染的体外抗肿瘤效应.方法 制备pRSC-GM-CSF-IL21重组质粒,再用脂质体将质粒pRSC-GM-CSF、pRSC-IL21和pRSC-GM-CSF-IL21分别转染人卵巢癌SKOV3细胞(依次命名为SKOV3/GM.CSF、SKOV3/IL21、SKOV3/GM-CSF-IL21细胞).以RT-PCR方法检测GM-CSF与IL-21表达;倒置相差显微镜观察各组细胞形态学变化:噻唑蓝法测定各组细胞增殖活性:流式细胞仪检测各组细胞细胞周期分布,细胞表面HLA-ABC、主要组织相容性复合体Ⅰ类相关基因(MICA/B)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)的表达,以及各组细胞培养上清液对NK细胞活性的影响.以未转染的SK0V3细胞和转染空质粒pRSC的细胞(SKOV3/Neo)为对照.结果 经酶切与测序鉴定,pRSC-GM-CSF-IL21重组体构建正确,共转染SKOV3细胞中有目的基因GM-CSF、IL-21的表达.各组细胞的形态学、增殖特性、细胞周期分布及HLA-ABC表达无明显变化.SKOV3、SKOV3/Neo、SKOV3/GM-CSF、SKOV3/IL21和SKOV3,GM-CSF-IL21细胞的MIC A/B表达量分别为19.24%4±2.31%、31.11%±3.76%、37.27%±3.04%、54.97%±4.77%和63.94%±5.90%:ICAM-1表达量分别为35.88%±3.06%、37.75%±4.09%、68.59%±4.84%、78.53%±5.78%和84.10%±3.98%;加入各组细胞培养上清液后NK细胞活性分别为31.8%±3.6%、42.7%±3.3%、54.7%±7.4%、55.9%±4.4%及63.4%±6.4%.SKOV3/GM-CSF-IL21细胞分别与SKOV3、SKOV31Neo细胞比较,3项指标的差异均有统计学意义(P<0.01).结论 GM-CSF与IL-21基因共转染可上调SKOV3细胞表面MIC A/B与ICAM-1表达,表达产物可增强NK细胞活性,这有助于免疫细胞激活,增强抗肿瘤效应.

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在原发性肝癌组织中的表达及意义

目的 探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)与原发性肝癌发生发展的关系,以及能否作为一个新的肝癌预警分子.方法 肝癌及癌旁组织取自160例术前未经放疗、化疗的原发性肝癌患者的手术切除标本,应用免疫组织化学 SP法检测GPC3在癌及癌旁组织中的表达,分析GPC3表达与患者性别(男性89例,女性71例)、年龄(≤50岁102例,>50岁58例)、血清HBsAg(阳性102例,阴性58例)、甲胎蛋白(<300μg/L 61例,≥300μg/L99例)、肿瘤大小(直径≤5 cm 104例,>5 cm 56例)、肿瘤分化程度(高分化48例,中分化55例,低分化57例)的关系.结果 GPC3表达阳性率肝癌组织为74.4%(119/160),癌旁组织为43.8%(70/160),肝癌组织明显高于癌旁组织(χ2=17.21,P<0.05).GPC3表达与血清HBsAg、肿瘤大小及分化程度有明显相关性.GPC3表达阳性率血清HBsAg阳性者为79.4%(81/102),阴性者为65.5%(38/58,P<0.05);肿瘤直径≤5 cm者为69.2%(72/104),>5 cm者为83/9%(47/56,P<0.05);肿瘤组织高分化者为60.4%(29/48),中分化者为80.0%(44/55),低分化者为80.7%(46157),高分化组织明显低于中低分化组织(P<0.05).结论 GPC3可能在原发性肝癌发生、发展中起重要作用,并有可能成为肝癌的预警分子.

靶向PV株核蛋白基因的小分子干扰RNA对不同狂犬病病毒毒株复制的交叉抑制作用

目的 研究小分子干扰RNA(siRNA)对狂犬病病毒(RV)不同毒株复制的交叉抑制效果.方法 采用体外转录和RNA酶Ⅲ消化长片段双链RNA的方法制备8条以RV的PV株核蛋白(N)基因为靶基因的21nt siRNA,用以转染已经感染了不同滴度PV、CTN或CVS株RV的BSR细胞,采用直接免疫荧光法观察转染的siRNA对已感染BSR细胞的不同毒株RV复制的抑制效果,并分析这种抑制效果与靶基因序列的相关性.结果 不同21nt siRNA均对PV株的复制产生了较强的抑制作用;对CTN株和CVS株的交叉抑制作用观察结果表明,21nt siRNA与靶基因在碱基错配高达5个的情况下仍对病毒复制保持抑制效应.然而,siRNA与靶基因碱基错配的位置与抑制作用的丧失高度相关.3'端第2个碱基的错配将使抑制作用表失,随后的碱基错配对抑制作用的影响依次降低;中部碱基错配影响较小;而5'端碱基错配对抑制作用几乎没有影响.结论 siRNA对靶基因的抑制作用的丧失与其同靶基因序列碱基错配的位置相关,3'端碱基错配可降低其抑制作用的特异性,产生偏靶效应的范围和概率可能增大,这为设计独特的siRNA序列提供了新的思路.

