中国医药生物技术杂志
Chinese Medicinal Biotechnology 중국의약생물기술
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国医药生物技术协会
- 影响因子： 0.36
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1673-713X
- 国内刊号： 11-5512/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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永生化人肝细胞系的建立和生物学特性研究
目的 建立永生化人肝细胞系 (IHCL),评价其作为制备生物人工肝细胞材料的可行性.方法 利用基因转移技术对原代培养的人肝细胞转染永生化基因猴病毒 40 大 T 抗原和人端粒酶逆转录酶,建立IHCL.以噻唑蓝法测定 IHCL 细胞生长曲线:流式细胞仪分析细胞增殖周期;裸鼠皮肤和肝脏局部接种观察细胞致瘤性;RT-PCR 检测肝细胞相关基因 mRNA 表达;蛋白质印迹法检测肝功能相关蛋白的表达.应用 Cytodex 3微载体培养 IHCL,分析细胞的生长状态和细胞密度.将 IHCL 细胞分别与 5 例重症肝功能衰竭患者的血清共培养,培养前后检测血清中胆红素和尿素氮水平,评价 IHCL 的解毒功能.结果 所建立的 IHCL 具有原代肝细胞的形态,并具有较好的增殖能力,细胞已经传代超过 80 次.IHCL 细胞以 DNA 二倍体整数倍方式增殖,细胞倍增周期为 38 h.裸鼠接种 IHCL 部位均未见肿瘤生长.RT-PCR 检测显示IHCL 细胞表达α1-抗胰蛋白酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶、谷胺酰胺合成酶和谷胱甘肽硫转移酶的 mRNA;蛋白质印迹分析证实 IHCL 细胞表达这 4 种蛋白.IHCL细胞可以在微载体上贴附生长,细胞密度可以达到2.86×106个/ml.将 IHCL 细胞与重症肝功能衰竭患者血清共培养 12、24 和 48 h 后,血清中总胆红素由(346±94)μmol/L分别下降至(330±97)、(315±97)和(295±100)μmol/L,直接胆红素由(243±70)μmol/L,下降至(218±76)、(198±79)和(184±75)μmol/L,,24、48 h与共培养前比较差异均有统计学意义(P＜0.05);而尿素氮进行性地升高,由(6.6±0.9)μmol/L 分别升高至(9.0±0.9)、(9.9±1.1)和(12.5±1.6)μmol/L,3个时间点与共培养前比较差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 所建立的IHCL细胞系具有正常人肝细胞的基本生物学特性和主要的功能特性,具备成为生物人工肝细胞材料的可行性.
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稳定表达膜结合型CD40配体CHO细胞系的建立和鉴定
目的 建立稳定表达膜结合型 CD40 配体 (CD40L) 的CHO 细胞系.方法 将编码膜结合型 CD40L 的重组质粒 pcDNA3.1-fCD40L 用 BgI Ⅱ和 Xho Ⅰ酶进行双酶切鉴定.电穿孔法向 CHO 细胞转染该重组质粒,G418 筛选抗性克隆,有限稀释法获取单克隆阳性细胞后扩大培养,获得 2 个整合了 fCD40L 基因的 CHO 细胞 (CHO-fCD40L) 克隆.用RT-PCR、流式细胞仪分别从 RNA 和蛋白质水平对 2 个CHO-fCD40L 克隆细胞中膜结合型 CD40L 的表达进行检测;ELISA 法检测 2 个 CHO-fCD40L 克隆细胞培养上清液中可溶性 CD40L (sCD40L) 的含量.结果 重组质粒pcDNA3.1-fCD40L 经双酶切和电泳检测到符合预期大小的基因片段.该重组质粒转染 CHO 细胞后经克隆化培养获得 2 个CHO-fCD40L 克隆,分别命名为C10、E11.RT-PCR 检测显示 C10、E11 细胞中有膜结合型 CD40L mRNA 的转录;流式细胞仪检测显示 C10、Ell 细胞表达 CD40L 蛋白达 90% 以上;ELISA 法检测到显示 C10、E11 细胞培养液上清中有 sCD40L 蛋白表达.结论 成功获得稳定表达膜结合型 CD40L 的 CHO 细胞系,为比较膜结合型 CD40L 与 sCD40L 的生物学功能奠定了良好基础.
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冷冻干燥法对人精子DNA的影响
目的 探讨冷冻干燥法用于人类精子保存的安全性.方法 取健康志愿者合格精液 40 份,平均分为 4 组,其中 3 组分别加入不同的冻干保护剂 (ETBS;ETBS+海藻糖;ETBS+海藻糖+蛋黄) 后给予冷冻干燥处理,在 4℃冰箱中保存 3 周;1 组作为新鲜精液对照组.对 4 组标本分别以原位缺口末端标记 (TUNEL) 法和彗星试验进行DNA 断裂精子百分率检测.结果 ETBS、ETBS+海藻糖、ETBS+海藻糖+蛋黄组和新鲜精液组 DNA 断裂精子百分率以 TUNEL 法检测,分别为 (6.39±1.46)%、(5.75±1.29)%、(5.20±1.38)%、(4.94±1.86)%;以彗星试验检测,分别为 (6.48±1.58)%、(5.83±1.48)%、(5.28±1.42)%、(5.12±1.65)%.冷冻干燥保存后的各组与新鲜精液相比较,DNA断裂精子百分率差异均无统计学意义 (P＞0.05).结论 以 ETBS 或 ETBS 加海藻糖、蛋黄为保护剂的冷冻干燥法对人精子 DNA 无明显损伤,可有效地保护人精子的DNA.
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反复冻融对血清HBV DNA定量检测结果的影响
目的 研究反复冻融对血清 HBV DNA 定量检测结果的影响.方法 采集 15 例慢性乙型肝炎患者静脉血,离心后获得血清标本.将各血清标本于-20℃保存 24h,室温解冻 1h,完成第 1 次冻融循环,此后按相同步骤依次进行第2～6 次冻融循环.第 1 次冻融循环前 (第 0 次冻融循环) 和每次冻融循环后均取少量血清,采用荧光实时定量 PCR(FQ-PCR) 技术进行 HBV DNA 定量检测,计算各血清标本每次冻融循环相对于第 O 次冻融循环的 HBV DNA 拷贝数的相对变化量.采用一元线性回归分析方法 分析处理实验数据.结果 15 份血清标本 HBV DNA 定量检测结果 有效范围为5.21×102-3.43×107 拷贝/ml.血清标本 HBV DNA定量检测结果显示,在第 6 次冻融循环的 15 份血清标本中,有 14 份血清标本 HBV DNA 拷贝数与基准水平比较均略有降低;经 6 次冻融循环后,累计有 18.89%(17/90)的血清标本 HBV DNA 拷贝数略高于基准水平,81.11%(73/90) 的血清标本 HBV DNA 拷贝数略低于基准水平;经 2、4、6 次冻融循环后,HBV DNA 拷贝数与基准水平比较升高＞20% 的累计血清标本数 (依次为 1、2、2 份)均分别低于降低＞20% 的累计血清标本数 (依次为 2、4、5 份).一元线性回归分析显示,每次冻融循环后 HBV DNA拷贝数与基准水平比较降低约1.4%.结论 血清冷冻时间＜24h 时,反复冻融后血清标本HBV DNA 定量检测结果可基本保持稳定.