基因工程抗体分泌影响因素研究进展

基因工程抗体(gene engineering antibody,GEAb)是继多克隆血清和单克隆抗体之后的第三代抗体,在许多医学领域都极具应用潜力.众所周知,预防和治疗感染性疾病常用的药物是疫苗和抗生素,但对于如SARS、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等难以获得相应疫苗或疫苗治疗效果不理想的病毒感染,目前仍缺乏有效的治疗方法,而基因工程抗体将有望为这类疾病提供一条有效的治疗途径,具有广阔的临床应用前景.

生长因子微囊化缓释制剂研究进展

生长因子是由多种细胞分泌的通过细胞间信号传递影响细胞活动的一类多功能调节肽,具有调节细胞分裂、增殖、迁移及其基因表达等重要功能[1].

蛋白质和多肽的N端测序技术研究进展

氨基酸序列测定是了解蛋白质性质和功能的重要途径,N端区域又是蛋白质及多肽重要的结构和功能部位,其序列特异性很高,通过N端的少数几个氨基酸残基就可以对大多数蛋白质进行鉴定[1].例如,可以通过对蛋白质和多肽类药物的N端进行人工修饰(如环化修饰、甲基化修饰等),提高其降解稳定性延长药效[2-3].因此N端肽段的鉴定具有非常重要的意义,本文对近年来蛋白质和多肽N端测序技术及方法进行了综述.

大鼠神经干细胞体外培养方法研究进展

长期以来,中枢神经系统疾病一直是困扰人类健康的一大难题.神经干细胞(neural stem cells,NSC)的发现为中枢神经系统损伤性疾病的治疗及其伤后功能重建带来了曙光[1-3].

帕金森病中关键致病因子α突触核蛋白的研究进展

帕金森病(PD)是中老年常见的慢性神经系统变性疾病,患病率和致残率均较高,是危害老年人健康的主要疾病之一.α突触核蛋白(α-Syn)的突变和异常聚集与PD的发生、发展密切相关,但尚未明确其致病机制.α-Syn是可溶性小分子蛋白,主要集中在脑部神经细胞中表达,定位于突触前神经末梢[1].

美伐他汀生物合成基因簇的研究进展

美伐他汀作为第1个被发现的他汀类药物[1],在该类药物的研究开发上占有极其重要的地位.对美伐他汀产生菌的研究可以有效地提高美伐他汀的产量.随着生物技术的发展,采用分子育种技术进行菌株改良,与传统育种方法相比,不仅町提高美伐他汀的产量,更有利于通过对药物合成功能基因的研究,实现由高通量向高内涵筛选的过渡.

如何正确进行生物医学科研设计Ⅲ.如何合理选择两因素设计

编者按生物医学科研的研究对象是生物体,而生物体具有极大的变异性.科研的目的就是要从表面上看似杂乱无章的事物或现象中找出规律性的东西来,以便正确地解释和揭示事物或现象的变化、发展乃至消亡的规律,从而达到认识人类社会并促进其发展、认识自然、改造自然以至于征服自然之目的.

向生物医学期刊投稿的统一要求(续二)

编者按国际医学期刊编辑委员会(ICMJE)制定的<向生物医学期刊投稿的统一要求>(简称"统一要求")是帮助作者完成论文写作和向期刊投稿的指导性文件,在国内外广受作者和编辑的欢迎.为使国内广大作者和期刊编辑及时了解其新版本的内容,本刊将分期转载2007年10月更新的"统一要求"的中文译本.ICMJE并未签署和批准本中文译本的内容."统一要求"的正式文件版本在www.ICMJE.org.

共识声明:有关多能干细胞衍生配子研究对科学、伦理和政策的挑战

编者按2004年,美国约翰霍普金斯伦理学研究中心的"干细胞政策和伦理计划"研究组成员着手开展一项新的计划:建立一个专业的、国际的,跨学科的项目,以应对由于各国对胚胎研究和干细胞研究的政策的多样性引发的国际闻科学合作的伦理和政策挑战.

卫生部陈竺部长贺信

办好行业协会促进我国医药生物技术的进步和发展中国医药生物技术协会第三届理事会工作报告

各位领导、各位理事:本届理事会2002年12月就职,任期即将结束.现在,我代表中国医药生物技术协会第三届理事会,向大会报告工作,对协会今后的工作提出建议,请予审议.

全国人大常委会桑国卫副委员长贺信