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肿瘤抗原活化T细胞体外模型的建立及其免疫效应研究
目的 建立体外肿瘤抗原活化 T 细胞模型,研究活化后 T细胞的功能特点与分化方向.方法 将肝癌 BEL-7402 细胞与健康人外周血单个核细胞(PBMC) 和协同刺激分子抗 CD3、CD28 单抗共培养 (初次刺激组),或与经肝癌细胞刺激的 PBMC 共培养 (再次刺激组),共培养时间分别为 24、48、72 h.另设靶细胞对照组和 PBMC 对照组.各组实验均设 6 孔.以流式细胞仪分析 PBMC 经肝癌细胞刺激后 CD45RO+T 细胞比例变化;MTT 法检测活化 T 细胞对肝癌细胞的杀伤率:双抗体夹心 ELISA 法检测活化 T 细胞 IFN-γ和 IL-4 分泌水平;流式细胞仪分析 T 细胞表面 Fas 配体表达和 T 细胞受体 (TCR)VB 亚家族表达水平,并比较初次刺激组与再次刺激组 T 细胞免疫效应的差异.结果 健康人 PBMC 在肿瘤抗原和协同刺激分子作用下,CD45RO+T 细胞比例逐渐上升,共培养 72 h 时为 (16.1±0.9)%,明显高于 PBMC 对照组[(2.4±0.3)%,P＜0.05].活化 T 细胞对肝癌细胞的杀伤率随共培养时间的延长而增大[24h为(28.4±6.7)%、48h为(60.4±6.2)%、72h为 (78.0±9.3)%];IFN-γ分泌水平升高,共培养 48h 时为(932±117)ng/L,明显高于 PBMC 对照组[(157±30)ng/L,P＜0.05];T 细胞表面 FasL 表达增加至 (8.1±1.8)%,明显高于 PBMC 对照组[(0.5±0.2)%,P＜0.01];肿瘤抗原刺激后,TCR Vβ的表达水平与 PBMC 对照组相比有所增加.再次刺激组 CD45RO+T 细胞比例、对肝癌细胞的杀伤率、IFN-γ分泌水平及 FasL 表达水平均明显高于初次刺激组.结论 成功建立了体外肿瘤抗原活化 T 细胞模型.活化T细胞具有明显的免疫效应,并向 Th1 和 Tc1 方向分化:再次接触相同抗原时,其免疫效应更为迅速、强烈,表现出一定的记忆特性.
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结核分枝杆菌CFP-10/ESAT-6融合蛋白模拟抗原表位的筛选
目的 探讨噬菌体展示随机肽库技术在结核分枝杆菌培养滤过蛋白 10(CFP-10)/早期分泌抗原靶点 6(ESAT-6)融合蛋白 (CE 融合蛋白) 模拟抗原表位筛选中的应用.方法 以抗 CE 融合蛋白多克隆抗体为靶分子,对随机噬菌体 7 肽库进行筛选,经 3 轮生物淘选后,随机选取 18 个单噬菌体进行测序分析.采用双抗体夹心和竞争 ELISA 方法 对测序后噬菌体进行阳性克隆及其活性鉴定.采用间接ELISA 方法 ,选取阳性单噬菌体与 CE 融合蛋白分别对20 份活动性肺结核患者和 10 份有卡介苗接种史健康人的血清标本抗体进行检测.结果 经过 3 轮生物淘选,能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了明显富集.18 个单噬菌体测序共获得 9 种序列,其中单噬菌体 5、6、18 的氨基酸序列均包含 Trp-Asp-Ala-Thr (WDAT) 保守序列,该序列与 ESAT-6 第 58-61 位氨基酸的序列一致.9 种序列中各取 1 个单噬菌体经双抗体夹心和竞争 ELISA 检测,有 7 个单噬菌体 (1、5、6、10、13、14、18,S/N 值依次为9.2、9.7、9.4、8.9、9.6、9.9、9.0)确定为具有免疫活性的阳性克隆.选取含有 WDAT保守序列的阳性单噬菌体 5 与 CE 融合蛋白分别对 2 种血清标本抗体进行间接 ELISA 检测结果 显示,单噬菌体5 对 2 种血清标本抗体检测的吸光度值均高于 CE 融合蛋白(分别为0.931±0.298 vs 0.317±0.157、0.496±0.073vs 0.118±0.026,均P＜0.05);单噬菌体 5 对活动性肺结核患者血清标本抗体的检出率 (95%,19/20) 明显高于 CE融合蛋白 (60%,12/20),而对有卡介苗接种史健康人血清标本抗体的检出率 (9/10) 低于 CE 融合蛋白 (10/10).结论 利用噬菌体展示随机肽库技术成功筛选出 7 个 CE融合蛋白的模拟抗原表位,并获得了定位于 ESAT-6 第 58～61 位氨基酸序列的 CE 融合蛋白的 1 个线性 B 细胞抗原表位,提高了 ELISA 检测的敏感性,为进一步研究 CE融合蛋白的其他抗原表位及以特异性抗原表位为基础开发结核抗体检测试剂奠定了基础.
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缺氧状态下体外培养成骨细胞血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达及意义
目的 研究缺氧对体外培养成骨细胞血管内皮生长因子(VEGF) 和骨形态发生蛋白 2 (BMP-2)表达的影响及意义.方法 采用酶消化法获取人成骨细胞并进行原代培养,倒置显微镜下观察成骨细胞的生长形态;采用 Gomori 改良钙钴法和免疫组织化学 SABC 法分别检测原代培养成骨细胞碱性磷酸酶 (ALP) 和骨钙素 (OCN) 的表达,进行原代培养成骨细胞鉴定.细胞传至第 2 代时,按继续培养条件的不同将细胞分为缺氧组 (氧分压＜4.8 kPa、氧容积比＜5%)和常氧组,在传代培养 24、48、72h 时分别收集 2 组细胞,采用免疫组织化学 SABC 法检测 VEGF 和 BMP-2的表达,应用图像分析系统进行半定量检测,结果 以平均灰度值表示,平均灰度值低示表达水平高.结果 原代培养成骨细胞可表达 ALP 和 OCN,初步确定经体外培养获得了具有生物活性的成骨细胞.在培养 24、48、72h 时,缺氧组成骨细胞 VEGF 表达水平均明显高于常氧组 (平均灰度值分别为123.53±7.38 vs 141.21±6.03、116.45±6.34 vs 138.37±5.04、108.11±5.37 vs 136.65±6.54,均 P＜0.01),且缺氧组成骨细胞 VEGF 表达水平随缺氧时间延长而逐渐升高.缺氧组成骨细胞 BMP-2 表达水平在培养 24h 时明显高于常氧组 (平均灰度值为143.28±.2.82 vs 146.91±2.06,P＜0.01),而在培养 48、72h 时与常氧组比较,差异均无统计学意义.结论 缺氧可诱导成骨细胞 VEGF 的表达上调;而缺氧延长则不利于成骨细胞 BMP-2 的表达.缺氧对 VEGF 和BMP 的早期表达调控可能与骨修复的启动相关.
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羊种布鲁菌05/43株侵染绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库的构建
目的 构建羊种布鲁菌 05/43 株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA 文库.方法 培养的绵羊肺泡巨噬细胞经羊种布鲁菌 05/43 株侵染后,以 Trizol 试剂提取其总 RNA,用 cDNA 文库构建试剂盒构建巨噬细胞的 cDNA 文库.随机选取 cDNA 文库中的 18 个克隆进行表达序列标签 (EST) 序列测定,测序结果 用 BlastX 和 BlastN 软件在 GenBank 蛋白质库和核酸库中进行序列同源性比对.结果 构建的 cDNA 文库的库容量为1.192×106,重组率为 95.65%.18 个 EST 测序,12 个与 CD 抗原基因、细胞因子基因、蛋白酶基因等已知功能的基因序列相关,6 个为未知功能基因的 EST 序列.结论 成功构建了羊种布鲁菌 05/43 株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的 cDNA 文库,这将有助于阐明该菌株的致病机制.
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成纤维细胞生长因子在皮肤创面组织修复中的应用
皮肤是机体的重要屏障,烧伤后引起的局部或全身损害均与皮肤屏障的丧失有关,尽早修复缺损皮肤,封闭创面,重建皮肤屏障,有利于创面愈合和促进组织修复,大限度地恢复皮肤的防御功能与外观.而目前大面积深度烧伤患者常存在严重的皮源不足,皮肤替代物的性能又较差,因此如何提高植皮成活率,改善皮肤替代物的性能就成为重要的因素.
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长效蛋白药物研究进展
随着生物技术的飞速发展,蛋白质和多肽类药物已成为生物技术新药的主要品种.2006 年,美国药品研究与生产商协会的报告统计[1],有 418 种生物技术新药处于临床研究阶段或 FDA 审批进程中,这些药物能够治疗癌症、传染性疾病、艾滋病在内的 100 多种疾病.
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T细胞过继免疫治疗恶性实体肿瘤研究进展
过继细胞免疫治疗 (adoptive cellular immunotherapy,ACI) 在血液系统疾病的临床应用已获得广泛认可,尤其在目前疫苗免疫治疗还存在着不能有效抑制微小残留肿瘤生长等多种因素而限制了其临床应用的前提下,ACI 在恶性实体肿瘤治疗中的应用研究也引起了人们的普遍关注.
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一种利用微晶纤维素分离纯化β葡糖苷酶的方法
β葡糖苷酶 (EC3.2.1.21) 存在于许多植物、昆虫、酵母、霉菌及细菌体内,它参与生物体的糖代谢,能够水解结合于底物末端的非还原性β-D-葡糖苷键,释放出β-D-葡萄糖和相应的配基[1].在医药工业中,利用β葡糖苷酶的这种生物转化功能,可将某些广泛存在的天然产物转化为在自然界稀有甚至不存在的药物[2].
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如何正确进行生物医学科研设计Ⅰ.科研设计的指导思想与内容
编者按由于生物医学科研的研究对象是生物体,而生物体具有极大的变异性.科研的目的就是要从表面上看似杂乱无章的事物或现象中找出规律性的东西来,以便正确地解释和揭示事物或现象的变化、发展、乃至消亡的规律,从而达到认识人类社会并促进其发展、认识自然、改造自然以至于征服自然之目的.
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加快我国轮状病毒相关产品研发与质控技术平台的建设
轮状病毒 (RV) 是引起儿童重症腹泻主要的病原体,由 RV 引起的腹泻约占秋季腹泻的 50%.全世界每年因 RV 感染可导致 2400 万人次就诊、230 万人次住院和 60 万人死亡.目前对于这种腹泻的治疗除补液以外没有特效治疗药物,因此预防接种疫苗是有效和现实的措施.
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肿瘤的分子分型与分子靶向治疗
疾病的分子分型 (molecular classification) 是通过综合的分子分析技术为疾病分类提供更多的信息,从而使疾病分类的基础从宏观形态学转向以分子特征为基础的新的分类体系 (molecular characteristics-based classification).
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向生物医学期刊投稿的统一要求(待续)(2007年10月更新)
编者按国际医学期刊编辑委员会,(ICMIE) 制定的<向生物医学期刊投稿的统一要求>(简称"统一要求")是帮助作者完成论文写作和向期刊投稿的指导性文件,在国内外广受作者和编辑的欢迎.
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关于转移性实体瘤治疗模式的思考
进入 21 世纪,实体瘤治疗正在发生巨大变化,分子靶向治疗、微创治疗和免疫治疗技术的进步推进了转移性实体瘤治疗策略的演变,以"缓解症状、提高生活质量"为目标的转移性实体瘤传统姑息治疗模式受到挑战.
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奥运年杂志更向前
令人期待的2008年到来了.对国人来说,这是一个充满激情的奥运年,一个体现"更高、更快、更强"奥运精神的幸运年.对于本刊而言,这是一个充满挑战的机遇年,一个体现"更高、更快、更强"奥运精神的发展年.真可谓:08,08,兴旺发达!
